劉德亮，李惠林，渠 昕，趙恒俠，肖小惠

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市中醫(yī)院)，廣東 深圳 518033)

飲食結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)生率逐年增長(zhǎng)，與2型糖尿病的發(fā)生關(guān)系密切。傳統(tǒng)的降糖調(diào)脂藥物具有明確療效，但是長(zhǎng)期使用其副作用難以避免，因此中藥的降糖調(diào)脂機(jī)制成為研究熱點(diǎn)?；钛堤秋嬘牲S芪、生地、丹參等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的作用，其良好的調(diào)脂降糖作用在前期研究中已被證實(shí)，現(xiàn)為進(jìn)一步探討其降糖調(diào)脂的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠胰島素抵抗、高脂血癥模型，探討活血降糖飲對(duì)胰島素抵抗、高脂血癥大鼠糖、脂代謝的影響，以及其可能的藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼養(yǎng)

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠50只，約2月齡，體質(zhì)量150～180 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22 ℃，自然晝夜節(jié)律光照，自由飲水、攝食，飼養(yǎng)濕度40%～70%；高脂飼料及常規(guī)飼料均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高脂飼料熱量組成為碳水化合物20%，蛋白質(zhì)20%，脂肪60%；常規(guī)飼料為碳水化合物64%，蛋白質(zhì)23%，脂肪13%。

1.2 藥物及試劑

活血降糖飲組成：黃芪30 g，生地20 g，丹參30 g，太子參30 g，五味子15 g，麥冬15 g，山藥12 g，黃精15 g，丹皮12 g，大黃16 g，紅花12 g，桃仁10 g。用10倍體積蒸餾水浸泡生藥1 h，大火煎開(kāi)，小火繼續(xù)煎煮30 min，共煎2次，過(guò)濾濃縮水煎液，濃縮液濃度為4 g/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。非諾貝特膠囊為法國(guó)利博福尼制藥公司產(chǎn)品，用雙蒸水溶解至濃度為2 g/L，保存在4℃冰箱備用。

1.3 試劑與儀器

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、游離脂肪酸(NEFA)、血糖試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。胰島素放免試劑盒購(gòu)自北京原子能科學(xué)研究所，兔抗大鼠胰高糖素樣肽-1受體(GLP-1R)多克隆抗體、β-actin多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4(GLUT-4)多克隆抗體為CST公司產(chǎn)品，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。檢測(cè)儀器采用北京六一儀器廠(chǎng)DYCZ-24型垂直板電泳槽，中國(guó)山東彩虹分析儀器廠(chǎng)GF-D800型半自動(dòng)生化分析儀，Quantity One定量分析軟件及HMIAS-2000圖像分析系統(tǒng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物模型的建立和分組 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周(標(biāo)準(zhǔn)飲食)，隨機(jī)選出10只大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，作為正常組。剩下的40只大鼠給予高脂、高熱量飲食，28周后，篩選血清TC、TG、NEFA、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)異常者30只作為成模大鼠(根據(jù)空腹血糖、空腹血清胰島素計(jì)算HOMA-IR，根據(jù)正常大鼠血清TC、TG、NEFA、HOMA-IR計(jì)算出95%可信區(qū)間范圍，血清TC、TG、NEFA、HOMA-IR值高于正常范圍上限20%被認(rèn)為是胰島素抵抗、血脂異常大鼠)，按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、中藥組、貝特組、正常組共4組各10只。

1.4.2 動(dòng)物處理 中藥組每日以5 g/kg/d的劑量灌服活血降糖飲煎劑，貝特組每天以非諾貝特混懸液20 mg/kg/d治療，正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃；治療期間，模型組、中藥組、貝特組均繼續(xù)喂以高脂高熱量飼料，正常組喂以常規(guī)飼料。

1.4.3 標(biāo)本制備 各組大鼠均治療8周后，禁食24 h后，行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)及胰島素釋放試驗(yàn)(IRT)實(shí)驗(yàn)。繼續(xù)治療1周后，禁食24 h，動(dòng)物以45 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清用于檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C、NEFA。取附睪周?chē)窘M織及肝組織適量，部分以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，部分存于液氮中。

1.4.4 指標(biāo)測(cè)量 ①按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各血清學(xué)指標(biāo)；②肝組織脂肪含量的測(cè)定 取約0.5 g肝右葉勻漿，肝組織按 1∶9(W/V)比例加入10%抽提液(氯仿∶甲醇，2∶1，V/V)，抽提 24 h，4℃ 1500 g 離心 15min，取上清用酶法測(cè)定肝臟組織TG含量；③ western blot測(cè)定肝組織及脂肪組織GLP-1R、GLUT-4蛋白表達(dá): 按蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肝臟及脂肪組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白濃度；每例標(biāo)本取50 μg等量蛋白，蛋白電泳采用10%SDS-PAGE凝膠，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，置于封閉液(5%脫脂奶粉)，封閉2 h，再用工作濃度為1∶200～1000的抗體稀釋液，4℃孵育過(guò)夜。第2天TBST洗膜后用工作濃度為1∶5000的山羊抗大鼠IgG-HRP二抗搖床孵育2 h后，進(jìn)行雜交ECL化學(xué)發(fā)光。每條帶的吸光度值通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析，各蛋白的相對(duì)表達(dá)量用蛋白/內(nèi)參的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 組大鼠OGTT水平比較

表1圖1顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清OGTT0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h血糖水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥組、貝特組大鼠血清OGTT0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h血糖水平均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠OGTT水平比較

注：與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01

圖1 各組大鼠OGTT結(jié)果

圖2 各組大鼠IRT結(jié)果

2.2 各組大鼠IRT水平比較

表2圖2顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清IRT0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h胰島素水平均升高(P<0.01)，與模型組比較，中藥組、貝特組大鼠血清IRT0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h胰島素水平均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠IRT結(jié)果

注：與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.3 各組大鼠HOMA-IR、胰島素敏感指數(shù)(ISI)及肝臟TG含量比較

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR、肝臟TG含量明顯升高(P<0.01)，而ISI水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥組、貝特組HOMA-IR及肝臟TG含量明顯降低(P<0.01)，ISI水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

表3 各組大鼠HOMA-IR、ISI及肝臟TG含量比較

注：與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.4 各組大鼠血脂水平比較

表4顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清HDL-C降低(P<0.01)，TC、TG、LDL-C、NEFA均升高(P<0.01)；中藥組、貝特組血清TC、TG、LDL-C、NEFA與模型組比較均降低(P<0.01)，HDL-C升高(P<0.01)。

2.5 各組大鼠肝組織切片HE染色結(jié)果

光鏡下觀(guān)察，正常組肝細(xì)胞排列正常，無(wú)明顯病理改變 (圖3-A)；模型組肝組織表現(xiàn)為彌漫性脂肪變性，肝細(xì)胞體積增大，胞核居邊，胞質(zhì)中可見(jiàn)大量脂滴空泡，病變最明顯處為中央靜脈周?chē)?，且小葉內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3-B)；中藥組和貝特組大鼠肝臟病理學(xué)變化較模型組明顯減輕(圖3-C、圖3-D)。

表4 各組大鼠血脂水平比較

注：與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.6 各組大鼠肝臟及脂肪組織GLP-1R蛋白表達(dá)的比較

模型組大鼠肝臟GLP-1R蛋白表達(dá)明顯低于正常組(P<0.01)，經(jīng)過(guò)8周治療后，中藥組及貝特組大鼠肝組織中GLP-1R蛋白表達(dá)較模型組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠脂肪組織GLP-1R蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.01)，經(jīng)過(guò)8周治療后，中藥組及貝特組大鼠脂肪組織中GLP-1R蛋白表達(dá)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 各組大鼠肝臟組織學(xué)結(jié)果比較 (HE染色，×400)

圖4 各組大鼠肝臟及脂肪組織中GLP-1R蛋白的表達(dá)

2.7 各組大鼠肝臟及脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)的比較

模型組大鼠肝臟及脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)均明顯低于正常組(P<0.01)，經(jīng)過(guò)8周治療后，中藥組及貝特組大鼠肝臟及脂肪組織中GLUT-4蛋白表達(dá)較模型組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 各組大鼠肝組織中GLUT-4蛋白的表達(dá)

3 討論

高脂高熱量飲食與高脂血癥、脂肪肝、胰島素抵抗等代謝性疾病關(guān)系密切，脂肪組織及異位沉積的脂肪均可導(dǎo)致NEFA升高，進(jìn)而引起肝臟、骨骼肌、脂肪組織等外周組織的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙，發(fā)生胰島素抵抗。目前，包括貝特類(lèi)、他汀類(lèi)、二甲雙胍、GLP-1受體激動(dòng)劑等在內(nèi)的多種治療高脂血癥和胰島素抵抗的藥物療效明確，但此類(lèi)藥物長(zhǎng)期使用造成的副作用，如肝功能受損、肝酶升高等難以避免。因此，新型降脂藥物的研究成為熱點(diǎn)。而有關(guān)中醫(yī)藥的降糖調(diào)脂作用及其機(jī)制的研究也在不斷深入。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，此類(lèi)疾病的病因大多都是由于肥甘厚味入胃，濕熱聚集于中焦，氣、血、津液的運(yùn)行和代謝受到影響，化為痰濁、瘀血，病程日久，痰濁瘀血化熱，導(dǎo)致氣陰兩傷。因此，此類(lèi)病人多表現(xiàn)為肥胖、少氣懶言、動(dòng)則汗出、口干多飲、舌暗、有瘀斑等證屬氣陰兩虛兼有瘀血的表現(xiàn)。

活血降糖飲是我科通過(guò)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的協(xié)定方，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的功效。本研究結(jié)果表明，使用活血降糖藥干預(yù)長(zhǎng)期高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗、高脂血癥模型大鼠8周后，大鼠胰島素抵抗及血脂水平明顯改善，肝臟TG含量明顯降低，說(shuō)明其具有明顯的改善胰島素抵抗和調(diào)脂作用。

腸促胰素的缺乏以及其受體后信號(hào)障礙在外周組織胰島素抵抗發(fā)生過(guò)程中起重要作用。胰高糖素樣肽-1(GLP-1)以葡萄糖依賴(lài)的方式通過(guò)與胰島β細(xì)胞表面的GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合后，刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，對(duì)血糖進(jìn)行調(diào)節(jié)，除此之外，外周組織，如肺、腎、肝、胃、腸、肌肉、脂肪等均有GLP-1R表達(dá)[1-2]。外周組織GLP-1R的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié)，如體質(zhì)量減輕、肝脂肪變性程度減輕、胰島素敏感性增加等均能夠增加肝臟GLP-1R表達(dá)，而經(jīng)過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)后，小鼠肝臟GLP-1R表達(dá)明顯下調(diào)[3]。同時(shí)在外周組織，GLP-1/GLP-1R信號(hào)對(duì)糖代謝具有重要調(diào)節(jié)作用，GLP-1R缺乏的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為明顯的肝臟胰島素抵抗，有關(guān)脂肪生成和糖異生的激酶表達(dá)也明顯增加[4-5]。而在脂肪組織，GLP-1R的作用存在一定爭(zhēng)議[6]。有人認(rèn)為在胰島素抵抗時(shí)，內(nèi)臟脂肪GLP-1R的增加是作為整體GLP-1水平下降的一種代償作用[7]。但也有研究認(rèn)為，GLP-1/GLP-1R信號(hào)會(huì)抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化[8]。本研究表明，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間高脂飼料喂養(yǎng)，肝臟GLP-1R蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而經(jīng)過(guò)活血降糖飲治療后，肝臟GLP-1R蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，證明活血降糖飲可能通過(guò)GLP-1/GLP-1R信號(hào)影響肝臟葡萄糖代謝。在脂肪組織，長(zhǎng)期高脂飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致脂肪組織GLP-1R蛋白表達(dá)增加，與Vendrell J等的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。經(jīng)活血降糖飲治療后，脂肪組織GLP-1R表達(dá)無(wú)明顯變化，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

GLUTs是一組能夠促進(jìn)葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白，其包括多個(gè)亞型[9-10]。肝臟和脂肪組織中，主要由GLUT-4發(fā)揮胰島素依賴(lài)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)工作[11],因此GLUT-4在胰島素敏感組織中發(fā)揮著葡萄糖利用的限速作用。GLUT-4的表達(dá)受到多種因素的調(diào)節(jié)，如胰島素介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白激酶(AMPK)信號(hào)傳導(dǎo)均對(duì)其有激活作用[12-13]。Kim S的研究則證實(shí),GLP-1/GLP-1R信號(hào)能促進(jìn)肝臟GLUT-4蛋白表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期高脂飲食可以降低大鼠肝臟及脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。經(jīng)活血降糖飲治療后，能夠增加GLUT-4蛋白表達(dá)。然而，其作用是否通過(guò)GLP-1R信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。

本研究中，經(jīng)過(guò)28周高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)高脂血癥及胰島素抵抗動(dòng)物模型，造模方法與成人高脂血癥、胰島素抵抗的發(fā)病模式更為接近，模型動(dòng)物表現(xiàn)為明顯的肥胖、糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、胰島素分泌峰值延后、峰值較平、肝組織病理切片顯示彌漫性脂肪變性，肝組織TG含量增加，GLP-1R、GLUT-4蛋白表達(dá)下調(diào)，脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)下調(diào)，GLP-1R蛋白表達(dá)上調(diào)?；钛堤秋嬘牲S芪、生地、丹參等16味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的功效。前期基礎(chǔ)及臨床研究表明，其具有良好的降糖、調(diào)脂效果，但機(jī)制不明[15-16]。本研究證明，活血降糖飲能夠有效降低肝臟TG含量，上調(diào)肝臟GLP-1R、GLUT-4蛋白表達(dá)，上調(diào)脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)，改善外周組織葡萄糖利用，這可能是其改善機(jī)體胰島素抵抗、降糖、調(diào)脂的機(jī)制之一。而對(duì)脂肪組織GLP-1R的影響及作用機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，活血降糖飲對(duì)大鼠高脂血癥及胰島素抵抗有確切的治療作用，其作用效果與非諾貝特類(lèi)似，其作用機(jī)制可能與減少肝臟脂肪沉積、增加肝臟GLP-1R蛋白、增加肝臟及脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)有關(guān)。

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