王 聰，白 麗*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

性病高危人群陰道乳酸桿菌的調(diào)查研究

王 聰1，2，白 麗1，2*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

目的：比較HIV性途徑感染女性高危人群及健康體檢人群陰道乳酸桿菌的檢出率及具有防御功能的乳酸桿菌檢出率，對(duì)高危組陰道防御能力做出正確評(píng)估，為更好地實(shí)施預(yù)防治療及干預(yù)活動(dòng)提供理論基礎(chǔ)。方法：選擇71例健康體檢者，120例性工作者陰道分泌物進(jìn)行乳酸桿菌陽(yáng)性率及具有防御功能的乳酸桿菌陽(yáng)性率檢測(cè)，確定高危人群組乳酸桿菌分布及防御能力。結(jié)果：高危人群組乳酸桿菌的檢出率及具有防御能力的乳酸桿菌檢出率均低于健康人群，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：性病的易感性與陰道的微環(huán)境的破壞，尤其乳酸桿菌數(shù)量的減少及防御能力的降低有著至關(guān)重要的關(guān)系。

性傳播疾?。桓呶Ｈ巳?；乳酸桿菌

性傳播疾?。╯exually transmitted disease，STD），是通過(guò)感染者經(jīng)性接觸傳播給未感染者，有20余種，包括至今仍無(wú)有效療法的致死性傳染病AIDS，性工作者是其傳播的主要橋梁〔1-2〕。性病病原體存在于感染者的生殖道分泌物中，性接觸時(shí)病原體可通過(guò)破損處侵入血液而感染，如陰道內(nèi)存在抑制性病病原體活性的因素可能會(huì)減少性病的感染及傳播，這種因素存在與否由陰道的防御系統(tǒng)決定的〔3-5〕。陰道防御系統(tǒng)是由陰道內(nèi)微生態(tài)菌群、陰道免疫系統(tǒng)及黏膜共同組成，其中陰道內(nèi)微生態(tài)的平衡在防御過(guò)程中起了主要作用。研究發(fā)現(xiàn)健康婦女陰道正常菌群中以乳酸桿菌（Lactobacillus）占主導(dǎo)地位，是最重要的優(yōu)勢(shì)菌。其可通過(guò)產(chǎn)酸、H2O2、細(xì)菌素等抗微生物物質(zhì)來(lái)抑制陰道病原微生物的入侵，維持陰道微生態(tài)平衡、抵抗性病及生殖道感染〔6-8〕。為了了解性病高危人群陰道防御情況，我們對(duì)其陰道乳酸桿菌的有無(wú)及功能進(jìn)行調(diào)查?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料 菌株：金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，銅綠假單胞菌，乳酸桿菌臨床分離株。細(xì)胞株：Hela細(xì)胞。

1.2 儀器設(shè)備及試劑 恒溫培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)、pH檢測(cè)儀、CO2培養(yǎng)箱、MH培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)液等。

2 方法

2.1 乳酸桿菌檢出率 分別取性病高危人群及健康體檢者陰道分泌物，用涂布法分離出分泌物中的細(xì)菌，對(duì)不同菌落進(jìn)行革蘭染色并鏡檢，根據(jù)菌落及鏡下形態(tài)將疑似乳酸桿菌接種于乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基，生長(zhǎng)者為乳酸桿菌。

2.2 乳酸桿菌功能的檢測(cè)

2.2.1 產(chǎn)酸功能檢測(cè) 將乳酸桿菌接種于pH值為7的MRS培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)48 h，通過(guò)pH測(cè)試儀檢測(cè)上清液的pH值，了解乳酸桿菌的產(chǎn)酸情況。

2.2.2 產(chǎn)H2O2功能的檢測(cè) 將乳酸桿菌分區(qū)接種于含有一定量TMB（3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺）-HRP（辣根過(guò)氧化物酶）的MRS平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，置于有氧環(huán)境中30 min后觀察顏色變化。產(chǎn)H2O2的乳酸桿菌菌落可在有氧存在的情況下，被培養(yǎng)基中的HRP催化，與底物TMB發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)藍(lán)色。

2.2.3 黏附功能的檢測(cè) 首先復(fù)蘇、轉(zhuǎn)接及處理黏附用細(xì)胞（Hela細(xì)胞）。將乳酸桿菌用PBS洗滌3遍（8 000 r/min，10 min）。用無(wú)抗生素和小牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)菌濃度為5×108個(gè)/mL。在細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中放置一片蓋玻片，向細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1 mL上述RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入1 mL乳酸桿菌懸浮液。輕柔晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使乳酸桿菌分散均勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。取出蓋玻片，并用PBS洗滌3遍，自然干燥后瑞士染色，油鏡下觀察細(xì)菌在Hela細(xì)胞上的黏附情況。

2.2.4 拮抗功能的檢測(cè) 用雙層平板法對(duì)乳酸桿菌抑制病原菌（本實(shí)驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌及銅綠假單胞菌3種病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株）的能力進(jìn)行篩選。用生理鹽水懸浮菌體并調(diào)整細(xì)菌濃度為6×108個(gè)/mL，點(diǎn)種于薄MRS固體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)1 h。用標(biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行比濁，制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊闹虏【鷳乙?。按菌液：MH半固體瓊脂培養(yǎng)基=1∶9的比例在40℃進(jìn)行充分混合，將約10 mL混合液倒入培養(yǎng)，使其均勻分布，37℃培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EXCEL軟件和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理。

3 結(jié)果

3.1 兩組人群乳酸桿菌檢出率 性病高危人群組乳酸桿菌陽(yáng)性率為22.5%，健康對(duì)照組乳酸桿菌陽(yáng)性率76.1%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 兩組人群陰道乳酸桿菌陽(yáng)性率比較

3.2 兩組人群乳酸桿菌產(chǎn)酸能力的比較 性病高危人群組乳酸桿菌培養(yǎng)上清液pH值中位數(shù)高于健康對(duì)照組，經(jīng)秩和檢驗(yàn)P=0.000＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。性病高危組上清液pH≤4.6占0%，pH＞5的占77.8%，介于兩者之間的占22.2%。健康陰道pH≤4.6占50%，pH＞5占22.2%，介于兩者之間的占27.8%。顯示高危組乳酸桿菌培養(yǎng)上清液pH值高于健康組，經(jīng)卡方檢驗(yàn)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。產(chǎn)酸乳酸桿菌的減少進(jìn)一步加重了高危人群陰道微環(huán)境被破壞。見(jiàn)表2。

3.3 兩組人群乳酸桿菌產(chǎn)H2O2能力比較 性病高危人群組產(chǎn)H2O2乳酸桿菌檢測(cè)率為40.7%，健康對(duì)照組產(chǎn)H2O2乳酸桿菌檢測(cè)率為77.8%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見(jiàn)高危組產(chǎn)H2O2乳酸桿菌檢測(cè)率明顯低于健康組。見(jiàn)表3。

3.4 兩組人群乳酸桿菌黏附能力比較 性病高危人群組具有黏附功能的乳酸桿菌檢測(cè)率為29.6%，健康對(duì)照組具有黏附功能的乳酸桿菌檢測(cè)率為85.2%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?jiàn)高危組具有黏附功能的乳酸桿菌檢測(cè)率明顯低于健康組。見(jiàn)表4。

表2 兩組人群乳酸桿菌產(chǎn)酸功能比較

表3 兩組人群陰道乳酸桿菌產(chǎn)H2O2功能比較

表4 兩組人群陰道乳酸桿菌黏附能力比較

3.5 兩組人群乳酸桿菌拮抗能力比較 性病高危人群組對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌有拮抗作用的乳酸桿菌檢出率分別為63%、44.4%、55.6%。健康對(duì)照組對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌有拮抗作用的乳酸桿菌檢出率分別為88.9%、83.3%、85.2%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別對(duì)兩組人群分離的乳酸桿菌拮抗3種病原菌能力進(jìn)行兩兩比較，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?jiàn)高危組具有黏附功能的乳酸桿菌檢測(cè)率明顯低于健康組，而乳酸桿菌對(duì)病原菌的拮抗能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5-7。

4 討論

乳酸桿菌是健康婦女陰道內(nèi)最重要的優(yōu)勢(shì)菌屬，乳酸桿菌數(shù)量減少甚至缺失是陰道微生態(tài)失衡的重要標(biāo)志之一，隨之而來(lái)的是陰道炎癥及性病的發(fā)生率增加。性病高危組陰道乳酸桿菌檢出率明顯低于健康組，可見(jiàn)乳酸桿菌的缺失是此組人群易患性病及生殖道炎癥的重要原因之一。乳酸桿菌主要就是通過(guò)它的黏附、產(chǎn)酸、產(chǎn)H2O2及拮抗作用對(duì)陰道進(jìn)行保護(hù)，其功能的好壞直接影響陰道防御能力的高低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)這些功能，以判斷性病高危組的陰道防御功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Hela細(xì)胞模型（Hela細(xì)胞是陰道宮頸癌細(xì)胞，與陰道上皮細(xì)胞（VEC）具有較高的同源性，其表面抗體及組成與VEC具有較大的相似性，可以基本反映細(xì)菌對(duì)于VEC的黏附情況）。對(duì)陰道源乳酸桿菌的黏附效果進(jìn)行了篩選。性病高危組中具有黏附能力乳酸桿菌檢出率為29.6%明顯低于對(duì)照組85.2%，經(jīng)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而致病菌感染陰道的首先步驟是入侵黏膜系統(tǒng)，有良好黏附能力的乳酸桿菌的黏附作用在該過(guò)程中起到了重要的防御作用，當(dāng)病原菌入侵時(shí)，乳酸桿菌首先和病原菌競(jìng)爭(zhēng)VEC表面的受體，取代病原菌與受體結(jié)合，阻止病原菌的初始黏附。隨后和這些病原菌發(fā)生凝集反應(yīng)，再通過(guò)產(chǎn)生酸、H2O2或細(xì)菌素樣等殺菌物質(zhì)來(lái)殺滅病原菌。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種人群陰道乳酸桿菌產(chǎn)生以上殺菌物質(zhì)的能力進(jìn)行了調(diào)查。發(fā)現(xiàn)高危組人群陰道乳酸桿菌產(chǎn)酸能力明顯低于對(duì)照組。有研究表明大多數(shù)病原菌甚至HIV對(duì)酸較敏感，乳酸桿菌可以通過(guò)分解乳酸降低陰道酸堿度，抑制殺傷病原菌，減少性病的發(fā)生〔9-11〕。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)高危組陰道產(chǎn)H2O2的乳酸桿菌陽(yáng)性率40.7%明顯低于對(duì)照組77.8%。而乳酸桿菌產(chǎn)生的H2O2可形成超氧化陰離子形成破壞性氫氧游離基（·OH），對(duì)病原菌的細(xì)胞壁的進(jìn)行強(qiáng)氧化作用及破壞核酸及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，從而殺傷病原菌。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌產(chǎn)生的H2O2對(duì)引起泌尿生殖道的感染的病原菌如加得納菌、淋球菌、念珠菌等有重要的抵抗作用〔12〕。此外乳酸桿菌還可以通過(guò)在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一些抑菌活性的物質(zhì)如細(xì)菌素，抑制及殺傷病原菌，保護(hù)陰道微環(huán)境，降低性病的感染及傳播。而本實(shí)驗(yàn)中高危人群抑制和殺傷病原菌的能力明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明高危人群陰道乳酸桿菌可產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力較低，陰道的防御能力也較低。

表5 兩組人群乳酸桿菌拮抗功能比較

表6 高危組乳酸桿菌對(duì)3種細(xì)菌拮抗功能比較

表7 健康組乳酸桿菌對(duì)3種細(xì)菌拮抗功能比較

乳酸桿菌通過(guò)以上的一種或者幾種機(jī)制來(lái)對(duì)致病菌起到拮抗作用。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，性病高危組具有黏附、產(chǎn)酸、產(chǎn)H2O2、產(chǎn)抑菌物質(zhì)功能的乳酸桿菌檢出率明顯低于健康組，高危組陰道的防御功能明顯低于健康組，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)防。而防御功能較好的乳酸桿菌菌株類型生長(zhǎng)特性、抑菌作用以及抗菌譜和體內(nèi)抗菌效果還有待于進(jìn)一步研究。

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*通訊作者：白麗，教授，博士.

（責(zé)任編輯 李 楊）

Primary Study on Lactobacillus from vaginal of High-risk Females in STD

WANG Cong1，2，BAI Li1，2*
（1.Pre-Clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective：To compare the quantity and the protection function of Lactobacillus in the vagina between the high-risk females in STD and the healthy group，and evaluate its defense capability，in order to provide a theoretical basis for implementing the prevention and treatment interventions.Methods：71 healthy women and 120 high-risk females in STD were selected.The rate of vaginal Lactobacilli and its function of producing the organic acids，hydrogen peroxide（H2O2），and other antimicrobial substances in vaginal secretions were detected to quantify the number and defensive ability of Lactobacilli of high risk population.Results：The positive rate of Lactobacillus，and the protection of the high-risk females in STD were lower than the healthy group.Conclusion：Susceptibility of STD has an important relationship with the damage of the micro environment of vaginal，especially the reduction of the amount and defense ability of Lactobacillus

STD；high risk group；Lactobacillus

R512.91

A

1672-2345（2014）04-0018-04

10.3969/j.issn.1672-2345.2014.04.006

“十一五”國(guó)家傳染病重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2008ZX10001-015）；大理學(xué)院青年教師科研基金資助項(xiàng)目（KYQN201109）

2013-12-22

2014-01-03

王聰，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事感染與免疫學(xué)研究.