李改娟，劉艷輝，祖岫杰，鞠松柏，王文蘭，陳偉強，劉鐵鋼

(吉林省水產(chǎn)科學研究院，吉林 長春130033)

鯉是中國的主要經(jīng)濟魚類之一，細菌性魚病是鯉養(yǎng)殖的主要限制因素，尤其是細菌出血性敗血病最為嚴重，其主要致病菌為溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌。諾氟沙星［1-2］、恩諾沙星［3-4］、環(huán)丙沙星［5］等喹諾酮類藥物已長期應用于魚類細菌性疾病的防治，由于濫用、亂用藥物現(xiàn)象嚴重，已導致魚類細菌產(chǎn)生耐藥性。培氟沙星(Pefloxacin)是第三代喹諾酮類藥物，由于其分子基本結構中引入了疏水性的氟原子及親水性的吡嗪環(huán)，在體內(nèi)具有良好的組織滲透性，除腦組織和腦液外，在各組織和體液中均有良好的分布，不僅抗菌性能更強、更廣譜(包括革蘭氏陽性菌)，而且使用方便、成本低、治療效果顯著、不良反應少［6］，比早期喹諾酮類藥物的細菌耐藥性有所降低［7］。目前，培氟沙星已廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但尚未見關于該類藥物在魚類體內(nèi)藥動學方面的報道，使用該類藥物治療水生動物的細菌性病時，大多是借鑒獸醫(yī)對哺乳動物的研究成果，造成該類藥物在水產(chǎn)業(yè)疾病防治用藥的盲目性［8］。本研究中，進行了培氟沙星在福瑞鯉Cyprinus carpio 體內(nèi)藥代動力學研究，旨在指導臨床合理用藥，有效控制魚類細菌性疾病。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鯉由九臺水產(chǎn)良種場提供，體質(zhì)量為(200 ±30)g，共300 尾，試驗前一周暫養(yǎng)在水族箱內(nèi)。

試驗試劑:乙腈(色譜純)、KH2PO4、NaOH、HCOOH 均為分析純;甲磺酸培氟沙星標準品由中國獸藥監(jiān)察所提供;培氟沙星原料藥(含甲磺酸培氟沙星不少于98.0%)，由南京農(nóng)牧高科生物技術有限公司提供。

試驗儀器:超高液相色譜儀(Waters ACQUITY UPLC)、離心機(XiangYi L -550)、振蕩器(IKA MS3 digital)、氮吹儀(HGC -24A)、Waters OasisR HLB 固相萃取柱等。

1.2 方法

1.2.1 肌肉注射給藥及樣品的采集 用生理鹽水將甲磺酸培氟沙星配制成所需濃度，按照培氟沙星10 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量給每尾鯉肌肉注射，共注射150 尾，于給藥后0.08、0.25、0.50、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120 h 時間點分別取6 尾魚，自尾靜脈采集血樣，同時將魚處死，取其肌肉、肝胰臟、腎臟等組織，繼續(xù)于168、216、264、312、360、408 h 采集肌肉、肝胰臟、腎臟等組織。將采集的血樣置于含1%肝素離心管中混勻、離心，分離上清液血漿，每個樣品設6 個重復。血漿及各組織樣品于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 混飼口灌給藥［9］及樣品的采集 將培氟沙星溶解后混入飼料中，加水攪拌成糊狀，配制成一定濃度。按照10 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量灌入每尾試驗魚的前腸，共口灌150 尾，無回吐者保留作為試驗魚。于給藥后0.25 h 開始采集血液、肌肉、肝胰臟、腎臟樣品，后期處理同上。

1.2.3 樣品的前處理［10-13］

血漿樣品:量取0.5 mL 血漿，加入5 mL 乙腈，振蕩2 min，以4000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，再加5 mL 乙腈重復上述操作一次，合并上清液，在50 ℃下用氮氣保護濃縮至近干，用流動相溶液定容至1.0 mL，待上機檢測。

肌肉、肝胰臟、腎臟樣品:稱取2.0 g 剪碎的樣品組織于50 mL 塑料離心管中，加入pH 為7.0(肝胰臟、腎臟用pH 為4.5)的PB 液10 mL，振蕩2 min，以4000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，重復上述操作一次，合并上清液，取合并上清液5.0 mL 過柱，將HLB 固相萃取柱預先依次用1 mL甲醇、1 mL 水活化，用1 mL 水淋洗、吹干，最后用1 mL 流動相洗脫，洗脫液過0.22 μm 濾膜后待超高液相色譜分析。

1.2.4 超高液相色譜(UPLC)的測定條件 色譜柱為ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱溫為35 ℃，流速為0.4 mL/min，流動相為0.1%甲酸水溶液與乙腈的混合液(體積比為90∶ 10)，檢測波長為280 nm，進樣體積為3 μL。

1.2.5 線性范圍和最低檢出限 準確稱取含10.0 mg 培氟沙星的甲磺酸培氟沙星標準品，用水定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL 的母液，用流動相稀釋為0.01、0.05、0.10、0.70、2.00、5.00、10.00 μg/mL 的標準使用液，用UPLC 進行測定，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標做標準曲線，分別求出回歸方程、相關系數(shù)。以引起3 倍信噪比(S/N≥3)的藥物濃度為最低檢出限。

1.2.6 回收率與精密度 對空白血漿、肌肉、肝胰臟、腎臟樣品分別進行高、中、低3 組加標試驗，然后按照“1.2.3”節(jié)中的方法進行處理后測定，回收率按下式計算:

上述樣品于1 d 內(nèi)重復測定5次，連續(xù)測定5 d，計算各濃度水平響應值峰面積的變異系數(shù)，以此衡量檢測方法的精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

藥代動力學模型擬合及參數(shù)采用DAS 3.0和SPSS 軟件進行計算。

2 結果

2.1 色譜方法驗證［13］

采用本試驗中的方法，血漿、肌肉、肝胰臟和腎臟中的雜質(zhì)和標樣峰分離良好，標樣譜圖中物質(zhì)色譜峰尖銳且對稱(圖1)。

圖1 標樣譜圖及鯉各組織空白譜圖Fig.1 Chromatogram of pefloxacin standard solution and blank chromatogram in the issues of common carp

培氟沙星標準液在0.01 ～10.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)有良好的相關性，相關系數(shù)R2=0.999。血漿的檢出限為0.01 μg/mL，肌肉、肝胰臟、腎臟的檢出限均為20 μg/kg。各組織中培氟沙星回收率均在70% 以上。日內(nèi)變異系數(shù)為0.13% ～1.95%，日間變異系數(shù)為2.11% ～4.50%。表明該試驗的準確度和精密度均良好。

2.2 培氟沙星在鯉體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)

按10 mg/kg(體質(zhì)量)混飼口灌給藥和肌注給藥后，鯉血漿中培氟沙星的藥動學參數(shù)見表1。

表1 不同給藥方式下培氟沙星在鯉血漿中的藥物代謝動力學參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetics parameters of pefloxacin in plasma of the common carp challenged by different administration

2.3 不同給藥方式下培氟沙星在各組織中的含量

從表2和表3可見:混飼口灌培氟沙星后鯉肌肉中的藥物濃度于24 h 時達到峰值4536.25 μg/kg，之后處于消除階段，直至408 h 時藥物濃度為42.35 μg/kg;鯉肌注給藥后肌肉中的藥物濃度于6 h 時達到峰值5035.28 μg/kg?；祜暱诠嗯喾承呛蟾我扰K中藥物濃度于2 h 時達到峰值11 518.73 μg/kg;肌注給藥比口灌給藥提前達到峰值，其藥物達峰時間為0.50 h，峰值為5456.30 μg/kg。混飼口灌后腎臟中藥物濃度于2 h 時達到峰值13 192.74 μg/kg;肌注給藥后腎臟中藥物濃度于0.50 h 時達到峰值11 137.97 μg/kg。

表2 混飼口灌給藥后培氟沙星在鯉各組織中的含量Tab.2 Mass concentration of pefloxacin in tissues of common carp with oral administration μg/kg

表3 肌肉注射給藥后培氟沙星在鯉各組織中的含量Tab.3 Mass concentration of pefloxacin in tissues of the common carp challenged by intramuscular injection μg/kg

3 討論

3.1 檢測方法

建立可靠的分析方法是進行臨床藥代動力學研究的關鍵之一。目前，有關水產(chǎn)品中培氟沙星的測定標準有農(nóng)業(yè)部1077 號公告-1—2008［14］和GB/T 21312—2007［15］，均采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢出限較低，均為1.0 μg/kg。本試驗中采用超高液相色譜法，檢出限為20 μg/kg，但根據(jù)行業(yè)標準NY 5070—2002［16］水產(chǎn)品中漁藥殘留限量的規(guī)定，環(huán)丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星的殘留限量為50 μg/kg，但沒有明確規(guī)定培氟沙星最高殘留限量，若參照NY 5070—2002 中同類藥物殘留限量的規(guī)定，本試驗中檢出限即可滿足要求。而且線性范圍、回收率、精密度均能達到藥代動力學試驗要求。本試驗中選用UPLC，3 min 即可檢測一個樣品，而使用HPLC 需要15 ～25 min，大大縮短了檢測時間，減少了流動相的浪費，降低了有機溶劑對環(huán)境的污染，保護了操作人員的身體健康。

UPLC 超高的分析速度極大地提高了大批量樣品的分析效率，而消耗時間較長的前處理環(huán)節(jié)成為了整個分析周期的瓶頸，如何盡量縮短樣品前處理時間成為了亟需解決的問題之一［17］。本試驗中，前處理過程操作簡便快捷，利用磷酸二氫鉀水溶液提取，取代了傳統(tǒng)方法中使用的有機溶劑，安全無毒，解決了前處理時間長、雜質(zhì)干擾的問題。本檢測方法的建立，對于此類藥物在魚體中的藥代動力學及其殘留的研究均有一定的實際意義。

3.2 培氟沙星在鯉體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)

從培氟沙星在鯉體內(nèi)的藥動學參數(shù)可以看出，不同給藥方式對其藥動學參數(shù)的影響比較大。培氟沙星混飼口灌給藥后，經(jīng)消化道消化進入血液，達峰時間比肌注給藥晚，達峰濃度較肌注小;而肌注給藥方式下消除半衰期較混飼口灌給藥長，與血漿AUC 較大有關，這與張雅斌等［1］對諾氟沙星在鯉體內(nèi)的藥動學研究時得出的肌注給藥時的t1/2(3.40 h)較混飼口服給藥半衰期(2.02 h)長的結果相一致。李春雨等［4］研究表明，腹腔注射和口灌恩諾沙星后藥物在鯉體內(nèi)的藥動學均符合一級消除二室模型，其血漿AUC 分別為59.185、600.296 μg·h/mL，Cmax分 別 為3.297、3.266 1 μg/mL，t1/2分別為96.545 6、168.287 1 h，表明口灌組血漿吸收要好于腹腔注射組，t1/2要比腹腔注射組時間長。楊雨輝等［5］研究表明，按10 mg/kg 混飼口服乳酸環(huán)丙沙星在鯉體內(nèi)的藥動學參數(shù):AUC 為5.29 mg · h/L，t1/2為 14.47 h，Cmax為 0.70 μg/mL，Tmax為1.10 h。其AUC 明顯小于本研究中混飼口灌給藥時的AUC 值，AUC是衡量藥物在體內(nèi)吸收和分布的主要藥動學參數(shù)，這說明培氟沙星在鯉體內(nèi)的吸收較環(huán)丙沙星好，生物利用度高。本研究中，混飼口灌給藥方式的Vd為5.464 L/kg，小于肌注方式的Vd(15.342 L/kg)，Vd可以反映藥物分布的廣泛程度或與組織中大分子的結合程度。Vd越小，說明藥物排泄越快，在體內(nèi)存留的時間短，而Vd越大，藥物排泄越慢，在體內(nèi)存留的時間越長，正好與半衰期的長短一致。

3.3 肌肉注射和混飼口灌培氟沙星后藥物在鯉體內(nèi)的分布和消除特征

從兩種給藥方式下培氟沙星在魚體不同組織的藥時含量可以看出，培氟沙星在各組織中的濃度均為開始逐漸上升達峰后逐漸下降的變化過程。同時也可以看出，肌肉注射給藥后培氟沙星在鯉體內(nèi)的達峰時間均小于混飼口灌給藥，說明肌肉注射培氟沙星在鯉體內(nèi)的分布速率快于口灌給藥。同種給藥方式下，肝胰臟和腎臟同時達峰，隨后是肌肉，并且達峰時肝胰臟和腎臟組織中的峰濃度大于肌肉中的峰濃度。這可能是由于肝胰臟和腎臟滲透性好且血管豐富，所以藥物首先分布在這些組織中，比在滲透性差、血管貧乏的肌肉中分布得多［18］。培氟沙星在鯉體內(nèi)的分布規(guī)律與梁俊平等［19］報道的恩諾沙星在大菱鲆體內(nèi)的分布特征一致。鯉肌注培氟沙星后的t1/2與梁俊平等［19］報道的大菱鲆肌注恩諾沙星t1/2(68.003 h)相差不多，與張雅斌等［1］報道的鯉肌注諾氟沙星后的t1/2(3.40 h)相差很大。鯉混飼口灌培氟沙星后的t1/2與梁俊平等［19］、張雅斌等［1］和李春雨等［4］報道的鯉口灌恩諾沙星后的t1/2相差均很大。這些差異可能是由于種屬［20］、性別［21］、給藥方式［22］等原因造成的，因此，造成水產(chǎn)動物藥代動力學差異的原因非常復雜，須慎重分析其差異才能制定出合理的給藥方案。

3.4 建議給藥方案

培氟沙星作為第三代喹諾酮類藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上主要作為內(nèi)服藥物混飼投喂。對于特殊的水產(chǎn)動物或特殊病例，可以采用注射或藥浴方法，出于對環(huán)境保護的考慮，不允許在水體中潑灑給藥。內(nèi)服給藥方案的制定，主要依據(jù)藥物的藥效學和在魚體內(nèi)藥代動力學研究結果，以及生產(chǎn)應用效果。

劉艷輝等［23］對淡水魚類細菌出血性敗血病致病菌嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌進行了體外藥效試驗，培氟沙星均具有很好的抗菌活性，培氟沙星對兩種菌的最小抑菌濃度(MIC)均為0.01 μg/mL。本試驗結果表明，以10 mg/kg(體質(zhì)量)的劑量給魚肌肉注射和混飼口服培氟沙星，培氟沙星在魚體中血藥濃度迅速上升，肌注給藥0.5 h 時藥物即達到峰值，口灌給藥4 h 達到峰值。而且藥物在魚體血液中維持有效濃度的時間長，從給藥后0.17 h 到120 h 均在溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的最小抑菌范圍內(nèi)。根據(jù)此試驗結果和養(yǎng)殖生產(chǎn)的具體情況，確定給藥次數(shù)為每日1次，即可防治魚類細菌性出血病、打印病、爛鰓病、腸炎病、赤皮病和白頭白嘴病等?？紤]到藥餌入水的散失和水產(chǎn)動物攝食的不確定性，制定給藥方案時應該加大藥量。培氟沙星用于防治細菌性疾病時，按每日每千克魚體質(zhì)量10 ～20 mg 的劑量，每日給藥2次，連續(xù)混飼投喂5 ～7 d。藥浴或注射，可用于特殊水產(chǎn)動物或特殊需要。藥浴時，濃度為4 mg/L，時間為1 ～2 h;肌注時，劑量為5 mg/kg(體質(zhì)量)，每日注射1次，3 ～5 d 為一療程。

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