梅 美，李曉蕾，張 寧

·技術(shù)與方法·

口腔全菌生物膜對(duì)新型抗菌性復(fù)合樹脂表面粗糙度的影響

梅 美，李曉蕾，張 寧

目的體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究口腔全菌生物膜對(duì)含有甲基丙烯酸十二烷基二甲銨（dimethylaminododecylmethacrylate，DMADDM）的抗菌復(fù)合樹脂材料表面粗糙度的影響，從而評(píng)價(jià)材料的性能及其臨床應(yīng)用前景。方法合成DMADDM并將其添加入復(fù)合樹脂中，將含有和不含有DMADDM的復(fù)合樹脂作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，使用人唾液培養(yǎng)所得到牙菌斑全菌生物膜模型來研究生物膜，檢測(cè)菌落形成單位（colony forming unit，CFU）計(jì)數(shù)及生物膜活／死細(xì)菌染色，并檢測(cè)口腔全菌生物膜培養(yǎng)7 d前后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料表面粗糙度的差異。結(jié)果添加DMADDM的實(shí)驗(yàn)組復(fù)合樹脂顯著降低了CFU計(jì)數(shù)（P＜0.01），與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)CFU計(jì)數(shù)均降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)。菌斑生物膜培養(yǎng)7 d后，實(shí)驗(yàn)組復(fù)合樹脂表面粗糙度沒有明顯變化（P＞0.05），而對(duì)照組復(fù)合樹脂表面粗糙度明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論含有DMADDM的復(fù)合樹脂材料具有很強(qiáng)的抗菌性，能夠抵抗口腔環(huán)境對(duì)材料表面老化粗糙的影響，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

復(fù)合樹脂；菌斑生物膜；抗菌性能；表面粗糙度

復(fù)合樹脂因具有優(yōu)良的美學(xué)效果，以及簡(jiǎn)便的臨床操作過程等優(yōu)勢(shì)，近年來被廣泛應(yīng)用于修復(fù)牙體缺損和改善牙齒外觀［1］。但研究表明，較其他口腔修復(fù)材料，復(fù)合樹脂更容易在表面堆積菌斑生物膜［2］。菌斑生物膜是引起繼發(fā)齲和修復(fù)失敗的主要原因［3］，一方面會(huì)直接引起某些口腔軟硬組織感染性疾病如繼發(fā)齲、義齒性口炎；另一方面則能造成材料的老化粗糙，導(dǎo)致材料性能下降，從而更易吸引細(xì)菌黏附［4］。這樣的惡性循環(huán)最終將會(huì)造成修復(fù)失敗，甚至對(duì)全身產(chǎn)生不良影響。因此，研究抗菌復(fù)合樹脂，抑制菌斑生物膜生長和繼發(fā)齲發(fā)生至關(guān)重要。季銨鹽類的單體，如甲基丙烯酸十二烷基二甲銨（dimethylaminododecyl methacrylate，DMADDM），可以共聚合到樹脂基之中，使其產(chǎn)生抗菌活性，且不損害樹脂的機(jī)械性能［5］?？删酆霞句@鹽是一種有效的抗菌單體，它的分子結(jié)構(gòu)中同時(shí)具有能與樹脂單體發(fā)生反應(yīng)的可聚合基團(tuán)和抗菌功能基團(tuán)，單體通過聚合反應(yīng)牢牢固定于樹脂基質(zhì)上，在固化后抗菌活性成分不釋放，發(fā)揮持久、穩(wěn)定的接觸抗菌功能［6］。本研究在體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究口腔全菌生物膜對(duì)含有DMADDM的抗菌復(fù)合樹脂材料表面粗糙度的影響，從而評(píng)價(jià)材料的性能及其臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 含有DMADDM的抗菌復(fù)合樹脂的制備

DMADDM烷基鏈長為12個(gè)碳。使用改良門舒特金法（Menschutkin）制備DMADDM，由叔胺基與有機(jī)鹵化物發(fā)生反應(yīng)［5］。將2-溴乙基甲基丙烯酸酯（2-bromo ethylmethacrylate，BEMA）作為有機(jī)鹵化物，1-二甲氨基十二烷（1-dimethylamino dedecane，DMAD）作為叔胺。將10mmol的DMAD（日本，Tokyo Chemical Industry公司），10 mmol的BEMA（美國，Monomer-Polymer and Dajac Labs），以及3 g乙醇加入20 mL的試劑瓶中。試劑瓶封口，并在70℃中攪拌24 h。反應(yīng)完全后蒸發(fā)乙醇溶劑，最終得到清澈、無色的黏性液態(tài)DMADDM。

雙酚A-甲基丙烯酸縮水甘油酯和雙甲基丙烯酸二縮三乙二醇酯（美國，Esstech公司）按照1∶1混合，并混入0.5%的光引發(fā)劑樟腦醌，從而構(gòu)成樹脂基質(zhì)［5］。DMADDM按1∶10混入樹脂基質(zhì)中。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，DMADDM大于10%將影響復(fù)合樹脂的機(jī)械強(qiáng)度。樹脂基質(zhì)與經(jīng)過硅烷化處理的無機(jī)填料（美國，Caulk Dentsply公司）按3∶7混合。將含DMADDM的復(fù)合樹脂作為實(shí)驗(yàn)組，將不含DMADDM的復(fù)合樹脂作為對(duì)照組。

每個(gè)試件均制作成直徑10 mm、厚2 mm的圓柱形試件，制作時(shí)兩面用賽璐珞條形成光滑壓接面。每個(gè)試件每個(gè)表面光固化1min，然后將試件浸入蒸餾水，攪拌1 h，以除去任何未固化的單體。取出試件干燥并用環(huán)氧乙烷消毒（Anprolene AN 74i，美國，Andersen公司）。每個(gè)測(cè)試，每組6個(gè)試件。

1.2 人唾液的收集和菌斑生物膜的形成 人唾液［7］的捐贈(zèng)者是擁有天然牙列，無活動(dòng)性齲病或牙周病的健康成年人，并在過去的3個(gè)月內(nèi)沒有使用過抗生素。捐贈(zèng)人24 h不刷牙，并在捐贈(zèng)唾液前至少2 h禁飲食。收集捐贈(zèng)者在咀嚼封口膜的過程中分泌的刺激性唾液，并置于冰上。唾液在無菌甘油中稀釋至70%，并儲(chǔ)存在－80℃下［8］。

唾液與McBain培養(yǎng)基溶液以1∶50混合作為人全菌生物膜的接種液。McBain培養(yǎng)基中含有黏蛋白2.5 g／L、細(xì)菌蛋白胨2.0 g／L、胰蛋白胨2.0 g／L、酵母提取物1.0 g／L、氯化鈉0.35 g／L、氯化鉀0.2 g／L、氯化鈣0.2／L、鹽酸半胱氨酸0.1 g／L、血紅素0.001 g／L、維生素K10.000 2 g／L，材料均購自美國Sigma-Aldrich公司，pH值調(diào)整為7［9］。將接種液在37℃下，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24孔培養(yǎng)板每個(gè)孔放入1個(gè)試件，各孔中加入1.5mL接種液，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。然后將試件轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。16 h后，將試件轉(zhuǎn)移至新的24孔板中用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最終得到培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜。

1.3 生物膜活／死細(xì)菌染色方法 使用前面提到的培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜進(jìn)行檢測(cè)。將圓柱形試件上的生物膜在磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）中輕柔漂洗3次，用活／死細(xì)菌生存力試劑盒（美國，Molecular Probes公司）進(jìn)行染色。SYTO-9使活細(xì)菌染色產(chǎn)生綠色熒光，細(xì)胞膜受損的細(xì)菌會(huì)被碘化丙啶染色產(chǎn)生紅色熒光。使用螢光顯微鏡觀察染色的生物膜（TE2000-S，美國，Nikon公司）。

1.4 CFU計(jì)數(shù) 將培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜圓柱形試件轉(zhuǎn)移到2 mL試管中，通過超聲震動(dòng)收獲生物膜，再用渦旋混合震蕩儀混勻（美國，F(xiàn)isher公司）。使用3種瓊脂平板培養(yǎng)測(cè)定CFU。首先，用胰蛋白大豆血瓊脂培養(yǎng)板進(jìn)行全菌測(cè)定［9］。再用含有15%的蔗糖的輕型唾液鏈球菌瓊脂（mitis salivarius agar，MSA）培養(yǎng)板來進(jìn)行總鏈球菌測(cè)定［10］。這是因?yàn)镸SA含有結(jié)晶紫、亞碲酸鉀和臺(tái)盼藍(lán)等選擇性抑菌劑，能抑制大多數(shù)革蘭陰性桿菌和除鏈球菌外的大多數(shù)革蘭陽性菌，選擇性地使鏈球菌生長。第三，用加0.2 U／mL的桿菌肽的MSA培養(yǎng)板來測(cè)定變形鏈球菌。

1.5 表面粗糙度的測(cè)定 采用粒度越來越細(xì)的金剛砂紙和自動(dòng)拋光機(jī)（日本，Buehler公司）在注水的條件下將試件的表面逐級(jí)拋光，最細(xì)到粒度4 000目。試件在拋光后直接測(cè)試表面粗糙度，然后經(jīng)過7 d的菌斑生物膜培養(yǎng)（前2 d培養(yǎng)方法如前所述，以后每天更換1次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7 d），將試件在PBS中漂洗，并通過超聲震動(dòng)徹底清除表面生物膜，然后進(jìn)行表面粗糙度的測(cè)試。對(duì)每個(gè)試件的拋光面中心區(qū)進(jìn)行粗糙度的測(cè)定，每個(gè)試件變換角度測(cè)試3次，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。粗糙度是衡量物體表面平滑程度的量化指標(biāo)，以觸針垂直位移的微米（μm）數(shù)表示。粗糙度的測(cè)定采用粗糙度測(cè)試儀Surfcom470A（日本，Tokyo Seimitu公司），在垂直倍率5 000、運(yùn)行速度為0.1 mm／s、基準(zhǔn)長度2.5 mm、切入值（cut-off值）為0.8 mm的條件下，測(cè)定中心線平均粗糙度（Ra）值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，選用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物膜染色 生物膜活／死細(xì)菌的染色見圖1。活細(xì)菌染成綠色，死細(xì)菌染成紅色。接近或重疊的活／死細(xì)菌會(huì)顯示出橙黃色。對(duì)照組（圖1A）復(fù)合樹脂表面覆蓋有大量的活細(xì)菌。相比之下，實(shí)驗(yàn)組（圖1B）復(fù)合樹脂表面的菌斑生物膜主要染成紅／橙色，結(jié)果顯示含有DMADDM的復(fù)合樹脂有強(qiáng)的抗菌活性。

圖1 生物膜活／死細(xì)菌染色

2.2 CFU計(jì)數(shù) 全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌見圖2。與對(duì)照組相比，添加DMADDM的實(shí)驗(yàn)組復(fù)合樹脂顯著降低了CFU計(jì)數(shù)（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)CFU計(jì)數(shù)均降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖2 CFU計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 復(fù)合樹脂表面粗糙度 菌斑生物膜培養(yǎng)前后復(fù)合樹脂表面的粗糙度見圖3。結(jié)果顯示，培養(yǎng)前實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料表面粗糙度差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），菌斑生物膜培養(yǎng)7 d后實(shí)驗(yàn)組復(fù)合樹脂表面粗糙度變化差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而對(duì)照組復(fù)合樹脂表面粗糙度明顯增加（P＜0.01）。

圖3 菌斑生物膜培養(yǎng)7 d前后復(fù)合樹脂表面的粗糙度

3 討論

光固化復(fù)合樹脂是在20世紀(jì)60年代被引入牙科領(lǐng)域，該材料具有色澤美觀、強(qiáng)度高、黏結(jié)固位效果好、良好的可塑性以及固化后可打磨、拋光等優(yōu)點(diǎn)，通過配制黏度適當(dāng)?shù)幕旌蠞{體，經(jīng)過特定的光照射后固化，即可用于牙齒的缺損修復(fù)，因此在牙科修復(fù)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注［1］。研究表明，復(fù)合樹脂材料表面較其他修復(fù)材料更容易堆積菌斑和生物膜［2］。菌斑則是引發(fā)繼發(fā)齲和修復(fù)失敗的主要原因［3］。因此，如何賦予復(fù)合樹脂及其黏接系統(tǒng)抗菌性能，通過其抗菌性能減小對(duì)口腔微生態(tài)環(huán)境的影響、改善修復(fù)體的長期臨床效果、維護(hù)口腔微生態(tài)環(huán)境的健康成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。各國研究人員在研制具有抑菌作用的樹脂和復(fù)合樹脂材料方面進(jìn)行了大量的工作。Imazato等［11］合成了抗菌單體甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶，并表明含有甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶的復(fù)合樹脂可以顯著抑制細(xì)菌生長。在其他研究人員的工作中，新型抗菌樹脂中有加入甲基丙烯酰氧乙基-正十六烷基-二甲基氯化銨和西吡氯銨作為其抗菌成分［12-13］。本研究將新型季銨鹽抗菌單體DMADDM添加到復(fù)合樹脂中。以往研究表明，烷基鏈長度為12的DMADDM具有更強(qiáng)的抗菌性能［5，14］。DMADDM通過和細(xì)胞膜結(jié)合，季銨鹽可導(dǎo)致細(xì)菌破裂，進(jìn)而引起細(xì)胞質(zhì)外泄［12］。當(dāng)帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞接觸帶正電荷的季胺離子時(shí)，電荷平衡受到干擾，細(xì)菌可以在其自身的滲透壓作用下破裂［12］。長的陽離子聚合物可以像針刺破氣球一樣，穿透細(xì)菌細(xì)胞破壞細(xì)胞膜［15］。本研究結(jié)果顯示，含有DMADDM的復(fù)合樹脂具有很強(qiáng)的抗菌性，全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌的CFU計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比均降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)，該結(jié)果與以往研究一致［5，14］。

在口腔環(huán)境中，復(fù)合樹脂更容易在表面堆積菌斑生物膜。菌斑生物膜造成材料表面的老化粗糙，導(dǎo)致材料性能下降，而粗糙的表面更易吸引細(xì)菌黏附［4］。這樣的惡性循環(huán)最終將會(huì)造成修復(fù)失敗，甚至對(duì)全身產(chǎn)生不良影響。Beyth等［4］對(duì)不同品牌的光固化復(fù)合樹脂應(yīng)用變形鏈球菌培養(yǎng)30 d，評(píng)價(jià)變形鏈球菌對(duì)材料表面粗糙度的影響，結(jié)果表明材料表面的粗糙度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而不斷增加。其他學(xué)者也進(jìn)行了類似的研究，結(jié)果均表明，菌斑生物膜會(huì)對(duì)復(fù)合樹脂表面粗糙度產(chǎn)生顯著的影響［16］。本研究在體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究口腔全菌生物膜對(duì)含有DMADDM的抗菌復(fù)合樹脂材料表面粗糙度的影響，結(jié)果顯示經(jīng)過7 d生物膜的培養(yǎng)后，對(duì)照組復(fù)合樹脂表面粗糙度顯著增加，與以往各研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)組由于添加了具有強(qiáng)抗菌性的DMADDM季銨鹽單體，顯著降低了菌斑生物膜的活性，大大降低了細(xì)菌的附著，從而減少了菌斑生物膜對(duì)復(fù)合樹脂表面粗糙度的影響，經(jīng)過7 d生物膜的培養(yǎng)后復(fù)合樹脂表面粗糙度沒有明顯變化。

目前，用于檢測(cè)材料的可溶性抗菌性能的方法包括應(yīng)用瓊脂平板彌散法觀察抑菌環(huán)、材料浸提液對(duì)細(xì)菌懸液生長的影響及材料對(duì)浮游狀態(tài)細(xì)菌生長的影響等［7］，對(duì)具有接觸性抗菌性能的含季銨鹽抗菌單體的牙科復(fù)合樹脂及黏接系統(tǒng)并不適用。另外，采用浮游狀態(tài)細(xì)菌進(jìn)行抗菌研究，同口腔實(shí)際環(huán)境中的菌斑生物膜相差甚遠(yuǎn)，尤其在細(xì)菌形成菌斑生物膜后，基因表達(dá)和生物學(xué)行為發(fā)生顯著改變，普通的抗菌藥物很難發(fā)揮作用［7］。口腔生物膜模型可以分為單一菌種、特定的混合菌和全菌模型［7］。全菌生物膜是從口腔環(huán)境中復(fù)制出的，很大程度上保持了口腔內(nèi)菌斑生物膜的復(fù)雜性和異質(zhì)性［7］。牙菌斑生物膜是一種復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，約含有1 000種不同的細(xì)菌種類［16］。鏈球菌在齲病發(fā)生、發(fā)展過程中起了重要的作用?？谇绘溓蚓喾N菌群，如變形鏈球菌群、唾液鏈球菌群、輕型鏈球菌群等。研究表明，變形鏈球菌是齲齒的主要致病菌［9］。因此，體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究抗菌材料表面對(duì)菌斑生物膜的影響，對(duì)評(píng)價(jià)材料的性能及其臨床應(yīng)用前景非常重要。

［1］Ferracane JL.Resin composite--state of the art［J］.Dent Mater，2011，27（1）：29-38.

［2］Beyth N，Domb AJ，Weiss EI.An in vitro quantitative antibacterial analysis of amalgam and composite resins［J］.J Dent，2007，35（3）：201-206.

［3］Drummond JL.Degradation，fatigue，and failure of resin dental compositematerials［J］.JDent Res，2008，87（8）：710-719.

［4］Beyth N，Bahir R，Matalon S，et al.Streptococcus mutans biofilm changes surface-topography of resin composites［J］.Dent Mater，2008，24（6）：732-736.

［5］Zhou C，Weir MD，Zhang K，et al.Synthesis of new antibacterial quaternary ammonium monomer for incorporation into CaP nanocomposite［J］.Dent Mater，2013，29（8）：859-870.

［6］Imazato S.Bio-active restorativematerials with antibacterial effects：new dimension of innovation in restorative dentistry［J］.Dent Mater J，2009，28（1）：11-19.

［7］McBain AJ.In vitro biofilm models：an overview［J］.Adv Appl Microbiol，2009，69：99-132.

［8］Cheng L，Exterkate RA，Zhou X，et al.Effect of Galla chinensis on growth and metabolism ofmicrocosm biofilms［J］.Caries Res，2011，45（2）：87-92.

［9］McBain AJ，Sissons C，Ledder RG，et al.Development and characterization of a simple perfused oralmicrocosm［J］.J Appl Microbiol，2005，98（3）：624-634.

［10］Lima JP，Sampaio de Melo MA，Borges FM，et al.Evaluation of the antimicrobial effect of photodynamic antimicrobial therapy in an in situmodel of dentine caries［J］.Eur J Oral Sci，2009，117（5）：568-574.

［11］Imazato S，Kinomoto Y，Tarumi H，et al.Antibacterial activity and bonding characteristics of an adhesive resin containing antibacterial monomer MDPB［J］.Dent Mater，2003，19（4）：313-319.

［12］Namba N，Yoshida Y，Nagaoka N，etal.Antibacterial effect of bactericide immobilized in resinmatrix［J］.DentMater，2009，25（4）：424-430.

［13］Li F，Chen J，Chai Z，et al.Effects of a dental adhesive incorporating antibacterial monomer on the growth，adherence and membrane integrity of Streptococcus mutans［J］.JDent，2009，37（4）：289-296.

［14］Zhang K，Cheng L，Wu EJ，et al.Effect of water-aging on dentin bond strength and anti-biofilm activity of bonding agent containing antibacterial monomer dimethylaminododecylmethacrylate［J］.JDent，2013，41（6）：504-513.

［15］Murata H，Koepsel RR，Matyjaszewski K，et al.Permanent，non-leaching antibacterial surfaces-2：how high density cationic surfaces kill bacterial cells［J］.Biomaterials，2007，28（32）：4870-4879.

［16］Busscher HJ，Rinastiti M，Siswomihardjo W，et al.Biofilm formation on dental restorative and implantmaterials［J］.J Dent Res，2010，89（7）：657-665.

The effect of microcosm biofilm degradation on the surface roughness of novel antibacterial resin com posite

MEIMei1，LIXiaolei1，ZHANG Ning2
（1.Beijing Shi Jing Shan Hospital，Teaching Hospital of Capital Medical University in Shijingshan，Beijing 100040，China；2.Beijing Stomatological Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China）

ObjectiveAdental plaquemicrocosm biofilm modelwith human saliva as inoculum was used to investigate the influence of 7-day biofilm degradation on the surface of resin composite containing dimethylaminododecylmethacrylate（DMADDM）.MethodsDMADDM was incorporated into resin composite and the dental plaque microcosm biofilm model was used to evaluate biofilm colony-forming unit（CFU）counts，live／dead staining assay and surface roughness test.ResultsIncorporating DMADDM significantly reduced the CFU（P＜0.01）.All three CFU counts in experimental group were 3 orders ofmagnitude lower than those in control group.7-day biofilm degradation had much less influence on the surface roughness of resin composite containing DMADDM.ConclusionResin composite containing DMADDM has strong antibacterial potency and could resist the oral environment degradation.The novel compositemay have wide applicability in clinic.

Resin composite；Microcosm biofilm；Antibacterial property；Surface roughness

R780.2

A

2095-3097（2014）03-0166-04

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.03.011

2014-04-24 本文編輯：徐海琴）

100040北京，首都醫(yī)科大學(xué)石景山教學(xué)醫(yī)院北京市石景山醫(yī)院（梅 美，李曉蕾）；100050北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院（張 寧）

張 寧，E-mail：dentistzhang112＠163.com