饒勝其，徐美玲，高 璐，楊振泉，方維明

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

雞蛋清蛋白酶解肽和大豆蛋白酶解肽的協(xié)同抗氧化活性

饒勝其，徐美玲，高 璐，楊振泉，方維明*

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

分別采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)雞蛋清蛋白和大豆蛋白進(jìn)行單酶和雙酶酶解，篩選得到抗氧化活性較高的雞蛋清蛋白酶解液Ⅰ(A- P)H和大豆蛋白酶解液ⅡPH，并分別對(duì)上述兩種酶解液依次進(jìn)行超濾和樹脂分離，得到高活性的組分ⅠFs和ⅡFs。將酶解液Ⅰ(A-P)H與ⅡPH以及組分ⅠFs和ⅡFs分別進(jìn)行兩兩復(fù)配，通過總還原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基（·OH）抗氧化評(píng)價(jià)體系及Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）分析其 協(xié)同抗氧化能力。結(jié)果表明：酶解液Ⅰ(A-P)H與ⅡPH復(fù)配物對(duì)總還原力的CI總還原力、對(duì)DPPH自由基清除率的CIDPPH自由基和對(duì)·OH清除率的CI·OH分別為0.404、0.827和0.557；相對(duì)應(yīng)樹脂分離組分ⅠFs和ⅡFs復(fù)配物的CI總還原力、CIDPPH自由基和CI·OH分別為0.344、0.383和0.808，相比酶解液的復(fù)配物，其CI總還原力和CIDPPH自由基分別下降了14.85%和53.69%。研究表明：酶解液Ⅰ(A-P)H與ⅡPH以及樹脂分離組分ⅠFs和ⅡFs具有顯著的協(xié)同抗氧化效果，而通過超濾和樹脂粗分離能有效增強(qiáng)酶解液的抗氧化能力及其協(xié)同作用。

雞蛋清蛋白；大豆蛋白；協(xié)同作用；抗氧化活性

動(dòng)植物蛋白、海洋蛋白、廢棄蛋白資源等酶解產(chǎn)生的抗氧化肽因其分子質(zhì)量小、易吸收、活性強(qiáng)、安全性高等特點(diǎn)，能有效地清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑等方面有廣闊的應(yīng)用前景[1]。大豆蛋白和雞蛋蛋白具有較高的生物效價(jià)和營養(yǎng)價(jià)值，水解后制備成的具有生理活性的大豆肽和雞蛋肽的生物效價(jià)和營養(yǎng)價(jià)值也都很高，其中有關(guān)這兩類蛋白來源酶解肽的抗氧化活性研究的報(bào)道也較多[2-3]，近年來受關(guān)注程度呈遞增趨勢(shì)。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)多種功效因子聯(lián)合作用比單一組分具有更好的效果，即呈現(xiàn)協(xié)同作用，這種作用可能源于具有不同作用機(jī)制的功效因子之間存在互補(bǔ)作用或相互修復(fù)作用[4-5]。已有研究證實(shí)，肽與肽之間及肽與非肽類抗氧化成分之間存在協(xié)同作用效果，且這種協(xié)同作用在不同的抗氧化評(píng)價(jià)體系中存在顯著差異[6-7]。

盡管部分抗氧化肽被證實(shí)具有強(qiáng)效的抗氧化活性，但其分離純化過程一般較繁瑣，成本較高。相對(duì)于純肽，蛋白水解母液或粗分離組分從產(chǎn)品開發(fā)方面更具有可行性。因此，如何提高蛋白水解液的生物活性顯得尤為重要。許多研究顯示堿性蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)于蛋白原料中的高活性功能肽的釋放具有顯著效果[8-12]。除了通過蛋白原料與蛋白酶的雙向篩選外，將活性較高的不同酶解液或粗分離組分進(jìn)行復(fù)配以發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，也是提高目標(biāo)產(chǎn)品生物活性較好的一種方式。本研究擬以雞蛋清蛋白和大豆蛋白為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別通過堿性蛋白酶和胃蛋白酶的不同酶解方式進(jìn)行酶解，并將實(shí)驗(yàn)篩選到的具有較高抗氧化活性的大豆蛋白酶解液和雞蛋清蛋白酶解液進(jìn)行兩兩復(fù)配，且將這兩種酶解液的相應(yīng)粗分離組分也進(jìn)行兩兩復(fù)配，通過總還原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基（·OH）3 種抗氧化評(píng)價(jià)體系考察不同蛋白來源的酶解液之間及其相應(yīng)粗分離組分之間的協(xié)同抗氧化效果，為高抗氧化活性蛋白酶解液產(chǎn)品的開發(fā)提供方法學(xué)指導(dǎo)及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雞蛋清蛋白粉（蛋白質(zhì)含量≥78%） 南通康德生物制品有限公司；大豆蛋白粉（蛋白質(zhì)含量≥90%）河南擴(kuò)源化工產(chǎn)品有限公司。

堿性蛋白酶（＞10萬 U/g） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；胃蛋白酶（1 200 U/g） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH 美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA） 生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨、水楊酸、過氧化氫、鐵氰化鉀等均為國產(chǎn)分析純。

Ultra 15超濾離心管 美國Millipore公司；DA201-C大孔樹脂 江蘇蘇青水處理集團(tuán)有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化設(shè)備儀器廠；pico17微量臺(tái)式離心機(jī) 美國Thermo公司；C-MAG HS7加熱磁力攪拌器 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；5804R型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶解液的制備

蛋白酶解參考龐美蓉[13]和侯雅坤[14]等的研究，稍作修改，具體步驟如下：各取4 g雞蛋清蛋白粉和大豆蛋白粉配制成2 g/100 mL的懸濁液，先在95 ℃保溫10 min以變性蛋白質(zhì)，后分別采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行單酶酶解以及采用胃蛋白酶與堿性蛋白酶按照不同順序進(jìn)行分步酶解，反應(yīng)體系為200 mL，酶解條件按表1方式進(jìn)行。待酶反應(yīng)完畢后，95 ℃保溫10 min以終止酶反應(yīng)。整個(gè)酶解過程于酶反應(yīng)器中進(jìn)行，且通過酸堿滴定控制pH值。將所有最終酶解液的pH值調(diào)節(jié)至7.5，并于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液，－20 ℃凍存，以待分析。

表1 單酶及雙酶分步酶解條件Table1 Hydrolysis conditions of single enzymes and step-by-step dual enzymes

1.2.2 強(qiáng)疏水性活性肽的富集

將1.2.1節(jié)中收集到的酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH的離心上清分別裝入截留分子質(zhì)量3 kD的超濾離心管中，于4 ℃、4 000×g進(jìn)行超濾離心，收集濾過液。參考陳飛平等[15]的方法，將DA201-C大孔吸附樹脂先后進(jìn)行無水乙醇洗滌、堿洗滌、酸洗滌和蒸餾水清洗；分別稱取10 g清洗好的樹脂并量取30 mL上述超濾濾過液于150 mL錐形瓶中，在25 ℃、160 r/min條件下振蕩4 h，使樹脂與料液充分接觸，振蕩結(jié)束后取出過濾，再將吸附有活性肽的大孔樹脂置于150 mL錐形瓶中，依次加入體積分?jǐn)?shù)25%、50%和75%的乙醇30 mL進(jìn)行洗脫，收集75%乙醇洗脫液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃條件下將乙醇和水分揮發(fā)除去，最后用5 mL pH 7.5的PBS緩沖液進(jìn)行重懸，－20 ℃凍存，最終分別獲得粗分離組分（強(qiáng)疏水性活性肽）ⅠFs和ⅡFs，以待分析。

1.2.3 抗氧化活性測(cè)定

以總還原能力、DPPH自由基清除能力和·OH清除能力為考核指標(biāo)，評(píng)價(jià)酶解液、粗分離組分、復(fù)配酶解液和復(fù)配分離組分的抗氧化活性?？傔€原能力采用Fe3+還原法[16]測(cè)定，以EC0.5值表示，即總還原能力的A700nm值為0.5時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽質(zhì)量濃度[17]；DPPH自由基清除活性參考Shimada等[18]的方法測(cè)定，以IC50值表示，即清除50% DPPH自由基時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽質(zhì)量濃度[17]；·OH清除活性參考Guo Zhanyong等[19]的方法測(cè)定，以IC50值表示，即清除50% ·OH時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽質(zhì)量濃度[17]。EC0.5值和IC50值的計(jì)算如下：先測(cè)試一系列多肽質(zhì)量濃度樣品的活性值，再利用多肽質(zhì)量濃度和對(duì)應(yīng)活性值作直線圖或曲線圖，根據(jù)所得直線方程或曲線方程求得EC0.5值和IC50值。

1.2.4 聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）分析

采用總還原能力EC0.5值、DPPH自由基清除IC50值和·OH清除IC50值為考核指標(biāo)，通過Chou等[20-21]的中效原理計(jì)算CI值，將大豆蛋白的酶解液（或強(qiáng)疏水活性肽）和蛋清蛋白的酶解液（或強(qiáng)疏水活性肽）按照肽質(zhì)量比1∶1進(jìn)行復(fù)配，以評(píng)價(jià)大豆蛋白的酶解液（或強(qiáng)疏水活性肽）和雞蛋清蛋白的酶解液（或強(qiáng)疏水活性肽）聯(lián)合應(yīng)用的抗氧化效果。

式中：D1和D2是藥物1和藥物2單獨(dú)作用抑制率為50%時(shí)的作用濃度；Dx1和Dx2是藥物1和藥物2聯(lián)合應(yīng)用抑制率為50%時(shí)的作用濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s多重分析進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋清蛋白酶解液和大豆蛋白酶解液的抗氧化活性

2.1.1 總還原能力

圖1 蛋清蛋白酶解液和大豆蛋白酶解液的總還原能力Fig.1 Total reducing power of hydrolysates of egg white proteins and hydrolysates of soybean proteins

還原能力是衡量物質(zhì)抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)，一般兩者之間呈正相關(guān)[12]。定義EC0.5為總還原能力的OD700nm值為0.5時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽質(zhì)量濃度，EC0.5值越小，表明總還原能力越強(qiáng)。由圖1可知，雞蛋清蛋白的4 種酶解液的總還原能力大小順序?yàn)棰?A-P)H＞ⅠAH＞ⅠPH＞Ⅰ(P-A)H，其中，Ⅰ(A-P)H、ⅠAH和ⅠPH的活性相差不大，活性最強(qiáng)的(A-P)H的EC0.5值為8.39 mg/mL；大豆蛋白的4 種酶解液的總還原能力大小順序?yàn)棰騊H＞Ⅱ(P-A)H＞ⅡAH＞Ⅱ(A-P)H，活性最強(qiáng)的ⅡPH的EC0.5值為3.87 mg/mL，其總還原能力稍高于核桃蛋白的堿性蛋白酶解液（EC0.5＞5 mg/mL）[14]。

2.1.2 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基具有單電子，在517 nm波長處有強(qiáng)吸收峰，當(dāng)反應(yīng)體系中存在自由基清除劑時(shí)，能與DPPH自由基單電子配對(duì)而使吸收峰逐漸減弱，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析[18]。半抑制濃度IC50指清除50% DPPH自由基時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽質(zhì)量濃度。IC50值越小，DPPH自由基清除活性就越強(qiáng)。由圖2可知，雞蛋清蛋白的4 種酶解液的DPPH自由基清除活性大小順序?yàn)棰?A-P)H＞ⅠAH＞ⅠPH＞Ⅰ(P-A)H，與相應(yīng)樣品的總還原能力大小順序保持一致，其中，DPPH自由基清除活性最強(qiáng)的Ⅰ(A-P)H的IC50值為2.88 mg/mL；大豆蛋白的4 種酶解液的DPPH自由基清除活性大小順序?yàn)棰騊H＞ⅡAH＞Ⅱ(A-P)H＞Ⅱ(P-A)H，其中，活性最強(qiáng)的ⅡP H的I C50值為1.62 mg/mL，其活性高于豌豆蛋白的雙酶酶解液（IC50=3.01 mg/mL）[22]、扇貝裙邊的復(fù)合蛋白酶酶解液（IC50=2.89 mg/mL）[23]和蠶蛹的堿性蛋白酶解液（IC50=4.24 mg/mL）[24]，結(jié)果表明Ⅰ(A-P)H和ⅡPH具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性。

圖2 蛋清蛋白酶解液和大豆蛋白酶解液的DPPH自由基清除活性Fig.2 DPPH scavenging activities of hydrolysates of egg white proteins and hydrolysates of soybean proteins

2.1.3 ·OH清除活性

·OH能與許多的有機(jī)物，特別是芳香族化合物（如水楊酸等）發(fā)生羥化反應(yīng)，通過測(cè)定羥化產(chǎn)物的量，可以間接測(cè)定·OH的含量，從而可以用來測(cè)定抗氧化劑清除·OH的能力[19]。半清除濃度IC50指·OH清除50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的肽質(zhì)量濃度，IC50值越小，表明·OH清除活性越大。由圖3可知，雞蛋清蛋白的4 種酶解液的·OH清除活性大小順序?yàn)棰馪H、Ⅰ(A-P)H＞ⅠAH＞Ⅰ(P-A)H，其中，活性最強(qiáng)的PH和(A-P)H的IC50分別為1.69 mg/mL和1.85 mg/mL；大豆蛋白的4 種酶解液的·OH清除活性大小順序?yàn)棰駻H＞Ⅱ(A-P)H、Ⅱ(P-A)H＞ⅡPH，其中，ⅡAH、Ⅱ(A-P)H和Ⅱ(P-A)H的IC50值均在2.90～3.52 mg/mL之間。其中，活性最強(qiáng)的酶解液ⅠPH、Ⅰ(A-P)H和ⅡAH的·OH清除活性均高于蠶蛹的堿性蛋白酶解液（IC50=4.51 mg/mL）[24]。

圖3 蛋清蛋白酶解液和大豆蛋白酶解液的·OH清除活性Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activities of hydrolysates of egg white proteins and hydrolysates of soybean proteins

綜合圖1～3可知，雞蛋清蛋白的4 種酶解液和大豆蛋白的4 種酶解液的總還原能力、DPPH自由基清除活性和·OH清除活性均沒有呈現(xiàn)嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，因?yàn)檫@3 種抗氧化指標(biāo)的測(cè)定原理不同，所反映的抗氧化活性與酶解液中的肽段組成具有重要關(guān)系。盡管如此，在雞蛋清蛋白的4 種酶解液中，酶解液Ⅰ(A-P)H的總還原能力和DPPH自由基清除活性最強(qiáng)，而·OH清除活性與酶解液ⅠPH相近，無顯著差異（P＜0.05），結(jié)果表明，酶解液Ⅰ(A-P)H的抗氧化綜合能力高于其他3 種酶解液；在大豆分離蛋白的4 種酶解液中，盡管酶解液ⅡPH的·OH清除活性比其他3 種酶解液低，但其總還原能力和DPPH自由基清除活性顯著高于其他3 種酶解液。據(jù)此，選擇抗氧化活性較高的酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH進(jìn)行下一步高活性抗氧化肽的富集。

2.2 酶解液的協(xié)同抗氧化活性

圖4 單一酶解液和復(fù)配酶解液的總還原能力（A）、DPPH自由基清除活性（B）和B·OH清除活性（C）CFig.4 Total reducing power (A), DPPH scavenging activity (B) and hydroxyl radical scavenging activity (C) of single and combined enzymatic hydrolysates

將酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH按照多肽質(zhì)量濃度1∶1進(jìn)行復(fù)配，得到復(fù)合酶解液，測(cè)定復(fù)合酶解液的總還原力EC0.5值、DPPH自由基和·OH清除IC50值。由圖4A可知，復(fù)配物的總還原能力明顯高于單一酶解液；由圖4B可知，復(fù)配物的DPPH自由基清除活性與ⅡPH相當(dāng)；由圖4C可知，復(fù)配物的·OH清除活性與Ⅰ(A-P)H相當(dāng)。復(fù)配之后的復(fù)合酶解液的總還原力EC0.5、DPPH自由基清除IC50及·OH清除IC50值分別為2.14、1.71 mg/mL和1.64 mg/mL，抗氧化活性總體上強(qiáng)于單一酶解液。

表2 復(fù)配酶解液各抗氧化指標(biāo)的CII指數(shù)Table2 CI indexes for antioxidant properties of combined enzymatic hydrolysates

由表2可知，Ⅰ(A-P)H和ⅡPH聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，復(fù)合酶解液對(duì)總還原能力、DPPH自由基清除能力和·OH清除能力的CI值均小于1，說明它們之間的抗氧化作用存在協(xié)同效果。CI值越小，協(xié)同作用越強(qiáng)。在3 個(gè)評(píng)價(jià)的抗氧化指標(biāo)中，協(xié)同能力大小順序?yàn)榭傔€原能力＞·OH清除活性＞DPPH自由基清除活性。根據(jù)Soriano等[25]的判斷方法，0.9≤CI≤1.1為疊加作用，0.8≤CI＜0.9為低度協(xié)同作用，0.6≤CI＜0.8為中度協(xié)同作用，0.4≤CI＜0.6為高度協(xié)同作用，0.2≤CI＜0.4為強(qiáng)協(xié)同作用。據(jù)此，復(fù)配物的總還原能力與對(duì)·OH清除能力為 高度協(xié)同作用，而對(duì)DPPH自由基清除能力為低度協(xié)同作用。研究結(jié)果表明，酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH對(duì)總還原能力、·OH清除活性和DPPH自由基清除活性的協(xié)同能力具有顯著差異。

2.3 酶解液粗分離組分的抗氧化活性及其協(xié)同效應(yīng)

大量研究顯示，抗氧化肽的生理活性與特定類型的氨基酸、氨基酸的種類、序列、構(gòu)型和分子質(zhì)量等都有著密切的關(guān)系[26]。相對(duì)于酶解原液，分子質(zhì)量小于3 kD的小肽具有更強(qiáng)的總還原能力、DPPH自由基和·OH的清除能力，即抗氧化活性更強(qiáng)[27-28]。眾多的研究也顯示，疏水性強(qiáng)的肽段一般都具有較強(qiáng)的抗氧化活性[22]。因此，采用超濾和大孔吸附樹脂分離技術(shù)手段理論上能對(duì)酶解液中的高活性功能肽起到很好的富集作用。

圖5 單一分離組分和復(fù)配分離組分的總還原能力（A）、DPPH自由基清除活性（B）和·OH清除活性（C）Fig.5 Total reducing power (A), DPPH scavenging activity (B) and hydroxyl radical scavenging activity (C) of single and combined fractions

本研究依次采用超濾和DA201-C大孔樹脂分別對(duì)酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH中活性較高的抗氧化肽進(jìn)行了富集，結(jié)果如圖5所示，樹脂分離組分ⅠFs的總還原能力EC0.5值、DPPH自由基清除IC50值和·OH清除IC50值分別為1.53、0.93 mg/mL和0.072 mg/mL，相應(yīng)活性分別為酶解液Ⅰ(A-P)H的5.48、3.09 倍和26.41 倍。樹脂分離組分ⅡFs總還原能力EC0.5值、DPPH自由基清除IC50值和清除·OH清除IC50值分別為0.92、0.84 mg/mL和0.057 mg/mL，相應(yīng)活性分別為酶解液ⅡPH的4.23、1.92 倍和122 倍。以上數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過超濾與樹脂純化后，酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH的抗氧化活性得到顯著增強(qiáng)，其中·OH清除活性的增強(qiáng)幅度非常明顯，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

樹脂分離組分ⅠFs與ⅡFs按照多肽質(zhì)量比1∶1復(fù)配后，總還原能力EC0.5值、DPPH自由基清除IC50值和·OH清除IC50值分別為0.39、0.34 mg/mL和0.052 mg/mL，相對(duì)于單一的樹脂分離組分其活性均得到有效提高，其中復(fù)配物的總還原能力和DPPH自由基清除活性增強(qiáng)尤其明顯，相對(duì)于ⅠFs分別提高了2.92 倍和1.74 倍。研究表明，經(jīng)過復(fù)配后，受試樣品的抗氧化能力得到進(jìn)一步提高。

表3 復(fù)配分離組分的各抗氧化指標(biāo)的CI指數(shù)Table3 CI indexes for antioxidant properties of combined fractions

由表3可知，DA201-C大孔樹脂純化后，ⅠFs和ⅡFs聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其總還原能力、對(duì)DPPH自由基和對(duì)·OH清除能力的CI值均小于1，表明它們之間的抗氧化活性存在協(xié)同效應(yīng)。并且根據(jù)Soriano等[25]的判斷方法可知，復(fù)配物的CI總還原能力值和CIDPPH自由基值在0.2～0.4之間，表明純化后的復(fù)配物有強(qiáng)協(xié)同作用，而CI·OH值在0.8～0.9之間，為低度協(xié)同作用。對(duì)比表2和表3可知，相比酶解液的復(fù)配物，樹脂分離組分的CI總還原能力值和CIDPPH自由基值分別下降了14.85%和53.69%，表明通過超濾和樹脂粗分離有效增強(qiáng)了酶解液的協(xié)同抗氧化能力。

3 結(jié) 論

分別采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)雞蛋清蛋白和大豆蛋白進(jìn)行單酶和有次序的雙酶酶解，研究發(fā)現(xiàn)在雞蛋清蛋白的酶解液中，其堿性蛋白酶和胃蛋白酶酶解液Ⅰ(A-P)H具有較強(qiáng)的抗氧化活性，而在大豆蛋白的酶解液中，其胃蛋白酶酶解液ⅡPH具有較強(qiáng)的抗氧化活性。超濾和大孔樹脂純化有效增強(qiáng)了酶解液的抗氧化能力。將酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH以及相應(yīng)粗分離組分ⅠFs和ⅡFs分別進(jìn)行兩兩復(fù)配，所得復(fù)配物的抗氧化活性均高于單一酶解液或單一粗分離組分，結(jié)合聯(lián)合指數(shù)CI值分析，結(jié)果表明酶解液Ⅰ(A-P)H和ⅡPH以及相應(yīng)粗分離組分ⅠFs和ⅡFs具有協(xié)同抗氧化效果。同時(shí)研究表明超濾和大孔樹脂粗分離顯著增強(qiáng)了雞蛋清蛋白酶解肽和大豆蛋白酶解肽的協(xié)同抗氧化能力。該研究將為雞蛋清蛋白酶解肽和大豆蛋白酶解肽的聯(lián)合應(yīng)用提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。

[1] POWER O, JAKEMAN P, FITZGERALD R J. Antioxidative pe ptides enzyma tic production, in vitro and in vivo antioxidant activity and potential applications of milk-derived antioxidative peptides[J]. Amino Acids, 2013, 44(3): 797-820.

[2] 王俊杰, 趙燕, 涂勇剛, 等. 蛋源性抗氧化肽研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(2): 358-363.

[3] 李文, 陳復(fù)生, 丁長河, 等. 大豆肽生理功能的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(4): 360-367.

[4] DAI F, CHEN W F, ZHOU B. Antioxidant synergism of green teapolyphenols with α-tocopherol and L-ascorbic acid in SDS micelles[J]. Biochimie, 2008, 90(10): 1499- 1505.

[5] ROMANO S C, ABADI K, REPETTO V, et al. Synergistic antioxidant and antibacterial activity of rosemary plus butylated derivatives[J]. Food Chemistry, 2009, 115(2): 456-461.

[6] SAITO K, JIN D H, OGAWA T, et al. Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial chemistry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(12): 3668-3674.

[7] 胡曉赟. 小肽抗氧化性及協(xié)同作用研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2012: 32.

[8] 謝寧寧, 陳小娥, 方旭波, 等. 水產(chǎn)抗氧化肽研究進(jìn)展[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2010, 29(1): 74-80.

[9] 馬賽蕊, 胡曉, 吳燕燕, 等. 羅非魚肉蛋白酶解液的抗氧化活性[J].食品 科學(xué), 2012, 33(19): 52-56.

[10] 豆康寧, 石曉, 王飛. 大豆蛋白水解度與大豆肽抗氧化力關(guān)系研究[J].油料蛋白, 2013, 38(10): 20-22.

[11] POPOVIC L, PERICIN D, VASTAG Z, et al. Antioxidative and functional properties of pumpkin oil cake globulin hydrolysates[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 2013, 90(8): 1157-1165.

[12] AHN C B, KIM J G, JE J Y. Purification and antioxidant properties of octapeptide from salmon byproduct protein hydrolysate by gastrointestinal digestion[J]. Food Chemistry, 2014, 147: 78-8 3.

[13] 龐美蓉, 丁秀臻, 孔祥珍, 等. 胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(7): 103-107.

[14] 侯雅坤, 王晟, 黃昆, 等. 核桃蛋白酶解工藝優(yōu)化與酶解液抗氧化活性分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 43(4): 99-103.

[15] 陳飛平, 周家華, 曾凡坤, 等. 莧籽ACE抑制肽的大孔樹脂分離純化[J].食品工業(yè)科技, 2013, 35(11): 271-276.

[16] OYAIZU M. Studies on products of browning reactions: antioxidative activities of browning products of browning r eaction prepared from glucosamine[J]. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44: 307-315.

[17] CHURCH F C, SWAISGOOD H E, PORTER H D, et al. Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J]. Journal of Dairy Science, 1983, 66(6): 1219-1227.

[18] SHIMADA K, FUJIKAWA K, YAHARA K, et al. Antioxidative properties of xanthium on the autoxidation o f soybean oil in cyclodextrin emulsion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40(6): 945-948.

[19] GUO Zhanyong, LIU Hongying, CHEN Xiaolin, et al. Hydroxyl radicals scavenging activity of N-substituted chitosan and quaternized chitosan[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2006, 16(24): 6348-6350.

[20] CHOU T C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method[J]. Cancer Research, 2010, 70(2): 440-446.

[21] CHOU T C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J]. Pharmacological Reviews, 20 06, 58(3): 621-681.

[22] 張秋萍, 田亞平. 雙酶法酶解豌豆蛋白制備高抗氧化多肽的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(4): 519-524.

[23] 任佰萍, 張銘振, 孔繁東, 等. 扇貝裙邊抗氧化肽酶解液的體內(nèi)體外抗氧化性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(8): 290-294.

[24] 盧楠, 廖鮮艷, 翁新楚, 等. 蠶蛹抗氧化肽的制備及其體外抗氧化活性評(píng)價(jià)[J]. 上海大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2013, 19(2): 215-220.

[25] SORIANO A F, HELFRICH B, CHAN D C, et al. Synergistic effects of new chemopreventive agents and conventional cytotoxic agents against human lung cancer cell lines[J]. Cancer Research, 1999, 59(24): 6178-6184.

[26] 張暉, 唐文婷, 王立. 抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 32(7): 673-679.

[27] 謝正軍, 金征宇, 徐學(xué)明, 等. 苜蓿葉蛋白及其酶解物抗氧化活性的比較[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2009, 28(5): 627-632.

[28] 張敏, 周梅. 不同分子質(zhì)量米糠多肽的抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(3): 1-6.

Synergistic Antioxidant Activities of Peptides Derived from Egg White Proteins and Soybean Proteins by Enzymatic Hydrolysis

RAO Sheng-qi, XU Mei-ling, GAO Lu, YANG Zhen-quan, FANG Wei-ming*
(School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

Egg white proteins and soybean proteins were hydrolyzed by alcalase and/or pepsin, and the hydrolysate Ⅰ(A-P) H from egg white proteins and Ⅱ PH from soybean proteins with higher antioxidant activities were obtained. Ultrafiltration and resin separation of these two hydrolysates were carried out, respectively, and the fraction ⅠFs from Ⅰ(A-P)H and ⅡFs fromⅡPH with stronger activities were obtained. The hydrolysates Ⅰ(A-P)H and ⅡPH as well as the fractions ⅠFs and ⅡFs were combined, and the synergistic antioxidant effect of the mixtures was analyzed through three antioxidant evaluation systems including total reduce power, DPPH radical and hydroxyl radical scavenging activities as well as Chou-Talalay combination index (CI). The results showed that CIreducingpower, CIDPPHradicaland CIOHvalues of the mixture of Ⅰ(A-P)H and ⅡPH were 0.404, 0.827 and 0.557, respectively. Moreover, CIreducingpower, CIDPPHradicaland CIOHvalues of the mixture of fractions ⅠFs andⅡFs were 0.344, 0.383 and 0.808, respectively. Compared with the combined enzymatic hydrolysates, the CIreducingpowerand CIDPPHradicalof the mixture of their fractions were reduced by 14.85% and 53.69%, respectively. The results demonstrated that the hydrolysates Ⅰ(A-P)H and ⅡPH as well as the fractions ⅠFs and ⅡFs possess remarkable synergistic antioxidant effects, and ultrafiltration and resin separation can effectively enhance antioxidant abilities of the hydrolysates and their synergistic effects.

egg white protein; soybean protein; synergistic effect; antioxidant activity

TS262.5

A

1002-6630（2014）23-0108-06

10.7506/spkx1002-6630-201423022

2014-06-30

江蘇省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20140479）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（12KJD550007）；2013年度揚(yáng)州大學(xué)科技創(chuàng)新培育基金資助項(xiàng)目（2013CXJ084）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

饒勝其（1981—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及食品資源綜合利用。E-mail：sqrao@yzu.edu.cn

*通信作者：方維明（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工及食品生物技術(shù)。E-mail：wmfang@yzu.edu.cn