王 栩，年四季，鄔于川，高 燕，葉迎春，袁 青

（瀘州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000）

IL-4和IL-13由Th2和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)激活嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞促進(jìn)氣道炎癥，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的增殖、活化引起氣道重塑；激活B細(xì)胞產(chǎn)生IgE；刺激氣道上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞產(chǎn)生黏液；激活氣道平滑肌細(xì)胞引起氣道高反應(yīng)性，在過(guò)敏性炎癥疾病中起著重要的作用［1－6］。

IL-4與IL-13共享信號(hào)途徑。LaPorte等［7］在《Cell》上發(fā)表了IL-4、IL-13及其受體的晶體結(jié)構(gòu)，并展示了細(xì)胞外過(guò)程如何影響信號(hào)傳導(dǎo)的專(zhuān)一性。通過(guò)IL-4和IL-13進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞發(fā)育和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)（過(guò)敏）十分重要［8－12］。IL-4和IL-13通過(guò)一個(gè)由細(xì)胞因子和兩個(gè)受體組成的雜合三聚體復(fù)合物傳導(dǎo)信號(hào)。IL-4的受體復(fù)合物有Ⅰ型和Ⅱ型2種類(lèi)型，Ⅰ型受體復(fù)合物包括IL-4Rα和 鏈γ（c）亞基。與IL-4結(jié)合的Ⅱ型受體是IL-4Rα和IL-13Rα1的復(fù)合物，也可作為IL-13結(jié)合的受體，即IL-4和IL-13通過(guò)相同的Ⅱ型受體傳導(dǎo)信號(hào)途徑［13－15］。基于IL-4／IL-13信號(hào)途徑在過(guò)敏性炎癥疾病中發(fā)揮重要的作用，制備中和性抗IL-4和IL-13雙特異性抗體，從而封阻他們的生物學(xué)活性，對(duì)于過(guò)敏性炎癥疾病的治療具有很大的潛力。本研究克隆、表達(dá)及鑒定人IL-4重組蛋白，為后期雙特異性抗體的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人外周血取自健康志愿者；總RNA提取試劑盒和cDNA合成試劑盒購(gòu)自Takara公司；pET101Directional TOPO表達(dá)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；Oligo dT15和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；Ni-NTA親和純化系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 IL-4基因擴(kuò)增 從健康志愿者外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，采用Takara cDNA合成試劑盒合成cDNA。從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）中下載人IL-4mRNA序列，采用巢氏PCR擴(kuò)增IL-4cDNA。首先采用IL-4上游引物：5′-TCC CTC GGT TTC AGC AAT-3′和下游引物 2：5′-ATC GTC TTT AGC CTT TCC-3′擴(kuò)增IL-4基因。采用 TA克隆的方式將擴(kuò)增片段克隆至pGM-T載體中，藍(lán)白斑篩選及菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子。提取質(zhì)粒，送上海生物技術(shù)有限公司測(cè)序正確后，以質(zhì)粒為模板，采用IL-4上游引物2：5′-CAC CAT GGG TCT CAC CTC CCA ACT GCT T-3′和下游引物2：5′-GCT CGA ACA CTT TGA ATA TTT CTC-3′擴(kuò)增IL-4開(kāi)放閱讀框。PCR擴(kuò)增程序均為94℃2min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，30次循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 取新鮮擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物2μL，加入pET Dirctional TOPO expression kits中的pET101／DTOPO載體1μL，反應(yīng)緩沖液1μL，加水補(bǔ)足6μL。輕柔混勻反應(yīng)混合液，室溫22～23℃連接30min。反應(yīng)結(jié)束后，置冰上進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。取大腸埃希菌（E.coli）TOPO10CaCl2感受態(tài)50μL冰上融化后，加入6μL連接產(chǎn)物于感受態(tài)中，輕柔混勻后，冰上孵育30min，然后于42℃溫育30s。于冰上放置2min后加入250μL SOC培養(yǎng)基，37℃，180r／min培養(yǎng)1h，取100～200μL涂含氨芐西林的LB固體平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上5～10個(gè)單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證質(zhì)粒中是否插入了IL-4目的基因。然后將菌落PCR陽(yáng)性的克隆子在含氨芐西林（100μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒DNA，送上海生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證插入序列的正確性。

1.2.3 高表達(dá)量克隆子的篩選 取來(lái)自不同克隆子測(cè)序正確的重組質(zhì)粒DNA IL-4／PET101 10ng加入100μL BL21感受肽中，冰浴30min，然后42℃熱擊30s，立即放冰上孵育2 min，加入250μL SOC培養(yǎng)基后，37℃，200r／min振蕩培養(yǎng)30min。將所有培養(yǎng)產(chǎn)物加入10mL含50μg／mL羧芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，接種1mL過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物到含50μg／mL羧芐西林的10mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃250r／min培養(yǎng)至細(xì)菌OD600＝0.5左右，加入終濃度1mmol／L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）37℃繼續(xù)培養(yǎng)5h，取1mL細(xì)菌懸液，5 000r／min離心5min，沉淀加入1×聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液50μL，煮沸5 min，加樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 IL-4重組蛋白的表達(dá)與純化 將過(guò)夜培養(yǎng)的高表達(dá)IL-4的克隆子細(xì)菌培養(yǎng)液2mL接種到含50μg／mL羧芐西林的100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r／min培養(yǎng)至OD600＝0.5，加入終濃度為1mmol／L IPTG于37℃培養(yǎng)5h后，8 000 r／min離心培養(yǎng)液10min，收集細(xì)菌沉淀用于蛋白純化。按Invitrogen公司的Ni-NTA純化試劑盒的變性條件純化蛋白。

1.3 IL-4蛋白的鑒定 將表達(dá)的IL-4蛋白粗提物進(jìn)行SDSPAGE電泳后，轉(zhuǎn)尼龍膜（NC）；然后用封閉液（1×PBS中含2%BSA，0.05%Tween20）室 溫封閉 NC 膜 1h。由于pET101／D-TOPO載體帶有6×組氨酸標(biāo)簽，所以加入用封閉液1 000×稀釋的抗組氨酸單克隆抗體（GE Healthcare，來(lái)源于小鼠）室溫孵育1h；洗滌后加入5 000×稀釋的馬抗小鼠IgG HRP標(biāo)記抗體（Promega）室溫孵育1h，最后加入化學(xué)發(fā)光劑（Minipore）進(jìn)行顯色。

2 結(jié) 果

2.1 IL-4cDNA的擴(kuò)增 本研究根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的人IL-4序列分別設(shè)計(jì)引物對(duì)1、2。采用引物對(duì)1擴(kuò)增得到大小為545bp的IL-4基因片段，將擴(kuò)增得到的IL-4基因片段克隆到T載體pGM-T，以提取的質(zhì)粒DNA為模板，采用引物對(duì)1、2擴(kuò)增到IL-4開(kāi)放閱讀框，其大小為460bp左右，見(jiàn)圖1。

2.2 IL-4的表達(dá) 將擴(kuò)增后的IL-4開(kāi)放閱讀框基因與載體pET101連接后，轉(zhuǎn)化E.coli TOPO10。采用菌落PCR技術(shù)驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子，并進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的4個(gè)克隆子過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21進(jìn)行小量表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果表明：誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白條帶大小為28×103左右，與目的條帶大小一致。相同條件下4個(gè)克隆子中IL-4-1表達(dá)量最高，其次是IL-4-2和IL-4-4，IL-4-3基本無(wú)表達(dá)（圖2）。選取表達(dá)量最高的IL-4-1進(jìn)行大量表達(dá)，以不加IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物作為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果顯示：IL-4-1加入終濃度為 1mmol／L IPTG誘導(dǎo)5h后，在28×103處有明顯條帶，而無(wú)IPTG誘導(dǎo)組在28×103處無(wú)明顯條帶，見(jiàn)圖3。

圖2 挑取不同克隆子表達(dá)人IL-4蛋白

圖3 表達(dá)IL4－1

2.3 IL-4的純化 將大量表達(dá)的IL-4-1采用 Ni-NTA 親和純化柱在變性條件進(jìn)行了純化。結(jié)果表明，在28×103處出現(xiàn)了單一條帶，與目的蛋白大小一致，見(jiàn)圖4。

2.4 IL-4蛋白的鑒定 為了確定表達(dá)的蛋白即為目的蛋白IL-4，對(duì)表達(dá)的IL-4-1蛋白進(jìn)行了 Western blot鑒定。結(jié)果顯示，得到的條帶大小與誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶大小一致，融合蛋白為28×103左右，說(shuō)明表達(dá)的蛋白正確，為IL-4目的蛋白。圖5中，進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)，分別上樣IL-4表達(dá)產(chǎn)物粗提物2μL（泳道1），5μL（泳道2）和10μL（泳道3），然后轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot。圖中顯示，泳道1加入2μL表達(dá)產(chǎn)物粗提物進(jìn)行Western blot，上樣量比較合適，只出現(xiàn)了特異性的IL-4條帶；隨著上樣量的增加，泳道2和泳道3出現(xiàn)了少量非特異性的條帶，見(jiàn)圖5。

圖4 純化IL4-1

圖5 Western blot鑒定表達(dá)的IL-4-1

3 討 論

IL-4和IL-13享用一條受體鏈和信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，因此IL-4和IL-13功能部分重疊，并在過(guò)敏性疾病發(fā)病過(guò)程中存在一定的相互關(guān)系。IL-4能促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgE，促進(jìn)TH0細(xì)胞向TH2細(xì)胞分化，從而促進(jìn)IL-4、IL-5和IL-13的分泌。IL-13能使B細(xì)胞合成的免疫球蛋白向IgE轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。有研究證明，采用受體蛋白同時(shí)封阻IL-4和IL-13的活性，可有效緩解過(guò)敏性炎癥疾病的癥狀，抑制疾病的進(jìn)一步發(fā)展［15］。本研究克隆表達(dá)了人IL-4蛋白，可用作抗原為后期篩選全人源抗IL-4，IL-13雙特異性抗體奠定基礎(chǔ)。

pET表達(dá)系統(tǒng)是大腸埃希菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng)，由T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，可高水平的表達(dá)外源目的基因。pET101表達(dá)載體是Invitrogen公司在pET表達(dá)載體系列上改進(jìn)的新產(chǎn)品。其C端帶有His tag標(biāo)簽，用于蛋白的純化和鑒定。商業(yè)線性化的pET101載體帶有GTGG突出序列，只需在引物設(shè)計(jì)時(shí)在引物5′端加入CACC序列，就可直接將PCR產(chǎn)物與載體連接、轉(zhuǎn)化，省去了繁瑣的酶切步驟，并且表達(dá)的蛋白產(chǎn)量高，完全滿足于后期篩選抗體時(shí)大量抗原的需求。

pET101表達(dá)載體攜帶有氨芐西林抗性基因。而本實(shí)驗(yàn)中采用了羧芐西林作為抗性選擇標(biāo)記是因?yàn)榘逼S西林抗性基因編碼β－內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中可水解氨芐西林，使抗生素失活。由于β－內(nèi)酰胺酶的催化作用可使培養(yǎng)基中的氨芐西林快速去除，導(dǎo)致非選擇性條件，如果質(zhì)粒不穩(wěn)定，則會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或低表達(dá)。羧芐西林通常比氨芐西林更為穩(wěn)定，用羧芐西林代替氨芐西林有助于增加表達(dá)量，具有防止質(zhì)粒丟失的作用，可保證重組質(zhì)粒的正確性及質(zhì)量。

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