李 欣，畢 陽，王軍節(jié)，龔 迪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

果實(shí)的成熟衰老是高度協(xié)調(diào)、不可逆轉(zhuǎn)的復(fù)雜過程，涉及大量基因表達(dá)和生理生化等代謝[1]，這些過程不僅受生長發(fā)育階段和激素水平的影響，還受采后處理和貯藏條件的調(diào)控[2-3]。成熟衰老作為果實(shí)發(fā)育的最后階段，直接影響著果實(shí)的采后壽命和品質(zhì)[4]。

蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，可系統(tǒng)地研究果實(shí)生理生化以及與成熟衰老相關(guān)的功能性蛋白或者基因的變化，動(dòng)態(tài)描述蛋白水平的表達(dá)差異，并鑒定出與其具體變化相關(guān)的蛋白或基因，分析不同生長時(shí)期、不同環(huán)境條件對(duì)果實(shí)生命過程的影響，從蛋白質(zhì)水平上揭示各種生理過程的分子機(jī)理，為果實(shí)成熟衰老機(jī)理的研究提供全新的技術(shù)方法[5-7]。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用對(duì)于從更深層次揭示果實(shí)的成熟衰老及品質(zhì)形成機(jī)制具有重要意義。本文綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)在躍變型和非躍變型果實(shí)成熟衰老機(jī)理方面的研究進(jìn)展，并提出了存在的不足及今后的發(fā)展趨勢。

1 躍變型果實(shí)

1.1 番茄

作為模式植物，番茄被廣泛用于成熟衰老機(jī)理的研究。Rocco等[8]利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究了兩個(gè)當(dāng)?shù)仄贩N在成熟過程中蛋白質(zhì)的變化，鑒定出83個(gè)蛋白點(diǎn)，其中涉及氧化還原控制、防衛(wèi)脅迫反應(yīng)、碳代謝、能量生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生理反應(yīng)，該研究首次表征了番茄果實(shí)在成熟過程中的蛋白組變化圖譜。Faurobert等[9]利用雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）分析了櫻桃番茄果皮在6個(gè)不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)變化，并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatogram-mass spectrometer，LC-MS）鑒定出90種蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，幼果中與氨基酸代謝和蛋白質(zhì)合成的蛋白點(diǎn)主要在細(xì)胞分裂期表達(dá)，之后下調(diào)；在細(xì)胞膨大期，與光合作用和細(xì)胞壁形成的蛋白點(diǎn)暫時(shí)性增加；相反，涉及到碳化合物和糖代謝以及氧化過程的蛋白質(zhì)卻在此過程中下調(diào)，而在成熟果實(shí)中其豐度達(dá)到最大，與脅迫響應(yīng)和果實(shí)衰老相關(guān)蛋白點(diǎn)的變化規(guī)律也同上述結(jié)果一致，該研究從蛋白組水平上豐富了果實(shí)成熟衰老的分子基礎(chǔ)。Barsan等[10]研究了紅番茄果實(shí)中有色體的蛋白質(zhì)組學(xué)，通過Western blotting分析鑒定出988個(gè)蛋白點(diǎn)，涉及到參與香氣物質(zhì)合成的脂氧合酶途徑的所有蛋白、淀粉合成和降解的蛋白、葉綠素降解的蛋白、卡爾文循環(huán)和磷酸戊糖途徑的全套蛋白，但缺少葉綠素合成的蛋白以及關(guān)于類囊體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的蛋白，這些結(jié)果為研究番茄有色體的代謝特點(diǎn)以及解釋果實(shí)的成熟機(jī)理提供了新的思路。Konozy等[11]運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、LC-MS/MS）研究了3種成熟番茄果實(shí)蛋白質(zhì)組，并比較了它們的質(zhì)地特性，鑒定出25種細(xì)胞壁蛋白，分別參與了多糖、脂質(zhì)、氧化還原等代謝，為揭示果實(shí)的成熟衰老提供了重要線索。

1.2 桃

Prinsi等[12]分析了兩個(gè)品種的桃在不同果肉硬度時(shí)期的差異蛋白表達(dá)情況，53個(gè)蛋白點(diǎn)在成熟過程中發(fā)生了顯著變化，其中39個(gè)用LC-ESI-MS/MS鑒定出來，這些蛋白質(zhì)既參與了基礎(chǔ)代謝（糖類、有機(jī)酸、氨基酸）和乙烯合成，又涉及了次級(jí)代謝和脅迫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）在果實(shí)從呼吸躍變前期向躍變期轉(zhuǎn)化的過程中豐度變化較大，其他參與乙烯代謝的相關(guān)蛋白，如硫腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）合成酶和β-氰丙氨酸合成酶也被鑒定出來。同時(shí)，蔗糖合成酶和α-淀粉酶的豐度變化暗示了兩個(gè)品種的成熟桃果實(shí)在糖代謝活力方面存在差異性。另外，一些典型的活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除酶在兩個(gè)品種之間也呈現(xiàn)差異積累。Hu Hao等[13]分析了桃果實(shí)內(nèi)果皮和中果皮在花后28～59 d的差異蛋白質(zhì)，結(jié)果表明，68種蛋白質(zhì)在此過程中差異表達(dá)，其中大多數(shù)參與了初級(jí)和次級(jí)代謝；內(nèi)果皮中的大多數(shù)參與初級(jí)代謝的蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，但丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）豐度卻增加，而且，其表達(dá)模式與木質(zhì)素含量的增加呈線性正相關(guān)，表明PDH在木質(zhì)化作用中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)數(shù)據(jù)顯示涉及木質(zhì)素和黃酮類代謝的相關(guān)酶類在內(nèi)果皮發(fā)育過程中的表達(dá)具有時(shí)空性，且這兩種途徑存在競爭性。此外，氧化脅迫蛋白只在內(nèi)果皮中觀察到，推測其在激活木質(zhì)化作用和后續(xù)程序性細(xì)胞死亡中發(fā)揮作用。Qin Guozheng等[14]利用2-DE結(jié)合Immunoblotting研究了桃果實(shí)衰老過程中線粒體蛋白的變化，結(jié)果顯示個(gè)別線粒體蛋白、三羧酸循環(huán)酶、抗氧化蛋白的氧化損傷與線粒體生物學(xué)功能的喪失密切相關(guān)，最終導(dǎo)致果實(shí)衰老。

1.3 蘋果

Guarino等[15]通過經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（2-DE、MALDI-TOF-MS和μLC-ESI-IT-MS/MS）分析了蘋果果肉中主要可溶性化合物，利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫最終鑒定出44個(gè)蛋白點(diǎn)，涉及到28種蛋白質(zhì)，分別參與了能量生成、成熟和脅迫響應(yīng)等重要生理過程。Qin Guozheng等[16]研究了蘋果衰老過程中線粒體蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化，并深入分析了活性氧對(duì)衰老的影響，此研究表明ROS可能是通過改變一些線粒體蛋白的表達(dá)并使其生物學(xué)功能喪失來調(diào)控果實(shí)的成熟衰老。

1.4 香蕉

Toledo等[17]應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳（twodimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）研究了香蕉果實(shí)在成熟過程中蛋白的變化，共鑒定出26個(gè)蛋白點(diǎn)，豐度最大的是幾丁質(zhì)酶，熱激蛋白、異黃酮還原酶、果膠裂解酶、蘋果酸脫氫酶、淀粉磷酸化酶及乙烯合成相關(guān)酶也有所積累。此研究提供了關(guān)于香蕉果實(shí)成熟過程中與風(fēng)味、質(zhì)地、防衛(wèi)、乙烯合成、表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)折疊有關(guān)的蛋白質(zhì)變化信息。

1.5 芒果

Andrade等[18]應(yīng)用2D-DIGE對(duì)比了芒果果實(shí)在呼吸躍變前期和呼吸躍變時(shí)的蛋白質(zhì)豐度變化，利用LC-MS/MS鑒定出47個(gè)差異蛋白點(diǎn)。結(jié)果顯示，與激素合成相關(guān)的蛋白質(zhì)豐度下降，而與分解代謝和脅迫反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)在成熟過程中呈積累趨勢。

1.6 番木瓜

Nogueira等[19]比較了番木瓜果實(shí)在呼吸躍變前期和呼吸躍變時(shí)的蛋白質(zhì)組變化。運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定了37個(gè)顯著差異的蛋白點(diǎn)，其中27種蛋白質(zhì)被分為六大類，分別為糖代謝、次級(jí)代謝、乙烯的合成與調(diào)控、能量代謝、脅迫反應(yīng)、貯藏蛋白。

1.7 杏

Ambrosio等[20]利用1D和2D技術(shù)分離了杏果實(shí)3個(gè)不同成熟階段的蛋白質(zhì)，在2D圖譜上106個(gè)蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)差異性積累，進(jìn)一步運(yùn)用MALDI-TOF-PMF和nanoLC-ESILIT-MS/MS對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，大部分蛋白質(zhì)作為酶類涉及糖類和能量代謝、有機(jī)酸代謝、乙烯的生物合成、細(xì)胞壁重建、脅迫響應(yīng)等生化過程，另外一些與果實(shí)的感官品質(zhì)密切相關(guān)，該研究提供了杏果實(shí)成熟過程的初步相關(guān)信息。

2 非躍變型果實(shí)

2.1 葡萄

Negri等[21]利用LC-ESI-MS/MS鑒定出葡萄皮中的69個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白質(zhì)參與了脅迫反應(yīng)（38%）、糖酵解和糖異生（13%）、碳化合物和糖代謝（13%）、氨基酸代謝（10%）等生理過程。在不同的成熟時(shí)期，葡萄皮中的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)差異分布，涉及光合作用、糖代謝和脅迫反應(yīng)的蛋白質(zhì)在顏色變化初期過表達(dá)，而在顏色變化后期，參與花青素合成的蛋白質(zhì)過表達(dá)，在采收期，關(guān)鍵的防衛(wèi)反應(yīng)蛋白質(zhì)豐度上調(diào)。需要特別指出的是，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的豐度上調(diào)，與這些酶在成熟過程中的活性增加相一致[22]。Sarry等[23]提取了6個(gè)不同品種葡萄中果皮里的主要可溶性蛋白，在2D圖譜上發(fā)現(xiàn)了大約300個(gè)蛋白點(diǎn)，利用MALDI-MS鑒定出67種蛋白質(zhì)，分別參與了能量代謝（34%）、防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)（19%）、初級(jí)代謝（13%）等過程，2-DE分析發(fā)現(xiàn)，脫水蛋白、蔗糖酶以及病程相關(guān)蛋白在成熟果實(shí)中大量積累，同時(shí)觀察到乙醇脫氫酶和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在6個(gè)品種中的表達(dá)存在顯著差異。Wang Wei等[24]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了β-1,3-葡聚糖酶在葡萄果實(shí)不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，果皮中的β-1,3-葡聚糖酶豐度高于果肉中，說明其表達(dá)具有組織特異性，同時(shí)也暗示β-1,3-葡聚糖酶可能與葡萄果實(shí)的成熟有關(guān)。Zhang Jiangwei等[25]研究了葡萄原生質(zhì)膜蛋白在成熟過程中的表達(dá)情況，鑒定出了62個(gè)蛋白點(diǎn)，包括ATP合成酶、GTP結(jié)合酶等，參與了轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等反應(yīng)。在果實(shí)成熟過程中，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)膜蛋白總量逐漸下降，泛素水解蛋白和細(xì)胞骨架蛋白豐度上調(diào)，泛素結(jié)合酶E2-21豐度下調(diào)。Giribaldi等[26]的研究結(jié)果證明了在葡萄成熟過程中，大多數(shù)蛋白質(zhì)與能量、代謝、蛋白質(zhì)合成有關(guān)，少數(shù)與脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)及多數(shù)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了差異表達(dá)。

2.2 柑橘

Katz等[27]利用LC-MS/MS技術(shù)及已有的NCBI-nr和柑橘ESTs數(shù)據(jù)庫分析了柑橘蛋白質(zhì)組，從代謝的角度系統(tǒng)研究了柑橘成熟過程中的蛋白質(zhì)變化情況。Muccilli等[28]運(yùn)用2-DE結(jié)合LC-MS/MS鑒定出了成熟甜橙果肉中差異表達(dá)的55種蛋白質(zhì)，其中與糖代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)在Moro中過表達(dá)，而與脅迫反應(yīng)相關(guān)的在Cadenera中過表達(dá)，而且證實(shí)了在Moro中參與次級(jí)代謝和氧化過程的蛋白質(zhì)在花青素合成的過程中具有重要作用。Pan Zhiyong等[29]通過2-DE結(jié)合MALDI-TOF-TOF MS分析了突變體“Hong Anliu”甜橙及其野生型4個(gè)成熟階段果肉的蛋白質(zhì)組變化，在鑒定出的74種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，大部分參與了脅迫響應(yīng)，糖/能量代謝與調(diào)控及蛋白質(zhì)命運(yùn)、修飾與降解。尤其值得注意的是，在突變體中6種抗氧化酶的表達(dá)水平有所改變，分析其相對(duì)酶活發(fā)現(xiàn)突變體果實(shí)的抗氧化能力較強(qiáng)，暗示氧化脅迫對(duì)類胡蘿卜素的形成有調(diào)控作用。鐘鳳林[30]以琯溪蜜柚汁胞為材料，利用雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)汁胞的不同發(fā)育階段進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，建立了適合琯溪蜜柚汁胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)，獲得與汁胞發(fā)育、成熟和衰老相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，共檢測到1037±60個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中有100個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同發(fā)育時(shí)期上調(diào)表達(dá)，217個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)表達(dá)，選取50個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的汁胞差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，根據(jù)蛋白質(zhì)的功能可以把他們劃分為調(diào)控蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、能量代謝、細(xì)胞骨架、防衛(wèi)反應(yīng)、代謝酶等，為揭示琯溪蜜柚汁胞在發(fā)育成熟過程中某些關(guān)鍵的生理活動(dòng)提供了一定的理論依據(jù)。

2.3 草莓

Bianco等[31]通過多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、單向SDS-PAGE結(jié)合納升級(jí)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定了蛋白質(zhì)，利用DIGE技術(shù)研究了草莓果實(shí)成熟過程中差異積累的蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)參與了能量和碳代謝、蛋白質(zhì)合成與貯藏、蛋白質(zhì)水解、脅迫反應(yīng)等過程，并關(guān)聯(lián)了與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)。

2.4 荔枝

李開拓[32]以荔枝品種“烏葉”和“下番枝”果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)荔枝果實(shí)不同成熟時(shí)期進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，獲得了與荔枝果實(shí)成熟衰老相關(guān)的差異蛋白。這些蛋白質(zhì)參與了糖和能量代謝、蛋白質(zhì)合成與代謝以及穩(wěn)定、基因表達(dá)調(diào)控、抗氧化、氨基酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程，該研究為揭示荔枝果實(shí)成熟過程中有關(guān)生理事件創(chuàng)造了良好的技術(shù)平臺(tái)。

表1 果實(shí)成熟衰老過程中差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能分類Table 1 Functional classification of differentially expressed proteins during fruit ripening and senescence

綜上所述，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出的果實(shí)成熟衰老過程中的相關(guān)蛋白質(zhì)根據(jù)其生物學(xué)功能主要分為以下幾大類（表1）。其中，普遍涉及了基礎(chǔ)代謝、防衛(wèi)脅迫反應(yīng)和能量生成等過程，因而從蛋白質(zhì)表達(dá)水平上揭示果實(shí)的成熟衰老機(jī)理提供了有力的依據(jù)。另外，線粒體是細(xì)胞內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞器，在能量產(chǎn)生以及細(xì)胞代謝中起主要作用，研究線粒體蛋白質(zhì)氧化損傷將為活性氧調(diào)控果實(shí)成熟衰老的機(jī)制提供新的思路。

3 結(jié) 語

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)在果實(shí)成熟衰老研究中主要側(cè)重于鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并依據(jù)其生物學(xué)功能進(jìn)行分類，但對(duì)這些蛋白質(zhì)在其參與的重要生理代謝過程中的變化規(guī)律及作用的深入研究相對(duì)較少。一些細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體、細(xì)胞核等在果實(shí)成熟衰老過程中發(fā)揮著重要作用，但對(duì)其相關(guān)蛋白質(zhì)組的研究也鮮見報(bào)道。由于果實(shí)組織的結(jié)構(gòu)特殊，加之種類繁多，成熟衰老過程多樣，僅僅利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)難以全面揭示其成熟衰老機(jī)理。

因此，今后在運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究果實(shí)成熟衰老機(jī)理時(shí)，應(yīng)在傳統(tǒng)2-DE的基礎(chǔ)上，著重利用非電泳分離技術(shù)如LC-MS/MS、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobarictags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）[33]、同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）[34]及Immunoblotting等，并結(jié)合EST數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)果實(shí)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)還需要與其他生物組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)[35]、代謝組學(xué)[36]）有機(jī)結(jié)合，才能深入了解關(guān)鍵蛋白質(zhì)及編碼相關(guān)蛋白的基因在重要生理活動(dòng)中的準(zhǔn)確作用，更全面和系統(tǒng)地闡明果實(shí)成熟衰老的分子機(jī)理。

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