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（1.廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361012；2.集美大學生物工程學院，福建廈門 361021；3.廈門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗測試中心，福建廈門 361000）

MALDI-TOF-MS在鑒定進口甲魚卵病原菌中的應用

徐淑菲1，吳玉娟2，孔繁德1，趙冉3，彭小莉1，葉妍妍1，陳信忠1

（1.廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361012；2.集美大學生物工程學院，福建廈門 361021；3.廈門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗測試中心，福建廈門 361000）

目的應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）儀器和Biotyper分析軟件對臺灣進口的甲魚卵進行攜帶病原菌的檢測。方法 選用合適的培養(yǎng)基對進境甲魚卵進行細菌分離培養(yǎng)，選取可疑菌株，純化后接種肉湯培養(yǎng)，然后按照MALDI-TOF-MS要求進行樣品制備，點靶并獲取樣品質(zhì)譜圖，并運用Biotyper分析軟件對所獲取的質(zhì)譜圖進行分析。同時用全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行輔助分析鑒定。結果 應用MALDITOF-MS方法從臺灣輸入大陸的73批甲魚卵中分離出綠膿桿菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌、霍亂弧菌、沙門氏菌等25個屬49個種242株致病菌，其中大部分是對人和動物的條件致病菌。結論 當前進境甲魚卵攜帶病原菌形勢嚴峻，需引起進出口商、檢驗機構及其他相關部門重視。本研究對規(guī)范甲魚卵貿(mào)易、保障人民健康都有著重要的作用。

甲魚卵；MALDI-TOF-MS；質(zhì)譜圖；病原菌

甲魚是一種深受廣大消費者歡迎的水產(chǎn)品，已被列入中國國家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄》。甲魚肉不但是滋補珍品，也是一種用途很廣的滋補藥品。據(jù)臺灣甲魚養(yǎng)殖協(xié)會估計，目前大陸每年要消費五六億只甲魚，平均每兩個人吃掉一只[1]。盡管國內(nèi)甲魚養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，但遠遠不能滿足市場需求，仍然以進口外來甲魚卵孵化苗種為主，6成來自臺灣，臺灣成為大陸引進甲魚卵的主要地區(qū)。廈門口岸作為大陸距離臺灣最近的口岸，有著得天獨厚的地理優(yōu)勢。2006年以來進口的臺灣甲魚卵由零起步到進入正常化、常態(tài)化、規(guī)模化，實現(xiàn)了“三級跳”[2]，臺灣年產(chǎn)5億粒甲魚卵，有八成輸往大陸孵化成甲魚，而廈門口岸進口臺灣甲魚卵的進口量占臺灣產(chǎn)量三成，廈門口岸已成為臺灣甲魚卵銷往內(nèi)地的首要集散地。廈門口岸在兩岸的甲魚卵貿(mào)易中有著舉足輕重的作用。

質(zhì)譜分析法不僅可以用于化學分析，也可以用于生物分析?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ ionization time-offight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜。作者曾用此方法對從廈門口岸入境的甲魚卵樣品進行過初步檢測，檢出綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌等多種病原菌[3]。由于當時樣品有限，只能對甲魚卵攜帶致病菌進行初步的研究，本文將繼續(xù)對臺灣進口的甲魚卵進行致病菌檢測，在前期工作的基礎上進一步探討甲魚卵攜帶致病菌的情況。

1 材料與方法

1.1 試劑

1.1.1 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯、腸道增菌液、緩沖蛋白胨水（BPW）、氯化鎂孔雀綠肉湯（MM）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、堿性蛋白胨水（APW）、7.5%氯化鈉肉湯、李氏增菌肉湯FB、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、TCBS瓊脂、慶大霉素瓊脂、血平板、PALCAM瓊脂等培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限公司；弧菌顯色培養(yǎng)基及李斯特菌顯色培養(yǎng)基購自博賽科瑪嘉微生物技術有限公司。

1.1.2 其他主要試劑和儀器 無水乙醇，分析純，購自廈門綠茵化玻有限公司； 甲酸、乙腈、三氟乙酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA），質(zhì)譜純，購自BRUKER DALTONICS公司；質(zhì)量矯正標準品Bacterial Test Standard購自BRUKER DALTONICS公司；革蘭氏陰性/陽性細菌鑒定卡為美國Biomerieux公司產(chǎn)品。

主要儀器：高通量微生物鑒定儀，型號為Mtcrofex LRF20，生產(chǎn)廠家為BRUKER DALTONICS；全自動微生物鑒定系統(tǒng)，型號為Vitek 2 compact，生產(chǎn)廠家為生物梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料 臺灣輸入甲魚卵共73批，取同批樣品10～20枚左右甲魚卵，無菌環(huán)境中勻漿破碎，作為細菌分析材料。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng)及待檢菌前處理 按照徐淑菲等介紹的方法進行[3]。

1.2.3 基質(zhì)和BTS標準品的配制 標準溶液：50%乙腈，2.5%TFA和47.5%超純水?；|(zhì)（α-氰基-4-羥基肉桂酸，CHCA）：用100μL標準溶液溶解CHCA，劇烈震蕩后12000r/min離心2 min，4℃保存?zhèn)溆?。標準品：?0μL標準溶液溶解Bacterial test standard（BTS）標準品，反復吹打混勻，注意避免出現(xiàn)氣泡，靜置5 min后再吹打不少于20次，12000 r/min離心2 min，取上清分裝，每管5μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 點靶 先吸取1μL上清或BTS標準品點靶，自然放干后再點1μL基質(zhì)，基質(zhì)干燥后上機，自動抽真空。

1.2.5 質(zhì)譜檢測

1.2.5.1 校準 用BTS標準品進行校正，將Err/ ppm控制在±500以內(nèi)。

1.2.5.2 質(zhì)譜儀參數(shù)設置 加速電壓20kV；質(zhì)量范圍2000-20000Da；激光點擊數(shù)，每圖譜100。

1.2.5.3 細菌蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰的采集、軟件分析按照徐淑菲等介紹的方法進行[3]。

1.2.6 全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行對比鑒定 根據(jù)儀器說明，使用全自動微生物鑒定系統(tǒng)（Vitek 2 compact）將分離的菌株進行鑒定。

2 結果

2.1 采集細菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)并進行分析

打開Biotyper分析軟件，調(diào)入選中樣品數(shù)據(jù)進行分析（以6#樣品中分離到的肺炎克雷伯氏菌為例）。結果判定標準按照徐淑菲等介紹的方法進行[3]。圖1是6#樣品分離到的肺炎克雷伯氏菌菌株的指紋圖譜和細菌庫中Klebsiela pneumoniae ssp pneumoniae 9295_1CHB標準菌株指紋圖譜的對照圖，橫線以上是樣品的指紋圖，由多條特異的蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰組成，橫線以下是數(shù)據(jù)庫中標準菌株的蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰。樣品指紋圖譜與標準圖譜成鏡像關系的比率越大則鑒定為該菌株的可能性就越大。圖2是鑒定結果分值，由高到低進行排序，一般由得分最高的進行分離菌株的判定。最高得分為2.526，在2.3- 3之間，判定為肺炎克雷伯氏菌。圖3是6#樣品分離到的肺炎克雷伯氏菌菌株的特征性的質(zhì)譜峰峰值，具有較強信號的質(zhì)譜峰的m/z分別為2691.935、4365.396、5383.210、6290.994、7705.268、9477.070、10284.970、11874.806。

圖1 6#樣品分離的一株細菌，最高得分為2.526的質(zhì)譜對照圖

圖2 鑒定結果分值

圖3 6#樣品分離到的肺炎克雷伯氏菌的質(zhì)譜峰

采用徐淑菲等[3]介紹的方法進行細菌分離和培養(yǎng)，從HE、BS、TCBS、麥康凱瓊脂、慶大霉素瓊脂、血平板、PALCAM、營養(yǎng)瓊脂上共分離到601株可疑菌，純化培養(yǎng)后，獲取可疑菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜，在軟件已有的3290株微生物指紋圖譜數(shù)據(jù)庫以及本室自建的281株細菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中進行檢索，并分析結果。

分離到的601株細菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜，經(jīng)BioTyper軟件分析鑒定，其中502株有鑒定結果（即Score≥2）。由于有些細菌在多種培養(yǎng)基上均可能生長，本研究中用不同培養(yǎng)基從同一個樣品中分離到的同一種菌只計算一次，最終共分離到242株細菌，分布于25個屬49個種，菌種類別分布較廣，其中大部分分離菌株為條件致病菌，可引起人和甲魚致病，如檸檬酸桿菌、蒼白桿菌、雷氏普羅威登斯菌、變形桿菌、副溶血弧菌等。分離到最多的細菌是綠膿桿菌30株，占12.4%，其次為糞產(chǎn)堿桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌和陰溝腸桿菌，分別為27株、23株、22株，占分離菌的11.2%、9.5%、9.1%（表1）。

2.2 全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結果

經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定的菌株進行全自動微生物鑒定，溶藻弧菌、副溶血弧菌、弗氏枸櫞酸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、雷氏普羅威登斯菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、無害李斯特菌等細菌的鑒定結果均與全自動微生物鑒定結果相吻合。而其他的一些細菌菌株通過全自動微生物鑒定儀檢測結果低于90%，或者根本無法鑒定，出現(xiàn)“Low Discrimination”的提示。

表1 分離菌的MALDI-TOF-MS鑒定結果

3 討論

3.1 甲魚卵多重帶菌情況

73批樣品中有7批未分離到病原菌，帶菌率為90.41%（66/73），單重帶菌率為15.07%（11/73），其余55批樣品都是多重帶菌，多重帶菌率高達75.34%（55/73）。其中攜帶2種菌的樣品有14批，占19.18%（14/73），比例最高；其次是帶4種菌的樣品，有11份，占15.07%（11/73）；攜帶3種菌的樣品有10批，占12.12%（10/73）；攜帶5種菌的樣品有7批，占9.59%（7/73）；帶6種菌的樣品有6批，占8.22%（6/73），另外攜帶7種、8種、9種細菌的樣品分別為3批、1批、2批；2號樣品攜帶細菌種類最多，達12種。由此可知，大部分樣品都是多重帶菌，帶菌情況不僅普遍而且非常嚴重。

3.2 分離菌株無鑒定結果的情況

本試驗分離的菌株除了上述有鑒定結果的菌株外，還有一部分無法鑒定的菌株。這些菌株經(jīng)過反復純化后，無論是MALDI-TOF-MS，還是全自動微生物鑒定系統(tǒng)依然不能給出鑒定結果。其原因可能有以下幾點：⑴分離到的菌株常常被研究人員忽略；⑵分離到的菌株對動植物及人類的危害小，未引起研究人員的重視；⑶MALDI-TOF-MS及全自動微生物鑒定系統(tǒng)的原始數(shù)據(jù)庫里沒有包含該菌的質(zhì)譜圖；⑷分離到的菌株無特異的蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰。

3.3 MALDI-TOF-MS及全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結果符合率

MALDI-TOF-MS和全自動微生物鑒定系統(tǒng)，前者通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進行分析的一種分析方法[4]，主要針對菌體內(nèi)高豐度、持續(xù)表達的蛋白質(zhì)，建立蛋白質(zhì)指紋圖譜，從而實現(xiàn)細菌的鑒定，目前數(shù)據(jù)庫可進行2185種細菌的鑒定，并且可以自己建立已知菌的數(shù)據(jù)庫，進一步完善數(shù)據(jù)庫；后者是根據(jù)生化介質(zhì)中指示劑的顯色（或濁度）反應而進行細菌的鑒定，目前數(shù)據(jù)庫可進行506種細菌的鑒定。在兩者的鑒定范圍內(nèi)，鑒定結果是一致的。這兩種鑒定方法，大多數(shù)細菌只能鑒定到種。

本文前面提到有些菌株經(jīng)全自動微生物鑒定系統(tǒng)無法判定，如坦氏不動桿菌（Acinetobacter tandoii）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）、小麥蒼白桿菌（Ochrobactrum tritici）、膝行假單胞菌（Pseudomonas geniculate）、摩氏假單胞菌（Pseudomonas mosselii）、食油假單胞菌（Pseudomonas oleovorans）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）等，這些細菌均不在全自動微生物鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫里，因而也就無法鑒定。

3.4 影響MALDI-TOF MS的因素

MALDI-TOF MS是依賴儀器的生物化學分析技術，儀器的精準度、樣品的處理方法、基質(zhì)的選擇以及一些人為因素對結果產(chǎn)生直接的影響，如培養(yǎng)基[5]、培養(yǎng)時間[6]、細菌前處理[7]、點樣誤差、激光能量、基質(zhì)峰等等。

3.5 MALDI-TOF-MS在國內(nèi)外的應用情況

飛行時間質(zhì)譜的應用范圍較其他質(zhì)譜儀更廣，可以進行多種有機物及無機物的定性和定量分析、復雜化合物的結構分析、樣品中各種同位素比的測定及固體表面的結構和組成分析等，并且是近年興起的蛋白質(zhì)組學研究前沿技術。國內(nèi)外將此技術廣泛應用于醫(yī)學等各個領域。杜宗敏等研究人員用MALDI-TOF-MS方法進行了金黃色葡萄球菌、沙門菌、宋內(nèi)志賀氏菌、單增李斯特菌、厭氧菌的鑒定以及癌癥的診斷[8-19]，均取得了較好的分析鑒定結果。

3.6 通過MALDI-TOF-MS和BioTyper分析軟件對甲魚卵攜帶微生物進行鑒定

目前市場上的甲魚大部分都是由人工養(yǎng)殖的，由于人工養(yǎng)殖甲魚的密度大，極易發(fā)生群體性細菌感染，用于孵化的甲魚卵的質(zhì)量直接影響到甲魚的健康。甲魚卵本身攜帶病原菌，就極可能在存放、運輸及孵化的過程中使病原菌大量繁殖，使幼鱉患病，甲魚卵作為可食用的食品也會引起人類食物中毒。因此對于甲魚卵要進行嚴格的質(zhì)量檢驗，以保證養(yǎng)鱉業(yè)健康發(fā)展和人們的身體健康，本研究針對臺灣進口的73批1000多粒甲魚卵進行了帶菌情況分析，結果發(fā)現(xiàn)甲魚卵有90.41%攜帶常見細菌，所攜帶細菌可歸類為25個屬49種，其中大部分為人類條件致病菌，它們廣泛存在于環(huán)境中，當環(huán)境條件改變時也可引起人類疾病，導致腹瀉、嘔吐等，同時還分離到了沙門氏菌等致病菌。每份樣品攜帶細菌的數(shù)量不等，但大部分為多重帶菌，最多的同時攜帶了12種菌。這表明甲魚卵攜帶病原菌范圍廣，種類多，多重帶菌現(xiàn)象嚴重，這可能與甲魚卵的生長環(huán)境及運輸過程中的條件有關。本試驗分離出這些病原菌對于加強進口甲魚卵的監(jiān)管具有重要的警示意義，對于促進兩岸甲魚卵進口，規(guī)范甲魚卵市場，保障人民健康都有著重要的作用。

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Application of MALDI-TOF-MS for Identifcation of Pathogenic Bacteria in Imported Terrapin Eggs

Xu Shufei1，Wu Yujuan2，Kong Fande1，Zhao Ran3，Peng Xiaoli1，Ye Yanyan1，Chen Xinzhong1

Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，F(xiàn)ujian 361012； 2. Biological Engineering Institute of Jimei University，Xiamen，F(xiàn)ujian 361021；3. Xiamen Agriculture Product Quality and Safety Test Centre，Xiamen，F(xiàn)ujian 361000）

ObjectiveMatrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOFMS）instrument and the Biotyper analysis software was applied to investigate the pathogens carried in terrapin eggs from Taiwan.MethodsSuitable media for the bacteria isolation and culture of the imported soft-shell turtle eggs were chosen，and suspicious bacterial strains were cultured，isolated and purifed，and then inoculated into broth. After being cultured in broth，the probable pathogens were prepared and added to the target polished steel plate and the mass spectra were acquired. The spectra were analyzed by the Biotyper analysis software. And automatic bacteria identifcation system was used to aid the analysis and identifcation of the pathogens.Results242 bacteria strains in 49 species of 25 genera were isolated from the 73 lots of terrapin eggs from Taiwan by MALDI-TOF-MS，including Pseudomonas aeruginosa，Proteus mirabilis，Klebsiella pneumoniae，Salmonella，Vibrio cholera and most of them were opportunistic pathogens both for human and animals.ConclusionIt was shown that the current situation of the imported terrapin eggs carrying pathogenic bacteria was serious，and the exporter or importer，the inspection organs and the other relevant departments are required to pay more attention to it. The study will play an important role in promoting the terrapin egg trade and protecting the public health.

terrapin egg； MALDI-TOF-MS； mass spectrum； pathogenic bacteria

S851.347；S947.12

B 文章編號：1005-944X（2014）07-0086-06

廈門市科技計劃項目（項目編號：3502Z20124003）

徐淑菲