常林，任玥，王紅霞

（功能材料的設(shè)計合成與綠色催化黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

偶氮熒光桃紅的固定化漆酶脫色及動力學(xué)研究*

常林，任玥，王紅霞

（功能材料的設(shè)計合成與綠色催化黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

采用交聯(lián)劑戊二醛將漆酶固載在Fe3O4/SiO2納米粒子上，用于偶氮熒光桃紅的脫色降解研究。試驗結(jié)果表明，固定化漆酶對10～70mg·L-1偶氮熒光桃紅脫色率均可達(dá)到90%以上，降解率可達(dá)到70%，降解效果明顯，而且固定化漆酶能夠重復(fù)使用。染料的脫色反應(yīng)動力學(xué)滿足一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律，固定化漆酶催化偶氮熒光桃紅的脫色反應(yīng)米氏常數(shù)Km值為567.27mg·L-1。

固定化漆酶；偶氮染料；脫色；動力學(xué)

偶氮染料是使用最為頻繁的染料，它廣泛應(yīng)用于皮革、紡織、化妝品、食品等行業(yè)[1，2]。偶氮染料是通過化學(xué)合成來生產(chǎn)的，自然界中不存在。所以偶氮染料的化學(xué)穩(wěn)定性高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有抗光抗氧化的能力，很難被微生物降解。因此，降解偶氮染料廢水的研究尤為重要[3]。

生物酶作為一種生物制劑，無毒無害，并且具有專一性、高效性、溫和性三大特性，在染料廢水處理中能有效地去除色度以及染料的降解，因而具有良好的應(yīng)用前景[4]。近年來，國際上對漆酶的固定化進(jìn)行了較廣泛的研究[5-7]，采用的固定化載體包括硅膠、活性炭、殼聚糖、親水性微濾膜和一些磁性材料。漆酶在經(jīng)過磁性Fe3O4/SiO2載體固定化后，化學(xué)穩(wěn)定性極大提高，高于游離漆酶，包覆均勻、尺寸均一、精小、磁分離性能良好。同時可以延長使用周期和壽命，又可以磁性回收，循環(huán)利用、降低成本。因此，近年來用磁性載體材料固定化漆酶越來越受到重視。

本實驗以磁性Fe3O4/SiO2為載體，成功實現(xiàn)了漆酶的固載，以期實現(xiàn)漆酶經(jīng)過固定化后其催化效率可以得到很大改善，使漆酶降解的脫色率進(jìn)一步提高。進(jìn)一步研究脫色降解偶氮熒光桃紅的動力學(xué)規(guī)律，為工業(yè)化的應(yīng)用開辟了廣闊的前景且具有重要的研究意義。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）；三氯化鐵（FeCl3·6H2O）；正硅酸乙酯（TEOS）；異丙醇；漆酶（Sigma-Aldrich）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS）；戊二醛（天津市科密歐化學(xué)試劑中心），偶氮熒光桃紅（阿拉丁試劑）。

Lambda45紫外可見分光光度計；DF-Ⅱ恒溫油浴鍋；JJ-1精密增力電動攪拌器。

1.2 固定化漆酶制備

將100mg Fe3O4/SiO2加入40mL乙醇中后超聲，加入0.2mLAPS,室溫攪拌12h后蒸餾水洗、磁分?jǐn)?shù)遍，即得到氨基修飾的Fe3O4/SiO2粒子。向載體中加入一定量的戊二醛，室溫下攪拌3～4h得到交聯(lián)的復(fù)合粒子，用PBS洗滌數(shù)遍后溶解在pH值為7.0的磷酸緩沖液中。稱取適量的漆酶溶解于PBS溶液中，再加入上述溶液中，室溫攪拌12h,洗滌，保存在pH值為7.0的磷酸緩沖液，即得到固定化漆酶，放入4℃的冰箱中，備用。

1.3 固定化漆酶對染料的脫色和吸附

用Lambda45紫外可見分光光度計在300～800nm波長范圍內(nèi)對偶氮熒光桃紅溶液掃描，測出最大吸光度的波長為531nm。取50mg固定化漆酶或載體與15mL質(zhì)量濃度分別為10～70mg·L-1偶氮熒光桃紅溶液反應(yīng)。測出反應(yīng)前后染料在531nm處的吸光度，從而測出脫色率和吸附率。

1.4 固定化漆酶米氏常數(shù)

將5、10、15、20、30、40、60、100mg·L-1偶氮熒光桃紅的溶液，測定531nm處吸光度變化從而得到固定化漆酶脫色的初速度.做出橫坐標(biāo)為以底物濃度（C）的倒數(shù)，縱坐標(biāo)為酶反應(yīng)初速度（v）的倒數(shù)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，由雙倒數(shù)法求得固定化酶的Km值和Vmax值。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化漆酶對偶氮熒光桃紅的脫色

2.1.1 時間對脫色率和吸附率的影響

圖1 反應(yīng)時間對偶氮熒光桃紅脫色和載體吸附的影響Fig.1 Effect of reaction time on decoloration of Azophioxine solution by immobilized laccase and support（adsorption）

從圖1中看出,反應(yīng)20min 10～70mg·L-1偶氮熒光桃紅溶液的脫色率明顯增加，達(dá)到90%以上，20min后隨著反應(yīng)時間的繼續(xù)升高，偶氮熒光桃紅溶液的脫色率變化趨于平緩，表明100min后固定化漆酶對偶氮熒光桃紅溶液的脫色比較充分。固定化漆酶對偶氮熒光桃紅的脫色具有降解和載體吸附兩部分作用，對偶氮熒光桃紅的吸附在10%左右。所以固定化漆酶對10～70mg·L-1的偶氮熒光桃紅溶液的降解率達(dá)到70%。在20min處，從10～50 mg·L-1，隨著染料濃度的增大，脫色率也隨之增大，分別為90.2%、94.6%、97.7%。但當(dāng)濃度為70mg·L-1時，脫色率下降為96%。說明染料濃度達(dá)到一定程度時，再繼續(xù)加大染料濃度，漆酶并不能實現(xiàn)染料的完全降解，更可能是一部分染料堵塞了漆酶的活性中心。

2.1.2 固定化漆酶對染料脫色的循環(huán)使用將10mg·L-1、pH值為7的偶氮熒光桃紅染料與固定化漆酶反應(yīng)，在25℃下振蕩反應(yīng)30min，測定脫色率。將反應(yīng)液磁分回收固定化漆酶，用pH值為7的PBS緩沖液洗滌多次，重新用于脫色反應(yīng)，如此重復(fù)8次。

圖2 固定化漆酶循環(huán)降解偶氮熒光桃紅染料Fig.2 Performance of immobilized laccase for decolorizing azophioxine solution for 8 cycl

由圖2可見，使用8次后脫色率較初始脫色下降了6%，說明固定化漆酶對偶氮熒光桃紅脫色具有較好的循環(huán)使用率。固定化漆酶具有較好的催化效率。

2.2 固定化漆酶脫色動力學(xué)研究

2.2.1 固定化漆酶的米氏常數(shù)（km）

圖3 染料濃度對反應(yīng)速率的影響Fig.3 Effect of reaction rate on initial concentration

由圖3中可以看出，在底物濃度較小時呈線性上升，當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大時，反應(yīng)速度增大緩慢，并逐漸平緩趨于極限值。這種趨勢說明，固定化漆酶催化的反應(yīng)，符合米氏方程所描述的反應(yīng)速率隨底物濃度的變化規(guī)律。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到Vmax的一半時所對應(yīng)的底物濃度就是米氏常數(shù)Km，它是反映漆酶對底物親和力的大小，Km的數(shù)值越小，說明底物與酶之間的親和力越強。

圖4 固定化漆酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plots for immobilized laccase

由圖4可知，以偶氮熒光桃紅為底物時，漆酶的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）分別為567.27和1.817mg·（L·min）-1。說明固定化漆酶與游離漆酶（游離漆酶測不出Km）相比，固定化漆酶對偶氮熒光桃紅具有更好的親和力。因此，固定化漆酶對偶氮熒光桃紅的催化迅速而有效。

2.2.2 固定化漆酶脫色動力學(xué)反應(yīng)級數(shù)將不同初始濃度的偶氮熒光桃紅,吸光度與反應(yīng)時間的變化關(guān)系按照一級反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行擬合，繪制ln（C0/Ct）與t曲線,見圖5。

圖5 不同偶氮熒光桃紅初始濃度時ln（C0/Ct）與t的關(guān)系Fig.5 Relationship of ln（C0/Ct）and t under different initial concentration of azophioxine

表1 偶氮熒光桃紅初始濃度對表觀一級速率常數(shù)k的影響Tab.1 Initial dye concentration on the reaction rate constant

由圖5可知,ln（C0/Ct）與t呈線性關(guān)系,見表1，反應(yīng)動力學(xué)相關(guān)系數(shù)都在99%左右，表明偶氮熒光桃紅脫色過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律。偶氮熒光桃紅的表觀一級反應(yīng)速率常數(shù)k隨初始濃度的增大而減小。

3 結(jié)論

固定化漆酶對偶氮熒光桃紅具有較好的降解效果，降解率能達(dá)到70%。隨著濃度的增加降解程度先增加后降低。固定化漆酶對偶氮熒光桃紅脫色具有較好的循環(huán)使用率。使用8次后脫色率較初始脫色率僅下降了6%。以偶氮熒光桃紅為底物時，固定化漆酶的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）分別為567.27和1.817mg·（L·min）-1。偶氮熒光桃紅脫色過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律，一級反應(yīng)速率常數(shù)k隨初始濃度的增大而減小。

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Study on degradation of azophloxine in the presence of immobilized laccase

CHANG Lin，REN Yue，WANG Hong－xia
（Key Laboratory of Design and Synthesis of Functional Materials and Green Catalysis,College of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Normal University,Harbin 150025,China）

The degradation of azophloxine in the presence of laccase immobilized on the amino－modified magnetic Fe3O4/SiO2nanoparticles was investigated in this study.When the concentration of azophioxine was in the 10～70mg·L－1，the decolorization percentage of azophioxine by immobilized laccase could reach over 90%and degradation percentage could reach 70%in sequential eight cycles.In the meantime,the kinetics of decolorization reaction was generally corresponding with first order reaction kinetics models.The Km values of immobilized laccase for azophioxine was 567.27mg·L－1.

immobilization of laccase；azo dye；decolorization；kinetics

TQ613.1

A

1002－1124（2014）03－0009－03

2013-01-17

黑龍江省自然科學(xué)基金（B201011）

常林（1987-），男，在讀碩士研究生，研究方向：染料廢水降解。

導(dǎo)師簡介：王紅霞（1974-），女，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事多孔材料、Fe3O4/SiO2基負(fù)載型催化劑的設(shè)計、制備及甲烷轉(zhuǎn)化、有機污染物的去除等催化反應(yīng)的研究。