唐 偉，范曉云，陸兆雙，霍龍

多聚左旋精氨酸對NCI-H292細(xì)胞炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)

唐 偉，范曉云，陸兆雙，霍龍

目的研究多聚左旋精氨酸（PLA）對NCI-H292細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8、IL-13、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）的影響。方法將NCI-H292細(xì)胞分為對照組（培養(yǎng)液）、脂多糖（LPS）組（5 μg/ml）、PLA組（Max＝40 μg/ml）、LPS＋PLA組、LPS＋PLA＋肝素組。采用ELISA法檢測各組IL-6、IL-8、IL-13、Eotaxin的水平，并比較各組間的差異。結(jié)果LPS＋PLA組IL-6、IL-8、Eotaxin的水平明顯高于對照組、LPS組、PLA組（P＜0.05），而LPS組、PLA組與對照組比較，IL-6、IL-8、Eotaxin的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各組IL-13的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而肝素能夠降低LPS＋PLA組IL-6、IL-8、Eotaxin的水平（P＜0.05）。結(jié)論PLA促進LPS誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞IL-6、IL-8、Eotaxin的表達，但肝素可抑制其表達；而PLA對IL-13的表達沒有影響。

哮喘；多聚左旋精氨酸；白細(xì)胞介素-6；白細(xì)胞介素-8；白細(xì)胞介素-13；嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子；肝素

支氣管哮喘是一種以多種炎性細(xì)胞浸潤及氣道高反應(yīng)為特征的可逆性氣道阻塞性疾?。?］，其中嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，Eos）在氣道黏膜的浸潤是以哮喘為主要特征。在患者支氣管活檢組織、肺泡灌洗液和外周血中均發(fā)現(xiàn)活化的Eos，其活化后釋放的顆粒主要是嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP），而在支氣管哮喘氣道高反應(yīng)性（airwayhyperresponsiveness，AHR）的病理過程中，上皮細(xì)胞起著重要作用。ECP通過改變上皮細(xì)胞功能或直接細(xì)胞毒作用而影響氣道上皮細(xì)胞，釋放多種細(xì)胞因子如：白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-13、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）等參與AHR。作為ECP的類似物，多聚左旋精氨酸（poly-L-arginine，PLA）具有與ECP相似的生物學(xué)活性。該實驗旨在通過氣道上皮細(xì)胞來研究PLA在氣道炎癥反應(yīng)中的作用以及肝素對其影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源上皮細(xì)胞系NCI-H292是一種人肺腺癌細(xì)胞系，屬于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，單層貼壁生長，購自美國ATCC公司。

1.2 主要試劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、PLA均購自美國Sigma公司；肝素購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司；胎牛血清、RPMI 1640購自美國Gibco公司；ELISA（IL-6、IL-8、IL-13、Eotaxin）試劑盒購自上海森雄公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)NCI-H292細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基（RPMI 1640＋10%胎牛血清＋100 U/ml青霉素＋100 μg/ml鏈霉素）中培養(yǎng)［2］，37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%時開始傳代，每周傳代2次，用于后續(xù)試驗。

1.4 ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-8、Eotaxin、IL-13的表達準(zhǔn)備一定量的NCI-H292細(xì)胞過夜，在加入刺激物之前，用不含血清的RPMI 1640再洗1次，以去除內(nèi)源性細(xì)胞因子和排除血清的影響［3］，以不加任何刺激物的細(xì)胞作為陰性對照，依照試驗設(shè)計加入LPS（5 μg/ml）、PLA（Max＝40 μg/ml）、肝素（100 U/ml），37℃孵育20h后，收集上清液，采用ELISA法分別檢測各組IL-6、IL-8、Eotaxin、IL-13的水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PLA在LPS刺激后增加IL-6、IL-8的釋放一定濃度的PLA（5～20 μg/ml）明顯促進LPS誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞IL-6、IL-8的水平（P＜0.01）；與對照組比較，LPS組、PLA組IL-6、IL-8的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且在PLA為5 μg/ml時IL-6、IL-8的水平最高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 PLA與LPS聯(lián)合刺激NCI-H292細(xì)胞其IL-6、IL-8的水平

2.2 PLA在LPS刺激后增加Eotaxin的釋放一定濃度的PLA（5～40 μg/ml）明顯促進LPS誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞Eotaxin的水平（P＜0.01，P＜0.05）；與對照組比較，LPS組、PLA組Eotaxin的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且在PLA＝20 μg/ml時Eotaxin的水平最高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 PLA在LPS刺激后對IL-13的水平無影響不論有無LPS刺激，不論PLA濃度多大，各組IL-13的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 肝素降低PLA與LPS聯(lián)合刺激下IL-6、IL-8、Eotaxin的水平當(dāng)LPS、PLA均為5 μg/ml時，IL-6、IL-8的表達水平出現(xiàn)高峰，一定濃度的肝素（100 U/ml）降低LPS（5 μg/ml）＋PLA（5 μg/ml）組IL-6、IL-8水平（P＜0.01），而Eotaxin的表達在PLA＝20 μg/ml時出現(xiàn)高峰，100 U/ml的肝素降低LPS（5 μg/ml）＋PLA（20 μg/ml）組Eotaxin水平（P＜0.05）。見圖4。

圖2 PLA與LPS聯(lián)合作用NCI-H292細(xì)胞其Eotaxin的水平

圖3 PLA與LPS聯(lián)合作用NCI-H292細(xì)胞其IL-13的水平

圖4 肝素降低PLA與LPS共同作用NCI-H292細(xì)胞IL6、IL-8、Eotaxin的水平

3 討論

支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥，其發(fā)生過程是氣道炎癥、AHR、氣道重構(gòu)三聯(lián)征；其發(fā)病及演變主要受控于Th2型細(xì)胞因子［4］。病理檢查顯示有大量炎癥細(xì)胞的浸潤，在此過程中，一些細(xì)胞因子起重要的促進作用，如IL-6、IL-8、IL-13、Eotaxin等促進炎癥細(xì)胞的聚集、活化和炎癥介質(zhì)的釋放。在正常的情況下，其表達及分泌受機體嚴(yán)格調(diào)控，但在病理情況下會出現(xiàn)異常表達，如細(xì)胞因子表達過高，從而引起炎癥、自身免疫性疾病、超敏反應(yīng)等。

IL-6是一種多活性、調(diào)節(jié)急性相反應(yīng)和炎癥的重要因子，主要參與哮喘的急性發(fā)作；在血清及肺泡灌洗液中均可發(fā)現(xiàn)IL-6水平明顯升高，IL-6可反映氣道炎癥情況，作為支氣管哮喘急性發(fā)作的指標(biāo)之一。IL-8又稱中性粒細(xì)胞趨化因子，能夠選擇性趨化中性粒細(xì)胞進入氣道，并誘導(dǎo)和增強中性粒細(xì)胞脫顆粒和殺菌作用，同時吸引Eos、淋巴細(xì)胞向炎癥部位聚集，并促使其釋放ECP等炎癥介質(zhì)，參與氣道炎癥及AHR形成。該研究顯示：哮喘大鼠血清、肺泡灌洗液中IL-8水平明顯升高；用外源性抗IL-8抗體中和IL-8能抑制中性粒細(xì)胞的聚集及其介導(dǎo)的組織損傷。IL-13是Th2類細(xì)胞因子，主要通過STAT6信號途徑調(diào)控基因表達引起AHR［5］；但對缺乏IL-13的小鼠，IL-13對誘導(dǎo)AHR是必須的，同時引入外源性IL-13可直接激活引起AHR的途徑，可不需要Eos及IL-4的表達。

Eotaxin是近年發(fā)現(xiàn)的趨化因子，主要來源于氣道上皮細(xì)胞，在參與哮喘發(fā)生的眾多趨化因子中，唯有Eotaxin對Eos具有特異性趨化活性，主要促進Eos在肺內(nèi)募集并使其活化，從而引起組織損傷。研究［6］顯示，在大鼠血清、肺泡灌洗液及肺組織中均發(fā)現(xiàn)Eotaxin呈高表達，在典型哮喘及咳嗽變異性哮喘患者血清中Eotaxin的濃度明顯升高，且與Eos計數(shù)呈正相關(guān)［7］。

本實驗研究顯示，在LPS的誘導(dǎo)下，一定濃度的PLA顯著升高NCI-H292細(xì)胞IL-6、IL-8、Eotaxin的水平，并且IL-6、IL-8在PLA為5 μg/ml時出現(xiàn)高峰；而Eotaxin水平在PLA 0～40 μg/ml之間逐漸升高，在PLA為20 μg/ml時出現(xiàn)高峰，可能與PLA聯(lián)合LPS誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的機制不同有關(guān)。推測PLA可促進IL-6、IL-8、Eotaxin表達，從而趨化中性粒細(xì)胞、Eos、淋巴細(xì)胞等向氣道聚集，引起氣道炎癥反應(yīng)；但IL-13的水平在LPS與PLA聯(lián)合作用下未見明顯變化，推測IL-13可能不通過Eos發(fā)揮作用，可能直接作用于氣道上皮細(xì)胞或通過其他信號通路等引起AHR。

肝素作為最有效的抗凝劑之一，在體內(nèi)外均能延緩或阻止血液凝固；肝素已用于治療支氣管哮喘，特別是難治性哮喘，其治療作用是改善血流動力學(xué)從而改善肺循環(huán)［8］；肝素具有陰離子電荷及黏多糖結(jié)構(gòu)；而內(nèi)源性肝素能夠抑制Eos向炎性區(qū)域聚集，并且使陽離子蛋白引起的組織損傷減輕。在本實驗中，肝素能夠抑制PLA在LPS誘導(dǎo)下IL-6、IL-8、Eotaxin釋放，肝素可能中和PLA對細(xì)胞的毒性作用，抑制PLA對細(xì)胞因子的表達。

綜上所述，PLA能夠顯著促進炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、Eotaxin的釋放，引起或加重氣道炎癥反應(yīng)，從而引起哮喘發(fā)作；而肝素能夠拮抗PLA的作用。隨著對支氣管哮喘研究的不斷深入，信號傳導(dǎo)對各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)已成為熱點研究之一［9］，而阻斷這些炎癥介質(zhì)引起哮喘發(fā)作的信號通路為哮喘的治療提供了更廣闊的思路。

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Poly-L-arginine regulate inflammatory mediator production by airway epithelial cells NCI-H292 in vitro

Tang Wei，F(xiàn)an Xiaoyun，Lu Zhaoshuang，et al
（Dept of Geriatric Pulmonology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the effect of interleukin（IL）-6，IL-8，IL-13，Eotaxin epithelial cells NCI-H292 by poly-L-arginine（PLA）.MethodsNCI-H292 cells were divided into control group（culture solution），lipopolysaccharide（LPS）group（5 μg/ml），PLA group（Max＝40 μg/ml），LPS＋PLA group and LPS＋PLA＋heparin group.The expressions of IL-6，IL-8，IL-13 and Eotaxin were determined by ELISA，and compared the differences among the groups.ResultsIL-6，IL-8 and Eotaxin levels in LPS＋PLA group were significantlyhigher than other groups（P＜0.05）；but there was no statistical significance among LPS group，PLA group and the control group（P＞0.05）；and also no statistical significance on IL-13 among each group（P＞0.05）；butheparin could reduce the levels of cytokines in LPS＋PLA group（P＜0.05）.ConclusionPLA can increase the expression of IL-6，IL-8，Eotaxin in NCI-H292 cells association with LPS，butheparin can inhibit the expression of cytokines；and therehas no effect on IL-13.

asthma；poly-L-arginine；interleukin-6；interleukin-8；interleukin-13；Eotaxin；heparin

R 256.12

A

1000－1492（2014）04－0427－04

2013－12－12接收

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：81100027）；安徽省高校省級自然科學(xué)研究項目（編號：KJ2011A176）；安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院博士啟動基金；安徽省人社廳第九批學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選學(xué)術(shù)科研活動資助

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科，合肥 230022

唐 偉，女，碩士研究生；范曉云，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：smallcloud2＠126.com