白 雪 王 毅

誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）技術(shù)是生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項突破性技術(shù)，在疾病研究、個體化治療、再生醫(yī)學(xué)及模型制備等方面均具有巨大的應(yīng)用潛力[1]。Takahashi等[2]以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將4種干細胞轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4）導(dǎo)入小鼠皮膚成纖維細胞，使細胞重編程為具有類似胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）特點的新型細胞，稱為iPSC。Takahashi等[3]又利用4種同樣的轉(zhuǎn)錄因子將人皮膚成纖維細胞誘導(dǎo)為iPSC。近年來，iPSC研究進展迅速，已獲得了多種來源于人或動物成體細胞的iPSC，特別在iPSC疾病模型的研究方面，取得了重要的研究成果[4]。iPSC技術(shù)提供了一個忠實模擬人類疾病的機會，為人類疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。本文就iPSC疾病模型的應(yīng)用價值綜述如下。

1 iPSC疾病模型的優(yōu)勢

研究者常采用動物模型對疾病的病理機制和治療藥物進行研究。但動物與人類之間存在著生物學(xué)差異，許多人類疾病的狀態(tài)無法用動物模型模擬，且構(gòu)建的動物模型很難模擬疾病的個體差異。ESC誕生后，人們嘗試著利用ESC的多潛能分化特性獲得某種疾病的表型，但面臨ESC的倫理問題及疾病表型不易誘發(fā)等難題。利用iPSC技術(shù)可直接從患者身上獲得所需的研究材料，并且iPSC不受倫理的限制，細胞來源豐富。所獲得的疾病iPSC及其分化的細胞可被廣泛用于疾病的研究。iPSC疾病模型的研究已涉及神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病及糖尿病、肝病和多種遺傳性疾病等，研究內(nèi)容包括：iPSC的誘導(dǎo)、分化、疾病表型、發(fā)病機制探索及藥物試驗等[5-6]。

目前，已有多種具有明確遺傳背景的疾病建立了相應(yīng)的iPSC疾病模型，一些特異性遺傳性疾病相對容易模擬，更適于采用iPSC技術(shù)進行研究[7]。iPSC疾病模型為人們在體外研究疾病提供一個有效的平臺[8]。

2 iPSC疾病模型的建立

iPSC疾病模型包括具有疾病表型的iPSC及其分化細胞，其建立的過程是患者的成體細胞重編程、誘導(dǎo)分化及篩選受疾病影響的效應(yīng)細胞。重編程方法的發(fā)展為iPSC疾病模型的建立奠定了基礎(chǔ)。成體細胞從去分化到重編程為iPSC一般需2~4周。iPSC誘導(dǎo)的本質(zhì)是使終末分化的細胞重新獲得多能干細胞相似的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳學(xué)特征，可通過外源性的轉(zhuǎn)錄因子、小分子化合物及人工激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實現(xiàn)。以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體，利用轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4的重編程，可能會引起插入突變。Soldner等[9]利用Cre-Loxp系統(tǒng)重編程，在含有重編程基因的慢病毒載體兩端加上loxp位點，隨后載體整合進入成纖維細胞基因組中，重編程后，利用Cre基因的瞬時表達從iPSC中移除重編程因子。移除了重編程因子的iPSC基因表達譜與ESC更為接近，但Cre-Loxp系統(tǒng)重編程介導(dǎo)的基因刪除會導(dǎo)致一段載體DNA留在插入位點上，也無法避免插入突變。Woltjen等[10]將重編程因子插入PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子的5′和3′末端重復(fù)序列之間，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，PB轉(zhuǎn)座子整合進入成纖維細胞基因組。重編程以后，PB轉(zhuǎn)座酶瞬時表達切除PB轉(zhuǎn)座子，在整合位點不留任何痕跡。PB系統(tǒng)重編程較傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒方法產(chǎn)生iPSC的效率高，且安全。Cre-Loxp和PB系統(tǒng)重編程在操作上要求更多、更嚴(yán)格。

Zhou等[11]通過重編程因子的編碼蛋白誘導(dǎo)iPSC形成，該研究將穿膜肽11R（11個精氨酸轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域）與4種轉(zhuǎn)錄因子蛋白相結(jié)合（Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和cMyc-11R），利用小分子物質(zhì)丙戊酸（VPA）協(xié)助刺激，將小鼠胚胎成纖維細胞重編程為iPSC。誘導(dǎo)過程不改變宿主細胞的基因組，安全性高，此方法簡單，缺點是誘導(dǎo)效率低。Warren等[12]采用人工合成的mRNA誘導(dǎo)人體細胞重編程為iPSC，該方法避免了細胞對外源RNA的免疫反應(yīng)，不損傷細胞的基因組，得到的iPSC與ESC更為相似，其誘導(dǎo)效率是傳統(tǒng)方法的40~100倍，速度也是傳統(tǒng)方法的2倍，是一種安全、有效的誘導(dǎo)方法，有較高的應(yīng)用價值。Anokye-Danso等[13]首次采用小RNA（microRNAs）對人和鼠的成體細胞進行重編程，在未使用轉(zhuǎn)錄因子的情況下誘導(dǎo)出iPSC，并成功地分化為生殖細胞，誘導(dǎo)效率提高約100倍。隨著iPSC技術(shù)的發(fā)展，安全性及誘導(dǎo)效率在不斷提高，非病毒、非整合的誘導(dǎo)方法成為研究的熱點，特別是iPSC安全性問題不但是iPSC臨床應(yīng)用的前提，也是成功建立iPSC疾病模型的保障。另外，建立iPSC疾病模型還需要有效的定向分化體系及分離純化特定細胞類型的方法，以保證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

3 iPSC疾病模型的應(yīng)用

3.1 iPSC疾病模型與病理機制研究 馬凡綜合征（MFS）是一種遺傳性結(jié)締組織病，為常染色體顯性遺傳，由編碼細胞外基質(zhì)蛋白基因FIBRILLIN-1（FBN1）突變引起。MFS患者來源的iPSC能夠像人ESC一樣真實反映該基因疾病。來源于MFS患者的iPSC和來自于攜帶FBN1突變胚胎的ESC均具有FBN1基因突變，均表現(xiàn)出該疾病最為顯著的臨床特征：骨組織形成能力下降，容易形成軟骨；并且證明轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β信號激活可導(dǎo)致FBN1突變的患者干細胞向骨的分化受到抑制，當(dāng)抑制TGF-β信號時，干細胞向骨的分化得以恢復(fù)。利用患者的iPSC及其分化細胞在體外構(gòu)建疾病模型，并進行疾病研究是完全可行的[14]。Ye等[15]將2例骨髓增殖性疾?。∕PD）患者的外周血CD34+細胞轉(zhuǎn)化為多個iPSC系，這些細胞攜帶MPD特征性的獲得性的JAK2-V617F基因突變，并具有多向分化的能力。在一定條件下使其向造血細胞分化后，表現(xiàn)出紅系造血能力增強和特定基因的表達，這類iPSC提供了研究MPD發(fā)病機制的模型。

關(guān)于帕金森病（PD）衰老機制，一直缺乏研究的模型，大多數(shù)PD研究利用轉(zhuǎn)基因小鼠或藥理學(xué)小鼠模型，而小鼠的神經(jīng)生物學(xué)特征和衰老過程與人類具有很大的區(qū)別。Liu等[16]利用iPSC技術(shù)研究了攜帶PD致病基因LRRK2（G2019S）突變患者的神經(jīng)細胞，首次揭示了核膜異常，以及腦內(nèi)神經(jīng)干細胞漸進性功能衰退在PD發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。他們先將攜帶PD致病基因LRRK2（G2019S）突變的患者皮膚細胞誘導(dǎo)為iPSC，再將iPSC定向分化為目前無法從患者顱內(nèi)直接獲取的功能性神經(jīng)干細胞及多巴胺神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)LRRK2（G2019S）突變的神經(jīng)干細胞表現(xiàn)出一系列與“衰老”相關(guān)的退行性表型，如對細胞內(nèi)泛素化蛋白聚集誘導(dǎo)的凋亡更加敏感。隨著體外傳代次數(shù)的增加，攜帶基因突變的神經(jīng)干細胞表現(xiàn)出明顯的核膜異常，如核纖層蛋白組成和核膜結(jié)構(gòu)的改變。為驗證這些新型病理特征與PD致病基因LRRK2突變之間的分子聯(lián)系，研究者通過基因打靶技術(shù)原位矯正了患者神經(jīng)干細胞中的LRRK2（G2019S）突變。結(jié)果表明，矯正后的神經(jīng)干細胞與PD相關(guān)的疾病表型消除了。相反，利用打靶技術(shù)在正常人ESC中定向敲入LRRK2(G2019S)突變，將會導(dǎo)致疾病相關(guān)表型的出現(xiàn)。

3.2 iPSC疾病模型與藥物研究 藥物研發(fā)中存在的難題是建立合適的模型。目前，最常使用動物模型，但動物模型不但涉及倫理問題，而且動物模型與人類存在遺傳背景、生理及藥物代謝差異等。利用iPSC疾病模型進行藥物研究可避免上述限制，并且可針對不同患者建立iPSC疾病模型，篩選出具有針對性的藥物，真正實現(xiàn)個體化治療。

Riley-Day綜合征是一種罕見的遺傳病，其致病基因為IKBKAP，累及神經(jīng)細胞，目前，人們很難通過組織學(xué)活檢從患者體內(nèi)取得這種細胞進行研究。Lee等[17]獲得了Riley-Day綜合征患者的皮膚細胞，將其誘導(dǎo)成為iPSC，再使iPSC分化為受到疾病影響的神經(jīng)細胞（神經(jīng)嵴前體細胞），構(gòu)建了iPSC疾病模型，利用該模型進行了大規(guī)模的藥物篩選。結(jié)果顯示，這些化合物能提高IKBKAP的表達，其中SKF-86466能夠通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)PKA依賴的CREB磷酸化和cAMP水平來誘導(dǎo)IKBKAP轉(zhuǎn)錄，SKF-86466是在細胞水平上逆轉(zhuǎn)疾病進程的潛在分子。由于一些罕見遺傳疾病很難應(yīng)用現(xiàn)有的模型進行藥物研發(fā)，因此，該成果為一些遺傳疾病提供了成本低、快捷的藥物研發(fā)途徑。

Tanaka等[18]報道，使用離子通道抑制劑作用于iPSC分化的心肌細胞，會引起該心肌細胞除極過程的改變，并呈劑量依賴性，與人體原位心肌細胞對離子通道抑制劑的反應(yīng)一致。Yokoo等[19]研究表明，利用iPSC分化的心肌細胞進行藥物研究具有可行性。Itzhaki等[20]獲取了1例2型先天性QT間歇延長綜合征（LQTS）患者的皮膚成纖維細胞，誘導(dǎo)生成了iPSC。該iPSC具有患者特異的KCNH2基因錯義突變（A614V），將其分化為心肌細胞后，細胞表現(xiàn)出動作電位時程顯著延長，原因是源于心臟外向鉀電流顯著下降。研究者應(yīng)用該模型對一些治療藥物進行了評估。

利用iPSC分化的肝細胞可用于篩查藥物的肝細胞毒性，有助于藥物的評估。Takayama等[21]檢測了與肝臟發(fā)育有關(guān)的7種候選基因。發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄因子FOXA2及HNF1α可聯(lián)合促進人iPSC及ESC分化為肝細胞。這些細胞具有肝細胞相關(guān)的基因表達譜，并且具備原代人類肝細胞的功能及特性。他們利用人iPSC及ESC分化的肝細胞成功地評估了9種藥物引起的細胞毒性。FOXA2及HNF1α是促進人iPSC及ESC分化為肝細胞的有效轉(zhuǎn)錄因子，對篩查由藥物引起的細胞毒性有重要價值。iPSC誘導(dǎo)和分化技術(shù)的發(fā)展，將促進iPSC疾病模型的完善和應(yīng)用。

3.3 iPSC疾病模型與細胞治療研究 iPSC疾病模型的建立為細胞治療奠定了基礎(chǔ)。人們可通過同源重組技術(shù)糾正患者iPSC中突變的基因，將其分化為功能細胞，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，有望徹底治愈疾病。Hanna等[22]第1次證實了基于iPSC的基因矯正可以修復(fù)遺傳突變的表型，利用小鼠鐮狀細胞貧血的模型，他們建立了患病小鼠的iPSC，通過同源重組的技術(shù)矯正了具有缺陷的血紅蛋白基因。這種經(jīng)過基因矯正的小鼠iPSC具有體外分化為造血細胞的能力，這些造血細胞經(jīng)過移植，使得患病小鼠的紅細胞恢復(fù)正常功能。已有多種人類疾病特異的iPSC建立，且應(yīng)用同源重組技術(shù)將致病基因修復(fù)，這些疾病模型包括：兒童早衰癥、PD、回旋形萎縮癥以及鐮狀細胞貧血、地中海貧血、范科尼貧血和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿等[23-25]。在這些研究中，部分iPSC細胞的治療效果已在小鼠中得到驗證[26]。

α1-抗胰蛋白酶（A1AT）基因的點突變（Glu342Lys），可導(dǎo)致患者α1-抗胰蛋白酶缺乏癥（A1ATD），是肝臟和肺最常見的常染色體隱性遺傳病，最終使患者罹患肝硬化和肺氣腫。Yusa等[27]將A1ATD患者的皮膚細胞誘導(dǎo)為iPSC，再利用鋅指核酸酶（ZFNs）剪斷基因突變位置的基因序列，使用PB轉(zhuǎn)座子將正確的基因插入其中，再將PB轉(zhuǎn)座子序列從細胞中剔除，在基因修正點未發(fā)現(xiàn)DNA被破壞的現(xiàn)象。修正的人iPSC分化為肝臟細胞后，移植到肝功能失調(diào)的小鼠體內(nèi)，證明這種經(jīng)過修正的基因在其分化的肝臟細胞中非?；钴S，能恢復(fù)小鼠的肝功能。盡管這些研究還處于初期階段，但已向疾病的個性化治療邁出了成功的一步。

β-地中海貧血是β-珠蛋白鏈合成減少或缺乏導(dǎo)致的一種溶血性遺傳性疾病。其中重型β-地中海貧血常由β-珠蛋白基因發(fā)生點突變或小片段缺失造成。Wang等[28]研究了1例確診為重型β-地中海貧血的患兒，其β-珠蛋白基因突變?yōu)榧兒献应?41/42缺失，運用iPSC技術(shù)將患兒成體細胞誘導(dǎo)為十幾株iPSC系，并對其中4株iPSC系進行多能性鑒定。通過同源重組技術(shù)修復(fù)了iPSC突變的位點，并將其分化為造血祖細胞，移植到免疫缺陷小鼠模型體內(nèi)，該小鼠模型在放射性照射后，其紅細胞及血紅蛋白水平能較快恢復(fù)到正常水平，并產(chǎn)生出正常β-珠蛋白。iPSC技術(shù)結(jié)合基因打靶是潛在治療遺傳性疾病的手段。

另外，用于iPSC疾病模型的基因修復(fù)有兩個方案，一是修復(fù)來源細胞的異?；?，以獲得健康的iPSC及其分化細胞；或者修復(fù)iPSC異?；?，再獲得基因正常的分化細胞。iPSC的基因修復(fù)為將來人類的細胞移植治療奠定了基礎(chǔ)。

4 iPSC疾病模型的局限性及解決方案

Soldner等[29]認(rèn)為，單個iPSC系顯示出高度差異的生物學(xué)特性，使人們難以預(yù)測它們分化為特異功能性細胞類型的傾向，限制了研究疾病特異性表型的價值。導(dǎo)致這些細胞間差異的原因大致分為3類：重編程過程造成細胞的改變；缺乏完善的分化實驗方案導(dǎo)致培養(yǎng)誘導(dǎo)的差異；遺傳背景的差異。如果將載體整合到宿主基因組中，則由重編程引起的細胞改變問題會更嚴(yán)重。因此，采用更先進的非整合性重編程技術(shù)，如質(zhì)粒、mRNA轉(zhuǎn)染及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)。改善培養(yǎng)條件，執(zhí)行更嚴(yán)格的質(zhì)量控制，將能解決這些問題。

iPSC缺乏完善的體外分化方案，大部分方案均依賴于正常胚胎發(fā)育特殊階段發(fā)揮重要作用的生長因子信號和調(diào)控因子。盡管這些方案較為有效，但它們通常生成的是不同細胞類型的混合物，當(dāng)研究目標(biāo)是構(gòu)建高度受控的疾病模型時，這將是一個極大的限制。因此，導(dǎo)入受到譜系或細胞類型特異性啟動子控制的報告基因或選擇基因，可使研究者能夠鑒別、篩選特異的細胞類型。另外，遺傳變異對于基因表達的重要影響在個體間存在差異。當(dāng)患者與健康供體間不具有相同的遺傳背景或僅具有部分的遺傳背景時，將患者來源的iPSC系與來自健康供體的iPSC系進行比較，以推測與疾病相關(guān)的表型時會有相當(dāng)大的風(fēng)險[29]。

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