徐 鵬，宋斾文，章仁杰，劉 超，申才良

大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及分化研究

徐 鵬1，宋斾文1，章仁杰1，劉 超2，申才良1

目的建立新生SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的分離培養(yǎng)、體外分化、鑒定及體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法，并探討血清濃度對(duì)NSCs分化的影響。方法取新生SD大鼠大腦組織，用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)NSCs。采用免疫熒光技術(shù)對(duì)NSCs進(jìn)行鑒定，檢測(cè)其巢蛋白（Nestin）表達(dá)。用含有不同胎牛血清（FBS）濃度（2%、5%、10%）的DMEM/F-12培養(yǎng)基誘導(dǎo)NSCs分化，分別用神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）抗體、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體行免疫熒光染色鑒定分化細(xì)胞。通過(guò)Western blot法檢測(cè)不同F(xiàn)BS濃度的分化條件下MAP-2與GFAP的表達(dá)情況。結(jié)果獲得大量未分化且懸浮生長(zhǎng)的NSCs球，并能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。隨著血清濃度的增加，各組MAP-2的表達(dá)逐漸增加（P＜0.05），GFAP的表達(dá)逐漸減少（P＜0.05）。結(jié)論應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)可成功在體外培養(yǎng)出具有增殖、自我更新及多潛能分化能力的新生大鼠NSCs，可于含有不同F(xiàn)BS濃度（2%、5%、10%）的分化條件下進(jìn)一步分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，含低濃度血清的條件培養(yǎng)基促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化，而高濃度血清則有利于NSCs向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。

大鼠；神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；免疫印跡

干細(xì)胞是一類(lèi)可自我復(fù)制，同時(shí)又具有分化成多種組織細(xì)胞潛能的多能細(xì)胞。應(yīng)用干細(xì)胞的多向分化潛能，尤其是神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）這一分布于神經(jīng)系統(tǒng)的、具有自我更新和多分化潛能的細(xì)胞，能生成多種神經(jīng)細(xì)胞，特別是神經(jīng)元細(xì)胞，可有效地修復(fù)損傷的脊髓組織，重新建立神經(jīng)間的連接，治療脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）。早在1992年Reynolds et al［1］及Richards et al［2］從成年大鼠紋狀體及海馬中分離出了NSCs，隨后又在成年哺乳動(dòng)物大腦紋狀體的室管膜下和海馬的顆粒層發(fā)現(xiàn)了NSCs聚集區(qū)。該實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血清培養(yǎng)法進(jìn)行大鼠NSCs體外分離培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察其在體外增殖、分化等一系列細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)研究血清濃度對(duì)NSCs分化的影響，為細(xì)胞移植治療SCI的過(guò)程中如何進(jìn)一步改善有利于NSCs神經(jīng)生發(fā)的微環(huán)境提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24h內(nèi)新生SD大鼠幼鼠購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，共10只。

1.2 主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；B-27購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibrob last growth factor，bFGF）購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司；小鼠抗大鼠巢蛋白（Nestin）單克隆抗體、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、小鼠抗微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、Triton X-100購(gòu)于北京中杉金橋；南美胎牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；即用型正常山羊血清購(gòu)于武漢博士德公司；青鏈霉素溶液（100×）、Hoechst 33342、胰蛋白酶細(xì)胞消化液、免疫染色一抗稀釋液、免疫熒光染色二抗稀釋液、抗熒光淬滅封片液（強(qiáng)）購(gòu)于碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯影液試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1 NSCs原代培養(yǎng) 取新生24h內(nèi)的SD大鼠幼鼠，頸椎脫臼法處死，經(jīng)75%乙醇溶液浸泡5 min。在無(wú)菌條件下斷頭，剪開(kāi)頭皮及顱骨，分離出大腦半球，預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水漂洗3次后用顯微鑷剝除腦膜及血塊［3］。將組織塊移入另一干凈無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入1 ml生理鹽水，然后用眼科剪將腦組織切碎，形成約1 mm3組織小塊，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶細(xì)胞消化液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化10 min，移液槍輕輕吹打混勻細(xì)胞至不見(jiàn)組織碎片，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾形成單細(xì)胞懸液，以600 r/min離心5 min后棄上清液，加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基（DMEM/F-12＋2%B-27＋20 ng/ml EGF＋20 ng/ml bFGF＋青霉素100 U/ml＋鏈霉素0.1 mg/ml）再次600 r/min離心5 min，棄上清液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，以105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d半量換液1次，約1周傳代1次。

1.3.2 NSCs傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)2～3 d后，逐漸有細(xì)胞球形成，呈懸浮生長(zhǎng)，1周后，600 r/min離心5 min后吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，用吸管輕柔吹打細(xì)胞球成為小細(xì)胞球和單細(xì)胞懸液，按量將細(xì)胞懸液分別接種到新培養(yǎng)瓶中，1×105個(gè)細(xì)胞/瓶，每7 d傳代1次，每3 d離心更換半量培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)條件不變。

1.3.3 NSCs分化 取第2代培養(yǎng)7 d的細(xì)胞球，經(jīng)600 r/min離心5 min后，吸棄舊的無(wú)血清培養(yǎng)基，分別加入去除EGF、bFGF且含有不同F(xiàn)BS濃度（2%、5%、10%）的新鮮培養(yǎng)基（DMEM/F-12＋2% B-27＋青霉素100 U/ml＋鏈霉素0.1 mg/ml）重懸后，接種于放有0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被處理蓋玻片的6孔板中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d半量換液，7 d后行免疫熒光染色鑒定。

1.3.4 NSCs及分化后的免疫熒光鑒定 第2代培養(yǎng)7 d的細(xì)胞球，接種于有0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被處理蓋玻片的6孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱6h，用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛常溫下固定20 min，吸去多余殘液后用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次5 min，后在含0.1%TritonX-100的PBS液中孵育20 min，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入正常山羊血清工作液后置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，加入Nestin一抗（1∶50），4℃條件下孵育過(guò)夜，次日常溫下放置2h，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶100），37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1h，PBS漂洗3次，每次5 min，最后加入終濃度為10 μg/ml Hoechst溶液避光狀態(tài)下行細(xì)胞核染色5 min，PBS漂洗3次晾干后，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察及照相。

細(xì)胞球貼壁培養(yǎng)7 d后，取神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物GFAP、MAP-2行免疫熒光染色。重復(fù)以上步驟，MAP-2、GFAP一抗（1∶50）混合稀釋后加入各培養(yǎng)孔內(nèi)，添加二抗FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶100）及TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶100），熒光顯微鏡觀察及照相。

1.3.5 Western blot檢測(cè)NSCs分化前后Nestin、MAP-2、GFAP蛋白的表達(dá) 提取NSCs分化前及不同分化條件下分化后細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度選擇上樣量，依次行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗于4℃孵育過(guò)夜，次日洗膜，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2h，充分洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影并行膠片顯影定影處理。所使用抗體及稀釋度：Nestin（鼠單抗，1∶500稀釋?zhuān)?，MAP-2（鼠單抗，1∶200稀釋?zhuān)?，GFAP（兔多抗，1∶500稀釋?zhuān)?，?actin（鼠單抗，1∶1 000稀釋?zhuān)梗ㄉ窖蚩剐∈螅?∶5 000稀釋?zhuān)簧窖蚩雇茫?∶5 000稀釋?zhuān)?。膠片掃描后采用Image J軟件分析各組條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，檢驗(yàn)水平α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞接種后，在顯微鏡下觀察為懸浮的單個(gè)圓形細(xì)胞，邊界清楚，折光性強(qiáng)。接種2～3 d后，部分細(xì)胞死亡，單個(gè)細(xì)胞減少，大多數(shù)細(xì)胞分裂成小的細(xì)胞球，由單個(gè)細(xì)胞增殖形成。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞球的大小及數(shù)量明顯增大、增多，到第7天時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)出數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)細(xì)胞的集落，多呈球形、桑葚狀，折光性強(qiáng)，未見(jiàn)到明顯的細(xì)胞突起，部分細(xì)胞球因體積過(guò)大出現(xiàn)細(xì)胞球中心顏色暗淡、透光性較差。見(jiàn)圖1。

2.2 NSCs鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞球貼壁6h后，于顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞球外周細(xì)胞已伸出小突起，部分形態(tài)上已發(fā)生改變，行NSCs特異性Nestin抗體免疫熒光染色，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)形成的細(xì)胞球中大部分細(xì)胞表達(dá)Nestin陽(yáng)性。見(jiàn)圖1、2。

2.3 NSCs分化鑒定培養(yǎng)過(guò)程中，觀察到NSCs球逐漸貼壁，6h后已有部分細(xì)胞分化為具有1～2個(gè)短狀突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞，部分分化為具有多個(gè)長(zhǎng)突起并呈梭樣排列的神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，突起逐漸變長(zhǎng)、增多，與相鄰的細(xì)胞構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，至分化培養(yǎng)第7天，顯微鏡下可見(jiàn)各細(xì)胞球分化后向四周放射狀生長(zhǎng)，排列緊密，各細(xì)胞間覆蓋。免疫熒光染色結(jié)果可見(jiàn)GFAP陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及MAP-2陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞。提示所培養(yǎng)原代細(xì)胞具有多分化潛能，為NSCs，可分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。見(jiàn)圖1、2。

圖1 NSCs原代培養(yǎng)及分化

圖2 NSCs及分化后的免疫熒光鑒定

2.4 NSCs分化前后Nestin、MAP-2、GFAP蛋白的表達(dá)NSCs組Nestin蛋白明顯表達(dá)，2%FBS、5% FBS、10%FBS 3組未檢測(cè)出Nestin蛋白的表達(dá)。各組間MAP-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝80.440，P＜0.05），兩兩比較顯示，NSCs組MAP-2蛋白的表達(dá)顯著低于2%FBS組、5%FBS組、10% FBS組（P＜0.05）；與5%FBS組和10%FBS組相比較，2%FBS組的MAP-2表達(dá)顯著增加（P＜ 0.05）；5%FBS組的MAP-2表達(dá)較10%FBS組明顯增加（P＜0.05）。各組間GFAP蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝580.018，P＜0.05），兩兩比較顯示，NSCs組GFAP蛋白的表達(dá)顯著低于2%FBS組、5%FBS組、10%FBS組（P＜0.05）；與5%FBS組和10%FBS組相比較，2%FBS組的GFAP表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；10%FBS組的GFAP表達(dá)較5%FBS組明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)NSCs分化前后各組Nestin、MAP-2、GFAP蛋白的表達(dá)水平

3 討論

在NSCs治療SCI的相關(guān)研究中，移植外源性NSCs一直是主要的研究手段，此類(lèi)方法多是通過(guò)促進(jìn)移植到SCI部位的NSCs有效地向神經(jīng)元分化，促進(jìn)其神經(jīng)生發(fā)，從而形成彼此間的神經(jīng)通路，促進(jìn)脊髓重建及神經(jīng)修復(fù)的作用［4］。NSCs在移植到SCI區(qū)域后可分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，橋接脊髓斷端并重建脊髓傳導(dǎo)通路，改善損傷平面以下的運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)功能［5－6］。有研究［7－8］表明，將NSCs體外分化為膠質(zhì)細(xì)胞后移植，可促進(jìn)脊髓區(qū)空洞的修復(fù)，而將NSCs誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞后移植到SCI區(qū)域，可有效促進(jìn)損傷區(qū)脫髓鞘神經(jīng)的髓鞘化，但是有實(shí)驗(yàn)研究［9］顯示：移植到脊髓中的NSCs最終絕大部分分化成為星型膠質(zhì)細(xì)胞形成瘢痕，神經(jīng)生發(fā)的比例較低，進(jìn)一步阻礙了SCI區(qū)域神經(jīng)通路的建立。由此可見(jiàn)，如何正確處理NSCs體內(nèi)移植后的分化問(wèn)題是解決NSCs治療SCI的關(guān)鍵。

Nestin是一種中間絲蛋白，又稱(chēng)之為細(xì)胞骨架蛋白，該蛋白在多潛能的神經(jīng)外胚層細(xì)胞表達(dá)，但Nestin并非只在NSCs中表達(dá)，肌肉和胰島細(xì)胞中也有相應(yīng)的表達(dá)，因此并不能將其作為高特異性的表面標(biāo)志物來(lái)單獨(dú)鑒定NSCs［10］。一旦神經(jīng)前體細(xì)胞朝向終末方向分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，Nestin停止表達(dá)，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分別表達(dá)其特異性蛋白：MAP-2、GFAP。

在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用了去除bFGF、EGF且含有不同F(xiàn)BS濃度（2%、5%、10%）的DMEM/F-12培養(yǎng)基誘導(dǎo)NSCs分化，免疫熒光染色示Nestin表達(dá)（＋）的細(xì)胞球貼壁分化后含有GFAP表達(dá)（＋）的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及MAP-2表達(dá)（＋）的神經(jīng)元。這間接顯示了之前聚集形成的細(xì)胞球是由能夠自主分化形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元的NSCs組成，同時(shí)在NSCs的分化過(guò)程中，隨著血清濃度的增加，MAP-2蛋白表達(dá)量逐漸減少，GFAP蛋白表達(dá)量逐漸增多。這也直接表明血清濃度的高低決定NSCs的分化情況，低濃度血清的條件培養(yǎng)基促進(jìn)NSCs更多地向神經(jīng)元方向分化，而高濃度血清則有利于NSCs向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。

目前在NSCs的原代培養(yǎng)及增殖分化方面的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，在本次體外實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)調(diào)整條件培養(yǎng)基中血清含量的高低來(lái)影響NSCs分化的結(jié)果，以提高神經(jīng)元所占分化后細(xì)胞中的比例，但對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中NSCs的具體定位、遷移分化過(guò)程及其規(guī)律仍缺乏全面的認(rèn)識(shí)。如何更好地解決NSCs移植后的定向分化問(wèn)題仍是提高NSCs移植療效所必須面對(duì)的難題。

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Isolation，cultivation in vitro and differentiation of rat neural stem cells

Xu Peng，Song Peiwen，Zhang Renjie，et al
（Dept of Orthopedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo establish the isolation，differentiation，identification and long-term cultivation in vitro of the neural stem cells（NSCs）from neonatal SD rats，and to investigate the effect of the serum concentration on the differentiation of NSCs.MethodsBrain tissue was isolated from neonatal SD rats and NSCs were cultured in serum free medium.To identify NSCs and detect Nestin expression in NSCs by immunofluorescence.In the condition of DMEM/F-12 containing different concentrations（2%，5%，10%）of FBS to induct the differentiation of NSCs，to identify the differentiated cells with the antibodies of neuron specific microtubule-associated protein 2（MAP-2）and glial cell specific glial fibrillary acidic protein（GFAP）by immunofluorescence.In the differentiation conditionscontaining different concentrations of FBS，to detect the expression of MAP-2 and GFAP by Western blot.ResultsA mass of undifferentiated neurospheres were obtained and cultured in suspension，those NSCs could differentiate into neurons and astrocytes.With increasing serum concentrations，the expression of MAP-2 in each group gradually increased（P＜0.05），and the expression of GFAP gradually decreased（P＜0.05）.ConclusionWe successfully obtain the fetal rat NSCs in vitro，whichhave the capacities of proliferation，self-renew and pluripotentiality with the application of serum free cultivation.In the differentiation conditions containing different concentrations（2%，5%，10%）of FBS，NSCs differentiate into neurons and glial cells，the conditioned medium containing low concentration of serum promote the differentiation of NSCs into neurons，thehigh concentration of serum is conducive to the differentiation of NSCs into neural glial cells.

rat；neural stem cell；cell culture；Western blot

R 651.2

A

1000－1492（2014）04－0443－05

2014－02－17接收

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，組織工程干細(xì)胞研究所，合肥 230032

徐 鵬，男，碩士研究生；申才良，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shencailiang1616＠163.com