李艷琦，張同存，孫雪光，廖興華，王 楠，羅學(xué)剛

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

過(guò)表達(dá)maspin對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

李艷琦，張同存，孫雪光，廖興華，王 楠，羅學(xué)剛

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

通過(guò)構(gòu)建maspin表達(dá)質(zhì)粒，在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)maspin，研究maspin對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖率及凋亡率的影響．MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)maspin能夠劑量依賴(lài)性抑制MCF-7細(xì)胞的增殖率．采用TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)maspin對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)maspin可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制其增殖．

乳腺癌；MCF-7細(xì)胞；maspin；凋亡

乳腺癌是具有高發(fā)率和死亡率的惡性腫瘤之一[1]．乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是多基因突變的結(jié)果，這包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活[2]．maspin是一種新型的非經(jīng)典絲氨酸蛋白酶抑制劑，作為一個(gè)腫瘤抑制基因，它能在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和遷移[3–4]．maspin已經(jīng)被證明能夠抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、侵襲和遷移[5–6]．然而，maspin對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響還沒(méi)有被研究清楚．本文構(gòu)建了maspin的表達(dá)質(zhì)粒，探索過(guò)表達(dá)maspin對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響，這將為maspin在乳腺癌治療方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM低糖培養(yǎng)基，Gibico公司；胎牛血清，天津康源生物技術(shù)有限公司；空載質(zhì)粒pcDNA3.1，本實(shí)驗(yàn)室保藏；Fast Pfu DNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；KpnⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DeadEndTM熒光測(cè)定TUNEL系統(tǒng)，Promega生物技術(shù)有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Turbo轉(zhuǎn)染試劑、Trizol裂解液，上海英駿生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒、DM2000 Plus DNA Marker，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；maspin一抗，Abcam公司；MTT，北京索萊寶科技有限公司；Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，天津三箭生物技術(shù)有限公司．

1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保藏．在含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清的DMEM低糖

培養(yǎng)液中，于37,℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%條件下培養(yǎng)．用體積分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代．

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

收集培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞，提取總RNA后按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA．以此cDNA為模板，以NCBI上提供的maspin mRNA序列(NM_002639.4)設(shè)計(jì)包含maspin基因全長(zhǎng)和Kpn/ⅠXhoⅠ雙酶位點(diǎn)的引物，上游引物5′-CAGGGGTACCATGGATGCCCT-3′，下游引物5′-GCCACTCGAGTTAAGGAGAACAGAATT-3′，PCR擴(kuò)增出產(chǎn)物長(zhǎng)度為1,148,bp的maspin基因．

將目的基因正向插入到pcDNA3.1載體的KpnⅠ和XhoⅠ克隆位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒maspin/pcDNA3.1，并經(jīng)內(nèi)切酶和測(cè)序證實(shí)．

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RT-PCR檢測(cè)maspin mRNA水平的表達(dá)

用TurbofectTM細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑將4,μg表達(dá)質(zhì)粒maspin/pcDNA3.1按質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑(μg∶μL)1∶2的比例轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中．對(duì)照組為未處理組和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組．將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)12,h后，將質(zhì)粒–脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，在無(wú)血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6,h后換新鮮含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18,h．而后分別收集正常培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞，提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA．以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)．maspin上游引物5′-AGTGGGTGCTAAAGGTGA-3′，下游引物5′-GAGCCGCTTGATTAGTTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小148,bp．內(nèi)參GAPDH由英駿生物技術(shù)有限公司合成，上游引物5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′，產(chǎn)物大小213,bp，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色．用BioRad圖像分析儀成像并進(jìn)行半定量分析，以測(cè)定目的基因的表達(dá)水平．

1.5 Western blot檢測(cè)maspin蛋白水平的表達(dá)

分別收集正常培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒48,h后細(xì)胞提取總蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本．將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至NC膜上．牛奶封閉液37,℃封閉NC膜1,h，maspin一抗(兔抗，1∶1,000)4,℃孵育過(guò)夜．棄一抗，用PBS洗膜3次，加入紅外(700或800,nm)熒光染料標(biāo)記的二抗(山羊抗兔，1∶5,000)，避光平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫1.5,h．棄二抗，用PBS洗膜3次，利用oddysey遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)(LICOR公司)掃膜．

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整濃度為104,mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100,μL．培養(yǎng)12,h后棄去培養(yǎng)基，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1，實(shí)驗(yàn)組梯度轉(zhuǎn)染maspin/pcDNA3.1(0.05、0.15、0.20,μg)，每組設(shè)5個(gè)平行孔．在無(wú)血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6,h后換新鮮含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18,h．用PBS洗2次，每孔加入質(zhì)量濃度為5,mg/mL的MTT 20,μL和無(wú)血清培養(yǎng)液80,μL．繼續(xù)培養(yǎng)4,h后棄去上清液，每孔加入DMSO 100,μL，振蕩使紫色結(jié)晶物充分溶解.在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490,nm處各孔的吸光度A，并按式(1)計(jì)算細(xì)胞增殖率．

1.7 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

取MCF-7細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12,h后分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、maspin/pcDNA3.1，質(zhì)粒質(zhì)量為1,μg，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例(μg∶μL)為1∶2，24,h后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次．加入4%多聚甲醛溶液，4,℃放置25,min．加入PBS，放置5,min，重復(fù)2次．加入體積分?jǐn)?shù)0.25%的Triton X-100溶液，放置20,min．加入PBS，室溫放置5,min，重復(fù)2次．吸干孔板中液體，用100,μL平衡緩沖液覆蓋細(xì)胞，室溫放置10,min．吸掉大部分平衡緩沖液，加入50,μL rTdT孵育緩沖液，37,℃避光放置1,h．將300,μL 2×SSC加入孔板，室溫放置15,min．加入PBS，放置5,min，重復(fù)2次．加入300,μL DAPI溶液，室溫放置15,min．加入PBS，室溫放置5,min，重復(fù)2次．立即在共聚焦顯微鏡(OLYMPUSG公司)下觀察細(xì)胞的凋亡情況．

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、maspin/pcDNA3.1，質(zhì)粒質(zhì)量為8,μg，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例(μg∶μL)為1∶2，而后分別收集正常細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染maspin/pcDNA3.1的細(xì)胞，800,g離心10,min，棄上清液．冰PBS洗細(xì)胞1次．用1,mL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，300,g離心10,min，棄上清液．用1,mL Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1，取100,μL細(xì)胞懸液加入5,μL Annexin VFITC，輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育10,min，再加入5,μL PI，室溫避光孵育5,min，補(bǔ)加400,μL Binding Buffer，輕輕振蕩混勻，1,h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞定量分析，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況．

2 結(jié)果與分析

2.1 maspin/pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

以提取的cDNA為模板克隆maspin基因片段，將純化后的PCR產(chǎn)物雙酶切后連接到表達(dá)載體pcDNA3.1上，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒maspin/pcDNA3.1(圖1)．表達(dá)質(zhì)粒maspin/pcDNA3.1經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到載體片段和maspin基因片段，初步證明maspin基因被插入到空載質(zhì)粒中(圖2)．測(cè)序鑒定結(jié)果表明maspin已成功連接到載體pcDNA3.1上，無(wú)突變，與NCBI相應(yīng)序列一致．

2.2 maspin/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后maspin mRNA表達(dá)變化

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染后maspin是否得到了表達(dá)，采用了半定量RT-PCR檢測(cè)maspin mRNA表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示．由圖3可知：未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組maspin mRNA無(wú)表達(dá)；而maspin/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組與前二者比較maspin mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)．這說(shuō)明轉(zhuǎn)染maspin/pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒后maspin能在mRNA水平進(jìn)行過(guò)表達(dá)，且轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒不影響maspin在mRNA水平的表達(dá)．

2.3 maspin/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后maspin蛋白表達(dá)變化

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染后maspin是否得到了表達(dá)，采用了半定量RT-PCR檢測(cè)maspin蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示．由圖4可知：未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組maspin蛋白無(wú)表達(dá)；而maspin/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組與前二者比較maspin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)．這說(shuō)明轉(zhuǎn)染maspin/pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒后maspin能在蛋白水平進(jìn)行過(guò)表達(dá)，且轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒不影響maspin在蛋白水平的表達(dá)．

2.4 轉(zhuǎn)染maspin對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

利用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1和梯度轉(zhuǎn)染maspin/pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒后MCF-7細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果見(jiàn)表1．由表1可知：細(xì)胞表達(dá)maspin蛋白后增殖能力明顯降低，且抑制效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性變化．提示過(guò)表達(dá)maspin能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖．

2.5 TUNEL檢測(cè)轉(zhuǎn)染maspin后MCF-7細(xì)胞的凋亡

MCF-7細(xì)胞分別經(jīng)空載質(zhì)粒pcDNA3.1和表達(dá)質(zhì)粒maspin/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染24,h后，利用TUNEL觀察細(xì)胞凋亡率的改變．隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察并經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算凋亡率．TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡

情況如圖5所示．由圖5可知DAPI所染的為細(xì)胞核，右側(cè)染料所染為凋亡細(xì)胞．與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡數(shù)量升高了約9倍．

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染maspin后MCF-7細(xì)胞的凋亡

應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，橫坐標(biāo)是Annexin-V FITC，縱坐標(biāo)是PI，正?；罴?xì)胞分布在流式細(xì)胞分析圖的左下區(qū)，早期凋亡細(xì)胞分布在流式細(xì)胞分析圖的右下區(qū)，晚期凋亡或壞死細(xì)胞分布在流式細(xì)胞分析圖的右上區(qū)，壞死細(xì)胞分布在流式細(xì)胞分析圖的左上區(qū)，圖6結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組MCF-7細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡或壞死率均明顯增加．

3 討 論

maspin作為絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一個(gè)非抑制劑成員，在多種癌癥類(lèi)型中發(fā)揮抑癌作用[7]. maspin的抗腫瘤影響是抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，增強(qiáng)對(duì)凋亡的敏感性，抑制新生血管的形成[5–6]．然而，關(guān)于maspin在影響MCF-7細(xì)胞的增殖與凋亡的研究目前比較少．

maspin能夠在正常的乳腺或前列腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，然而其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)減少或喪失[8]．maspin基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)缺失不是因?yàn)閙aspin基因的缺失或重排[9]，這表明在乳腺癌發(fā)展過(guò)程中可能有轉(zhuǎn)錄水平的因素來(lái)調(diào)節(jié)maspin的表達(dá)．

凋亡是一種主要的細(xì)胞自我消亡過(guò)程，它被認(rèn)為是一種阻止乳腺癌細(xì)胞發(fā)展的有效途徑．作為抗腫瘤藥物的凋亡誘導(dǎo)物已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，其中的一些已經(jīng)被應(yīng)用于臨床[10]．它可能是腫瘤治療中一種非常有前景的治療途徑．先前的報(bào)道[6]已經(jīng)證明maspin在功能上可能與乳腺癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)，能夠使乳腺癌細(xì)胞對(duì)十字孢堿引起的細(xì)胞凋亡更為敏感．而且，5–雜氮脫氧胞苷(5-aza-dc)和曲古柳菌素(TSA)能引起細(xì)胞凋亡，并且在這個(gè)過(guò)程中伴隨的maspin的重新表達(dá)也可能與凋亡有關(guān)[11]．maspin作為一種新型的E2F1調(diào)節(jié)基因，表明它可能參與E2F1引起的細(xì)胞凋亡，尤其是E2F1和化學(xué)藥劑共同引起的凋亡[12]．先前的一些報(bào)道[5]還闡明maspin能引起B(yǎng)ax和P21的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的凋亡．本文也證明了過(guò)表達(dá)maspin能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡，從而可以劑量依賴(lài)性地抑制MCF-7細(xì)胞的增殖．以上結(jié)果提示maspin對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)方式是多樣化的，并可能與腫瘤的類(lèi)別有密切關(guān)系．

本實(shí)驗(yàn)研究表明maspin能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖并引起其凋亡，所以maspin可能在乳腺癌細(xì)胞凋亡中起重要作用，并有希望成為一種以凋亡為基礎(chǔ)的乳腺癌治療的改良藥劑，但其具體機(jī)制還應(yīng)進(jìn)一步研究．

［1］ Yanagawa M，Ikemot K，Kawauchi S，et al. Luminal A and luminal B(HER2 negative)subtypes of breast cancer consist of a mixture of tumors with different genotype[J]. BMC Research Notes，2012，25(5)：376.

［2］ Elenbaas B，Spirio L，Koerner F，et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary mammary epithelial cells[J]. Genes & Development，2001，15(1)：50–65.

［3］ Sheng S，Carey J，Seftor E A，et al. Maspin acts at the cell membrane to inhibit invasion and motility of mammary and prostatic cancer cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93(21)：11669–11674.［4］ Zhang M，Volpert O，Shi Y H，et al. Maspin is an angiogenesis inhibitor[J]. Nature Medicine，2000，6(2)：196–199.

［5］ Liu J，Yin S，Reddy N，et al. Bax mediates the apoptosissensitizing effect of maspin[J]. Cancer Research，2004，64(5)：1703–1711.

［6］ Jiang N，Meng Y，Zhang S，et al. Maspin sensitizes breast carcinoma cells to induced apoptosis[J]. Oncogene，2002，21(26)：4089–4098.

［7］ Law R H，Zhang Q W，McGowan S，et al. An overview of the serpin superfamily[J]. Genome Biology，2006，7(5)：216.

［8］ Zou Z，Anisowicz A，Hendrix M J，et al. Maspin，a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells[J]. Science，1994，263(5146)：526–529.

［9］ Maass N，Biallek M，R?sel F，et al. Hypermethylation and histone deacetylation lead to silencing of the maspin gene in human breast cancer[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，297(1)：125–128.

［10］ Evan G I，Vousden K H. Proliferation，cell cycle and apoptosis in cancer[J]. Nature，2001，411(6835)：342–348.

［11］ Moiseeva E P，Almeida G M，Jones G D D，et al. Extended treatment with physiologic concentrations of dietary phytochemicals results in altered gene expression，reduced growth，and apoptosis of cancer cells[J]. Molecular Cancer Therapeutics，2007，6(11)：3071–3079.

［12］ Shachar B B，F(xiàn)eldstein O，Hacohen D，et al. The tumor suppressor maspin mediates E2F1-induced sensitivity of cancer cells to chemotherapy[J]. Molecular Cancer Research，2010，8(3)：363–372.

責(zé)任編輯：周建軍

Effect of Overexpressing Maspin on the Apoptosis of Human Breast Cancer Cell MCF-7

LI Yanqi，ZHANG Tongcun，SUN Xueguang，LIAO Xinghua，WANG Nan，LUO Xuegang
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

By constructing maspin expression plasmid，the effects of overexpressed maspin on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cell MCF-7 were studied. The proliferation of MCF-7 cells was observed with MTT. The results show that the overexpression of maspin inhibited MCF-7 cell’s proliferation in a dose dependent manner. The apoptosis of MCF-7 cells was observed with TUNEL and flow cytometry. The results indicate that the maspin overexprssion could promote the apoptosis of MCF-7 cell and thereby inhibit cellular proliferation.

breast cancer；MCF-7 cells；maspin；apoptosis

R737.9

A

1672-6510(2014)05-0020-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.005

2013–12–05；

2014–03–12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071126，31000343)

李艷琦（1989—），男，天津人，碩士研究生；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.