秦博文，黨曉偉，盧思英，商亞珍

（1.承德護理職業(yè)學院科研處，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院，河北承德 067000）

1924年，Lehermitte等發(fā)現帕金森?。≒D）患者腦內鐵含量增加顯著，存在異常堆積的現象。PD患者黑質內鐵異常沉積的原因不明，但越來越多的證據顯示鐵在腦黑質部位的異常沉積與PD密切相關，極有可能是PD發(fā)病的一個重要因素［1］。鐵在腦內主要以Fn蛋白的形式儲存，正常情況下，當細胞內增多的鐵離子水平高于細胞代謝所需時，就會誘導Fn合成，這樣游離鐵就可以結合在鐵蛋白核內，以一種可利用的無毒形式存在，如果鐵蛋白的合成正常進行，黑質中增加的鐵就會是無毒性狀態(tài)［2］，Fn可以防止細胞內過剩的自由鐵離子的堆積，被認為是天然的鐵螯合劑，Fn蛋白越高對PD患者療效越好。本研究通過探討育真熄風湯（YZXFT）對腦內Fn蛋白表達作用，為進一步研究其治療PD的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性C57／BL小鼠90只，SPF級，6～7周齡，體質量（18±2）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，小鼠飼養(yǎng)于承德醫(yī)學院動物實驗中心，室溫維持在（18±2）℃，濕度維持在50%±10%，晝夜循環(huán)光照條件下，自由進食和飲水，實驗開始前適應環(huán)境1周。

1.2 儀器與試劑 Leica石蠟切片機（德國），恒溫攤片烤片機（TK-218，湖北），Thermo石蠟包埋機（英國），Olympus顯微鏡及攝像裝置（BH-2型，日本），HI98127酸度計（意大利），水域振蕩器（SZX-B，哈爾濱），恒溫磁力攪拌器（江蘇），美多巴（每片含左旋多巴200mg＋芐絲肼50mg，上海羅氏），1-甲基-4-苯基-1，20，3，6-四氫吡啶（MPTP，美國Sigma），兔抗小鼠 TH 抗體（北京博奧森生物技術有限公司），Ferritin heavy chain（H-53）：sc-25617（Santa Cruz）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 YZXFT（含生黃芪15g，熟地30g，龜板30 g，懷牛膝15g，白芍20g，鹿角膠12g，附子3g，補骨脂12g，天南星12g，白芥子12g，天麻15g，牡蠣30g，枳殼10g，丹參30g，酒大黃6g，全蝎8g，蜈蚣2g，條僵蠶12g），生藥總量275g，根據藥理學方法計算小鼠給藥量，按照每次小鼠灌胃10 mL／kg計算，3個中藥治療組分為低、中、高劑量組，小鼠給予相當于生藥量分別為35.75、71.50、143.00g／kg的藥液，陽性對照藥物美多巴（每片250mg），采用CMC溶解配制成濃度為12.5mg／mL的溶液，造模藥MPTP采用生理鹽水配制成濃度為0.33%的溶液。

1.2.2 PD小鼠模型 建立參照 Nobutaka Arai，Kazuaki Misugi的實驗方法，略加修改。小鼠造模前訓練小鼠自上而下完成爬桿運動1min，以確保小鼠能順利完成實驗項目。訓練時間為每日上、下午每只小鼠各完成爬桿活動3次，連續(xù)5d。造模前1d，采用爬桿實驗篩選健康靈活小鼠，選用能在6～10s內完成爬桿的小鼠，消除小鼠的運動差異，造模采用生理鹽水配制的0.33%MPTP（30mg·kg－1·d－1）腹腔注射，連續(xù)5d。

1.2.3 動物分組與給藥 將小鼠分成6組，每組15只，實驗藥物采用灌胃法給藥，按照10mL／kg的劑量給予小鼠灌胃，從首次注射MPTP前3d開始，灌胃小鼠（中藥治療組）分別給予高（143g／kg）、中（71.5g／kg）、低 （35.75g／kg）濃度 的YZXFT，美多巴組給予陽性藥物美多巴懸液（125mg·kg－1·d－1）灌胃，以上統(tǒng)稱（治療組）；空白對照組和模型對照組給予生理鹽水灌胃，造模期間及造模后持續(xù)灌胃給藥共27d。

1.2.4 行為學檢測 取一長50cm，直徑1cm的木制桿垂直豎立，頂端固定一直徑1.5cm的黏土小球，為防止打滑，木桿表面纏一層紗布。將被測小鼠頭向下放到小球上，從小鼠接觸小球開始計時，到小鼠前爪著地為止，記錄小鼠從小球爬下木桿所用時間。如遇小鼠中途停止或反向爬行結果不計，重新測試。如小鼠抱桿停留，不能爬行，或不能抓桿，直接掉落計120 s。每只小鼠每天在同一時間測試3次，以連續(xù)爬行用時最短的2次作為有效，取平均值作為小鼠最終爬桿時間。

1.2.5 標本采集 分別于造模第6、13、20、27天分批處死小鼠取材。用10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠，麻醉成功后，打開胸腔，插管經左心室插入升主動脈，經插管快速注入37℃生理鹽水灌流液沖洗，同時剪開右心耳放血，直到流出液不見血色，肝臟發(fā)白為止。再用推注10%福爾馬林溶液灌注，直至小鼠頭和四肢僵硬，灌注完畢后迅速斷頭，剝離顱骨及軟腦膜，取出腦，置于10%福爾馬林固定液中繼續(xù)固定，24h后0.1mol／L的PBS（pH＝7.2）液浸泡6h中止固定。經脫水，常規(guī)石蠟包埋，灌狀連續(xù)切片，片厚5μm，隔100μm取1，用于免疫組織化學染色。

1.2.6 免疫組織化學（SABC法） 切片常規(guī)脫蠟至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min；無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min，95%、90%、80%、70%乙醇依次浸沒10min，純水浸洗5min×2次；PBS浸泡5 min×2次），3%H2O237℃恒溫箱孵育30min滅活內源性酶；枸櫞酸鹽修復液微波煮沸修復，冷卻至37℃；5%BSA羊血清封閉；一抗分別用1∶150兔抗小鼠TH抗體，1∶200Ferritin heavy chain（H-53），4℃過夜；生物素化山羊抗兔IgG抗體（Ⅱ抗）和SABC，37℃各孵育20min；DAB顯色，蘇木素復染2min，HCL-ALC分化1～2s；脫水、透明、封片，陰性對照以PBS代替一抗進行染色。結果判定：以胞質內出現棕黃色顆粒為陽性神經元。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間多樣本均值間比較采用單因素方差檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 行為學測試 小鼠在注射MPTP 5～10min后，出現肢體震顫、弓背、豎毛豎尾、后肢伸張及跳竄等動作，持續(xù)20～30 min后，小鼠活動明顯減少，動作遲緩，對外界反應降低，逃避反應遲鈍，甚至匍匐不動，此情況持續(xù)一段時間后逐漸恢復，24 h后完全消失。爬桿實驗采用小鼠完成固定爬桿的時間來評估小鼠的運動協(xié)調能力，見表1。

表1 實驗各組爬桿標準計分比較（n＝15，±s，分）

表1 實驗各組爬桿標準計分比較（n＝15，±s，分）

△：P＜0.05，△△：P＜0.01，與空白對照組比較；＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別 當天6.40±1.35 7.07±1.16 6.93±1.98 6.80±2.04模型對照組 6.33±1.67 19.20±5.40△△ 54.73±17.03△△ 76.28±27.65△△YZXFT低劑量組 6.47±1.55 21.20±6.33 44.00±20.81 62.14±18.37＊YZXFT中劑量組 6.80±1.74 22.73±9.49 41.67±24＊＊ 59.15±19.45＊＊YZXFT高劑量組 6.47±1.85 20.40±4.27 36.13±19.77＊ 53.29±12.28＊美多巴組 6.73±1.39 18.80±4.39 39.13±12.87＊ 50.94±14.80 1d 3d 5d空白對照組＊＊

表2 各組小鼠腦內Fn蛋白表達比較（n＝3，±s）

表2 各組小鼠腦內Fn蛋白表達比較（n＝3，±s）

△：P＜0.05，△△：P＜0.01，與空白對照組比較；＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與模型對照組比較。－：表示此項無數據。

組別 劑量9 0.019 2±0.001 7模型對照組 － 0.018 3±0.000 3△△ 0.012 5±0.001 3△△ 0.019 9±0.000 7△△ 0.019 9±0.000 0 YZXFT低劑量組 35.75g／kg 0.018 8±0.001 0 0.014 1±0.000 1 0.023 6±0.001 7 0.014 3±0.001 7＊＊YZXFT中劑量組 71.50g／kg 0.040 3±0.001 9＊＊ 0.034 8±0.000 4＊＊ 0.024 6±0.003 2 0.028 6±0.000 1＊＊YZXFT高劑量組 143.00g／kg 0.099 1±0.001 8＊＊ 0.077 1±0.002 5＊＊ 0.095 2±0.009 2＊＊ 0.053 7±0.003 2＊＊美多巴組 125.00mg／kg 0.083 7±0.007 9＊＊ 0.089 1±0.001 4＊＊ 0.140 1±0.002 3＊＊ 0.065 5±0.001 8 6d 13d 20d 27d空白對照組 － 0.005 7±0.000 4 0.005 8±0.000 2 0.012 6±0.001＊＊

圖1 實驗第27天黑質內Fn免疫組織化學蛋白表達（SABC法，×400）

結果顯示，首次注射MPTP前1d，各組小鼠均在6～10s內完成爬桿活動，注射MPTP后，模型對照組與空白對照組比較，完成爬桿時間出現延長，且完成爬桿時間隨著用藥時間的延長而顯著增加，尤其從第3天開始，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中藥組與模型對照組比較，爬桿時間有所縮短。

2.2 Fn組化染色 Fn陽性細胞染色為棕黃色，為神經膠質細胞，空白對照組小鼠腦內胞質著色均勻分布，神經細胞胞體正常，輪廓飽滿，核仁清晰，模型對照組與空白對照組比較，模型對照組神經膠質細胞數量明顯降低，治療組神經膠質細胞較模型對照組增多，體積較飽滿，結構較清晰，見圖1。

2.3 YZXFT對小鼠腦內Fn蛋白表達的影響 Fn免疫組織化學結果顯示，在給藥的第6、13、20天模型組Fn含量與空白組比較增加，差異均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），分別為2.21倍、1.15倍、0.36倍。給藥的第6、13、20和27天，YZXFT 低劑量組與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；YZXFT中劑量組與模型對照組比較，Fn蛋白表達分別增加了1.20倍（P＜0.01）、1.78倍（P＞0.05）、95.2%（P＞0.05）、48.95%（P＜0.01）；YZXFT高劑量組與模型對照組比較，Fn蛋白表達分別增加了4.41、5.16、6.55、1.79倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而美多巴組與模型對照組比較，Fn蛋白表達分別增加了3.57、6.12、10.19、2.41倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

3 討 論

YZXFT以熟地、龜板、鹿角膠為君藥，輔以其他滋肝陰、補腎氣、補脾益氣、活血化瘀、化疾通絡的中藥有效成分，從多靶點、多層次、多途徑整體調節(jié)機體功能，達到熄風止痙、引血下行、腎陽充盛，肝陽下潛，虛風得熄，筋脈得養(yǎng)，抽搐震顫自止的效果，符合PD的中醫(yī)治療理論。行為學上采用爬桿實驗［3－4］作為測試小鼠協(xié)調運動能力改變的指標，結果顯示在造模第3天，模型對照組與空白對照組的出現顯著差異，隨著MPTP注射時間的增加，每次注射后小鼠的運動障礙程度較前1d增加，癥狀持續(xù)時間相應延長。中藥治療組和美多巴組與模型對照組比較PD小鼠運動協(xié)調障礙均有不同程度的減輕，恢復時間有所縮短，顯示YZXFT可減輕PD小鼠的行為學障礙，實驗結果表明，本次研究所采用的連續(xù)5d腹腔注射MPTP（30mg·kg－1·d－1）建立的PD小鼠模型是可靠的，并且YZXFT對MPTP所致小鼠運動協(xié)調能力障礙具有一定的改善作用。

多數學者普遍認為，鐵通過Fenton反應與H2O2反應產生具有高度活性的羥自由基（-OH），-OH通過作用于核酸、蛋白質和含有大量不飽和脂肪酸的細胞膜，從而引起細胞損傷［5］。結合的Fe3＋需要被還原成Fe2＋后才能與H2O2反應生成-OH，這是鐵產生氧化應激損傷的一個關鍵環(huán)節(jié)。鐵在腦內主要以Fn的形式儲存，Fn是由蛋白質外殼和殼內無機復合體的鐵核構成。蛋白質外殼是由重鏈（H亞基）和輕鏈（L亞基）組成。H亞基含有有活性的鐵氧化酶，它是氧化Fe2＋的關鍵酶［6］。SN內鐵以Fe2＋的形式被攝取，隨之在鐵蛋白外殼被鐵氧化酶氧化為Fe3＋并轉入鐵核，以多聚體形式聚集在鐵核內，而L亞基不含有鐵氧化酶。因此H亞基具有迅速結合和穩(wěn)定鐵，減少氧化應激損傷的作用，被認為是細胞抗氧化損傷的天然保護劑。同樣，鐵蛋白中的Fe3＋也可以在多種生物還原劑如半胱氨酸、還原型核黃素和抗壞血酸的作用下還原成Fe2＋而釋放［7］。正常情況下，當細胞內增多的Fe2＋水平高于細胞代謝所需時，就會誘導Fn合成，這樣游離鐵就可以結合在鐵蛋白核內，以一種可利用的無毒形式存在。如果鐵蛋白的合成正常進行，SN中增加的鐵就會是無毒性狀態(tài)［8］，Fn可以防止細胞內過剩的自由鐵離子的堆積，因此，被認為是天然的鐵螯合劑。

本研究結果顯示，模型對照組比空白對照組Fn顯著增加，可能是游離鐵的增加誘發(fā)鐵蛋白合成增多。而治療組小鼠Fn水平較模型組增多顯著，且隨著劑量的增加，Fn水平也增加，YZXFT高劑量組與美多巴組近似，提示YZXFT可能是通過促進膠質細胞內鐵蛋白含量的增加，進而結合游離鐵離子，降低鐵的異常堆積，對抗神經細胞膜上產生的脂質過氧化反應，從而保護黑質多巴胺神經元免遭氧化應激的攻擊，達到抗PD的目的。

［1］ BovéJ，Perier C.Neurotoxin-based models of Parkinson′s disease［J］.Neuroscience，2012，211：51-76.

［2］ Zhang HX，Tao L，Jiao XY，et al.Nitrative thioredoxin inactivation as a cause of enhanced myocardial ischemia reperfusion injury in the aging heart［J］.Free Radic Biol Med，2007，43（1）：39-47.

［3］ 許耀剛，龐曉峰.MPTP損傷的小鼠PD模型的制作與評價［J］.生物化學與生物物理進展，2006，33（10）：74-75.

［4］ 李麗波，王玉祥.帕金森病MPTP模型小鼠兩種行為學檢測方法的比較研究［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2009，30（15）：1641-1643.

［5］ Valko M，Morris H，Cronin MT.Metals，toxicity and oxi-dative stress ［J］.Curr Med Chem，2005，12（10）：1161-1208.

［6］ Rivera-Mancía S，Pérez-Neri I，Ríos C.The transition metals copper and iron in neurode-generative diseases［J］.Chem Biol Interact，2010，186（2）：184-199.

［7］ Jimenez-Del-Rio M，Velez-Pardo C.The bad，the good，and the ugly about oxidative stress［J］.Oxid Med Cell Longev，2012，156：163-193.

［8］ Zhang HX，Tao L，Jiao XY，et al.Nitrative thioredoxin inactivation as a cause of enhanced myocardial ischemia reperfusion injury in the aging heart［J］.Free Radic Biol Med，2007，43（1）：39-47.