李鴻泓，于 崢，趙宏艷，易小烈，潘靜華，劉 紅，李 艷，王少君， 陳 曦，湯爾群，張立石，李岳澤，張方珍，鞠大宏△，劉梅潔△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；2.石景山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院， 北京 100041； 3.黔西縣中心醫(yī)院，江西 黔西 551500)

“脾腎相關(guān)”理論是中醫(yī)學(xué)的重要理論之一，是中醫(yī)認(rèn)識(shí)疾病、診治疾病的重要思維方法，該理論在骨質(zhì)疏松癥的防治過程中發(fā)揮著重要指導(dǎo)作用。既往課題組在建立骨質(zhì)疏松癥脾腎兩虛型病證結(jié)合動(dòng)物模型[1]的基礎(chǔ)上，探討了補(bǔ)腎健脾方對(duì)大鼠脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥的治療作用[2]。此次，本研究將對(duì)補(bǔ)腎健脾方的作用機(jī)理作進(jìn)一步的深入探討，以期為闡明“脾腎相關(guān)”的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用健康雌性SPF級(jí)Wistar大鼠 86只，體質(zhì)量200～220 g，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(許可證編號(hào)SCXK(京)2009-0017)，在中日友好醫(yī)院臨床研究所動(dòng)物室屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號(hào)：SYXK(京)2010-0011)。

1.2 藥物

己烯雌酚由合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20100120)，規(guī)格：每片1 mg，使用時(shí)用蒸餾水制成濃度為0.0046 mg/mL的混懸液，給藥體積為1 mL/100 g體質(zhì)量，給藥劑量為0.046 mg/kg體質(zhì)量。健脾方藥采用四君子湯：人參9 g，茯苓9 g，白術(shù)9 g，甘草6 g，常規(guī)水煎制，含量為3.04 g生藥/kg，給藥濃度為0.304 g/ml。補(bǔ)腎方藥采用龜鹿二仙湯：龜板膠9 g，鹿角膠6 g，人參9 g，枸杞9 g。常規(guī)水煎制含量為3.04 g生藥/kg，給藥濃度為0.304 g/ml。補(bǔ)腎健脾方藥采用龜鹿二仙湯合四君子湯：龜板膠9 g，鹿角膠6 g，人參9 g，枸杞9 g，茯苓9 g，白術(shù)9 g，甘草6 g。常規(guī)水煎制，含量為5.26 g生藥/kg，給藥濃度為0.526 g/ml。大黃水煎液：川大黃水煎制，濃縮至200%。

1.3 試劑

戊巴比妥鈉由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)(批號(hào)20090305)，大鼠VIP ELISA試劑盒：美國(guó)MBS公司(批號(hào)W09083651)，大鼠GAS ELISA試劑盒：美國(guó)MBS公司(批號(hào)W09083650)，大鼠MTL ELISA試劑盒：美國(guó)MBS公司(批號(hào)W15083696)，大鼠RANKL ELISA試劑盒：美國(guó)R&B公司(批號(hào)07081103)，大鼠OPG ELISA試劑盒：美國(guó)R&B公司(批號(hào)07081102)。

1.4 儀器

Wellwash 4 Mk2洗板機(jī)：美國(guó)Thermo公司，Multiskan Mk3酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司， TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，Osteocore3 Digital 2D 骨密度儀(雙能X線)：法國(guó)Medilink公司，-80℃低溫冰箱：美國(guó) Thermo公司。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物分組、模型制作及處理 選用健康雌性Wistar大鼠86只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組12只、假手術(shù)組12只、造模62只3組。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，造模組大鼠制作脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥模型[1]。假手術(shù)組大鼠只切除小塊脂肪組織，不摘除卵巢。造模完成后，將造模組大鼠隨機(jī)分成脾腎兩虛模型組、己烯雌酚組、補(bǔ)腎組、健脾組及補(bǔ)腎健脾組。除脾腎兩虛模型組大鼠外，其余大鼠分別給予己烯雌酚、龜鹿二仙湯、四君子湯及兩者的合方，每日1次，連續(xù)6 d，休息1 d，再連續(xù)給藥6 d，每周稱重1次，據(jù)此調(diào)整給藥量。同時(shí)，脾腎兩虛模型組大鼠給予200%的大黃水煎液灌胃，每周2次，如此給藥3個(gè)月?？瞻讓?duì)照組、假手術(shù)組按同法灌服等體積蒸餾水。給藥結(jié)束后，采用大鼠麻醉后股動(dòng)脈取血法，所取全血靜置1 h后，經(jīng)2000 rmp離心10 min后取血清；取血后將各組大鼠處死取出左側(cè)股骨，剔除骨骼表面附著的軟組織，用生理鹽水浸濕的紗布包裹，放于-80℃冰箱保存待測(cè)，用于骨密度(BMD)檢測(cè)。

1.5.2 指標(biāo)檢測(cè) BMD檢測(cè)：檢測(cè)前取出冰箱中凍存的大鼠股骨室溫下復(fù)溫。采用Osteocore3 Digital 2D 骨密度儀檢測(cè)各組大鼠股骨的骨密度。

血管活性腸肽(VIP)、胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(GAS)、骨保護(hù)素(OPG)、細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基(RANKL)含量的測(cè)定：檢測(cè)前取出凍存的大鼠血清在室溫下復(fù)溫。采用ELISA法，按照試劑盒所附說明書檢測(cè)大鼠外周血血清中VIP、MTL、GAS、OPG、RANKL的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎健脾方對(duì)脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠股骨BMD的影響

表1顯示，與假手術(shù)組比較，脾腎兩虛模型組大鼠股骨BMD顯著降低。與脾腎兩虛模型組比較，補(bǔ)腎組、健脾組、補(bǔ)腎健脾組、己烯雌酚組大鼠股骨BMD均顯著增高，但仍顯著低于假手術(shù)組。與健脾組比較，補(bǔ)腎組及補(bǔ)腎健脾組的BMD均明顯增高，且兩者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 補(bǔ)腎健脾方對(duì)脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠外周血血清中OPG及RANKL含量的影響

表2顯示，脾腎兩虛模型組OPG含量較之假手術(shù)組顯著降低。與脾腎兩虛模型組比較，健脾組OPG含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而己烯雌酚組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎健脾組OPG含量均顯著增高，但仍顯著低于假手術(shù)組。與健脾組比較，補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎健脾組OPG含量均明顯增高，且補(bǔ)腎健脾組明顯高于補(bǔ)腎組。

表1 各組大鼠股骨BMD的變化

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與脾腎兩虛模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01；與健脾組比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01；與補(bǔ)腎組比較：P<0.05，P<0.01(下同)

與假手術(shù)組比較，脾腎兩虛模型組大鼠外周血血清中RANKL含量顯著增高。與脾腎兩虛模型組比較，己烯雌酚組、健脾組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎健脾組RANKL含量均顯著降低，但較之假手術(shù)組仍顯著增高。與健脾組比較，補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎健脾組RANKL含量均顯著降低，且補(bǔ)腎健脾組明顯低于補(bǔ)腎組。

表2 各組大鼠外周血血清中OPG及RANKL含量

2.3 補(bǔ)腎健脾方對(duì)脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠外周血血清中VIP含量的影響

表3顯示，與假手術(shù)組比較，脾腎兩虛模型組大鼠外周血血清中VIP含量顯著增高。從各治療組VIP含量來看，除己烯雌酚組外，健脾組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎健脾組VIP含量均顯著低于脾腎兩虛模型組，但健脾組和補(bǔ)腎組仍明顯高于假手術(shù)組，而補(bǔ)腎健脾組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與補(bǔ)腎組比較，健脾組和補(bǔ)腎健脾組VIP含量明顯降低，且兩者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠外周血血清中VIP含量

2.4 補(bǔ)腎健脾方對(duì)脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠外周血血清中MTL、GAS含量的影響

表4顯示，脾腎兩虛模型組大鼠外周血血清中MTL、GAS含量較之假手術(shù)組顯著降低。與脾腎兩虛模型組比較，健脾組和補(bǔ)腎健脾組MTL、GAS含量均顯著增高，但己烯雌酚組和補(bǔ)腎組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。健脾組和補(bǔ)腎健脾組MTL含量均顯著高于補(bǔ)腎組，補(bǔ)腎健脾組GAS含量明顯高于健脾組和補(bǔ)腎組。

表4 各組大鼠外周血血清中MTL及GAS含量

3 討論

1988年鄧鐵濤在“略論五臟相關(guān)取代五行學(xué)說”的文章中明確提出“五臟相關(guān)學(xué)說”的概念[3]，而脾腎相關(guān)理論正是其提出的“五臟相關(guān)學(xué)說”的一個(gè)重要子系統(tǒng)。具體到骨質(zhì)疏松癥(OP)這一常見病、多發(fā)病來說，脾腎相關(guān)理論在其防治過程中也發(fā)揮著重要指導(dǎo)作用。《素問·五臟生成》曰：“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也?！惫堑纳L(zhǎng)、發(fā)育不僅直接取決于腎，還受到后天脾胃功能的影響。近年來，一些醫(yī)家在補(bǔ)腎健脾這一治則的指導(dǎo)下，采用補(bǔ)腎健脾方藥治療骨質(zhì)疏松癥，普遍取得了較好的療效[4]。如王照康[5]自擬補(bǔ)腎健脾密骨方，對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者疼痛及相關(guān)生化指標(biāo)具有明顯的改善作用。王惠禮[6]等觀察了具有調(diào)補(bǔ)脾腎作用的院內(nèi)自制劑骨康寧膠囊對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在治療后患者癥狀改善明顯，骨密度隨之增加。本課題組以往的研究也證實(shí)[2]，補(bǔ)腎健脾方能明顯提高脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠的TBV%。本研究結(jié)果亦表明，經(jīng)補(bǔ)腎健脾方治療后，脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠的BMD明顯增高，說明補(bǔ)腎健脾方對(duì)其有明顯的治療作用。而補(bǔ)腎健脾方治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理何在？這是本研究深入探討的關(guān)鍵問題。

OPG/RANKL在破骨細(xì)胞生成、分化、發(fā)育、成熟、激活過程中起決定性作用，是非常重要的破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號(hào)因子。Yasuda[7]在研究發(fā)現(xiàn)，OPG基因敲除小鼠皮質(zhì)骨和骨小梁減少，易出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥。 Shimizu-Ishiura等[8]則研究了OVX小鼠，發(fā)現(xiàn)給予OPG的OVX小鼠骨小梁增加明顯，而未給予OPG的OVX小鼠骨小梁減少，說明OPG可以抑制骨吸收而減少骨量丟失。RANKL是能夠直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育和使之激活的惟一細(xì)胞因子，它與破骨細(xì)胞表面的RANK相結(jié)合，強(qiáng)有力地促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成、分化和成熟，并能增強(qiáng)破骨細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力；同時(shí)還可以抑制破骨細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)其存活時(shí)間[9，10]。

VIP及GAS、MTL均是衡量脾虛證的重要指標(biāo)[11-12]。如黃學(xué)寬等[13]觀察了具有益氣健脾、行氣消食作用的六味和中散對(duì)脾虛模型大鼠胃腸激素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，脾虛模型大鼠VIP水平顯著增高，GAS、MTL水平比正常對(duì)照組顯著降低；經(jīng)六味和中散治療后上述指標(biāo)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。近年來有研究表明，VIP與骨吸收密切相關(guān)[14，15]。如Perssona[16]研究發(fā)現(xiàn)，VIP能以時(shí)間、濃度依賴的方式刺激小鼠顱骨成骨細(xì)胞IL-6(白細(xì)胞介素6)mRNA的表達(dá)和蛋白的釋放，而IL-6是一種強(qiáng)有力的骨吸收刺激因子，因此VIP能促進(jìn)骨吸收。

本研究結(jié)果顯示，與脾腎兩虛模型組比較，補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎健脾組OPG含量均顯著增高，而健脾組與之比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與健脾組比較，補(bǔ)腎組和補(bǔ)腎健脾組OPG含量均明顯增高，且補(bǔ)腎健脾組明顯高于補(bǔ)腎組。健脾組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎健脾組RANKL、VIP含量均顯著低于脾腎兩虛模型組；與健脾組比較，補(bǔ)腎組RANKL含量降低更明顯，且補(bǔ)腎健脾組又明顯低于補(bǔ)腎組；與補(bǔ)腎組比較，健脾組和補(bǔ)腎健脾組VIP含量降低更為明顯。與脾腎兩虛模型組比較，健脾組和補(bǔ)腎健脾組MTL和GAS含量均顯著增高，而補(bǔ)腎組與之比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且補(bǔ)腎健脾組GAS含量明顯高于健脾組和補(bǔ)腎組。

以上結(jié)果說明，健脾方、補(bǔ)腎方和補(bǔ)腎健脾方均能提高脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠的BMD，其中補(bǔ)腎健脾方的效果最佳。補(bǔ)腎健脾方可通過上調(diào)OPG、MTL、GAS水平，并下調(diào)RANKL、VIP水平，從而達(dá)到對(duì)脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥的治療作用。健脾方對(duì)MTL、GAS、VIP的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于補(bǔ)腎方，補(bǔ)腎方對(duì)OPG、RANKL的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于健脾方，而補(bǔ)腎健脾方對(duì)上述指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用均明顯強(qiáng)于以上兩方。這是補(bǔ)腎健脾方療效優(yōu)于補(bǔ)腎方和健脾方的機(jī)制之一，也進(jìn)一步說明在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和治療過程中，中醫(yī)的脾腎兩臟是密切相關(guān)的。但必須指出的是，骨質(zhì)疏松癥作為一種病機(jī)涉及多臟器、病理包括多環(huán)節(jié)的復(fù)雜性疾病，補(bǔ)腎健脾法治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理必然是多方面的。本研究只是從一個(gè)角度進(jìn)行了探討，其他機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究。

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