申 奧，蘇余燕，宋遠麗，欒維江

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

在水稻株型指標中，葉片的形態(tài)，特別是上位3片功能葉的形態(tài)直接影響群體的葉面積指數(shù)和受光效率，從而影響產(chǎn)量.早在20世紀70年代，松島省三等[1]就提出了“理想稻”概念，其中重要的一點即為葉片直立，眾多的株型研究也反復論證了葉片直立（較小的葉基角）的重要性[2].能夠影響葉片直立的重要因素之一就是葉片的卷曲度，在葉片卷曲的水稻中，上位3片葉在開花期挺直，葉基角減小，便于葉片正反面受光以及減少對植株下部的遮光，提高了群體中下層葉片的光合作用[3].葉片適度卷曲之后還可以適當增加水稻的播插密度，在確保通風度的條件下，獲得最佳的葉面積指數(shù)，通風度可以影響植株的抗病性.由于水稻葉片卷曲在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中的重要作用，因此科學工作者密切關注卷葉性狀[4-5]，希望能利用這一性狀改良水稻品種.

葉片卷曲是植物應對自然界中逆境刺激的一種反應，由葉片細胞膨壓降低所引起，是內(nèi)部水勢狀況和滲透調(diào)節(jié)結果的外部形態(tài)表現(xiàn)[6].環(huán)境因素方面，干旱脅迫是造成植物葉片卷曲的主要因素，植物通過葉片卷曲，改變?nèi)~片的電導率和有效葉面積，減少其攔截的輻射量，從而降低蒸騰作用，有效防止水分損失[7].另外，Price等[8]研究認為葉片內(nèi)泡狀細胞的腫脹減弱也可能引起葉片卷曲.

水稻中存在豐富的可穩(wěn)定遺傳的卷葉種質(zhì)資源.如Khush等[9]發(fā)現(xiàn)了6個水稻卷葉突變體，其中，rl1、rl2、rl3 突變體內(nèi)卷成圓柱狀，而 rl4、rl5、rl6（t）突變體內(nèi)卷成半圓柱狀，這6個基因分別定位在水稻1、4、12、1、3 和 7號染色體上.近年來，由于不同突變體庫的創(chuàng)建，又獲得了一些水稻卷葉突變體資源.如沈革志等[10]利用T-DNA插入法獲得了1個葉片向近軸面卷曲的突變體Rl-A2，遺傳分析表明該突變體受1個顯性單基因控制；Zhang等[11]用EMS誘變處理獲得卷葉突變體sll1，并把該基因定位在水稻第9號染色體的長臂.有些卷葉突變體的性狀在不同發(fā)育時期有所變化，如Luo等[12]發(fā)現(xiàn)了1個卷葉突變體在苗期葉片卷曲為圓柱狀，而到抽穗期則變?yōu)槲⒕頎顟B(tài)，遺傳分析表明其受1個隱性基因控制.有些卷葉突變體僅向單側卷曲，如余東等[13]用γ射線誘變方法獲得1個葉片近軸面單側右向卷曲突變體url1（t），并把該突變體基因定位在水稻1號染色體上.叢云飛等[14]用化學誘變方法獲得1個單側葉片向近軸面卷曲的突變體url2（t）.最近，王德仲等[15]從EMS突變體庫中發(fā)現(xiàn)1個水稻多突變性狀卷葉突變體nrl2（t），該突變體葉片細長且卷曲，莖桿細，并且突變體早抽穗，遺傳分析表明該突變體受1對隱性基因控制，并將該基因定位于水稻第3染色體上.另外，關于水稻葉片卷曲的分子機理，近年來也有一些研究[16-17].

該文對水稻Ac/Ds轉座子插入突變體庫中的2個葉片反向卷曲突變體的表型及組織形態(tài)進行了研究，以此揭示水稻葉片卷曲的形態(tài)建成.

1 材料與方法

1.1 材料

野生型日本晴（Oryza sativa L.ssp.Japonica cv.Nipponbare），用WT表示；外卷突變體是葉片向葉遠軸面（abaxial axis），即背向莖的一面卷曲的突變體，用Ab-M表示；內(nèi)卷突變體是葉片向葉近軸面（adaxial axis），即面向莖的一面卷曲的突變體，用Ad-M表示.內(nèi)卷和外卷突變體均來源于水稻Ac/Ds轉座子插入突變體庫，所有材料種植于天津市農(nóng)業(yè)科學研究院水稻研究所試驗田.

1.2 石蠟切片

取野生型及內(nèi)卷和外卷突變體處于相同生長時期植株的新鮮、健壯劍葉，用刀片切成小段后，首先經(jīng)FAA固定液固定2h以上，用體積分數(shù)為70%的酒精水溶液浸洗1～2次后，用梯度濃度酒精逐級脫水.之后，用梯度濃度的二甲苯酒精溶液進一步透明處理直至材料透明，完成后將其進行浸蠟和包埋，待石蠟凝固后用旋轉切片機進行切片.將切好的蠟片粘在載玻片上，展平，用甲苯胺藍對平展的蠟片進行染色.染色完成后再將切片放入二甲苯中處理5～8min，封片后置于光學顯微鏡下觀察照相.

1.3 纖維素含量測定

纖維素的提取參照文獻［18］.取適量纖維素稱重后加入質(zhì)量分數(shù)為67%的H2SO4，室溫混勻1h.加入預冷的質(zhì)量分數(shù)為0.2%的蒽酮試劑，混勻后620nm下進行吸光度值的測定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，以p≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果與分析

2.1 卷葉突變體的表型分析

野生型和2個卷葉突變體植株的表型特征如圖1所示.

與野生型植株相比，外卷突變體植株呈半矮桿狀，株高約為野生型的3/4，如圖1（a）所示，但穗長沒有變短且略長于野生型，如圖1（d）所示；外卷突變體的全株葉片較窄且直立，葉片與莖桿間的角度較小，劍葉與倒二葉的葉寬約為野生型的3/4，如圖1（a）和（e）所示；另外，外卷突變體一個很明顯的表型是葉片向葉遠軸面卷曲成半圓柱狀且葉脈呈白色，木質(zhì)化程度高，尤其主脈更為明顯，如圖1（a）和（c）所示.內(nèi)卷突變體株高約是野生型的1/2，如圖1（a）和（d）所示，全株葉片變窄，約為野生型的的1/2，但莖與葉之間的角度增大，呈散開狀，如圖1（a）和（e）所示；內(nèi)卷突變體葉片最明顯的特點是葉片向葉近軸面卷曲成半圓柱狀，同外卷突變體相比卷曲程度更大，基本接近圓柱狀，如圖 1（a）和（b）所示.與外卷突變體相比，除了葉片卷曲的方向和程度不一樣外，其花器官畸形，因此結實率和穗長大大下降，如圖 1（a）和（d）所示.

圖1 野生型和2個卷葉突變體的表型Fig.1 Phenotype of wild type and 2rolled leaf mutants

2.2 卷葉突變體葉片組織結構的變化

水稻的野生型和2個卷葉突變體葉片的維管束如圖2所示.

水稻葉片的中脈結構比較復雜，由多個維管束和一些薄壁組織組成，大維管束與小維管束相間而生，中間由薄壁組織分隔.葉片主脈中央部分有大的分隔開的通氣腔.在野生型的平展型葉片和外卷突變體葉片中，主脈中薄壁組織較多，薄壁細胞多而密，排列緊實（圖2A、B），而薄壁細胞崩裂分隔形成的2個通氣腔面積較??；在內(nèi)卷突變體葉片中，薄壁細胞少，排列較為松散，薄壁細胞崩裂分隔形成的通氣腔所占面積較大（圖2C）.水稻葉片主脈兩側有對稱分布的次脈，在野生型平展葉片中維管束較大，并伴有較多的薄壁細胞（圖2D）；外卷突變體葉片次脈的維管束略小于野生型，也伴有較多的薄壁細胞（圖2E）；而在內(nèi)卷突變體葉片次脈中維管束較小，薄壁細胞的數(shù)量也很少（圖2F）.

圖2 野生型及卷葉突變體葉片的顯微結構Fig.2 Microstructure of leaflet of wild type and rolled leaf mutants

一般情況下，泡狀細胞在失水或缺水脅迫下會因失去膨壓而收縮進而導致葉片卷曲，解除失水或缺水脅迫后，葉片又恢復原狀，這屬于不可遺傳的葉片卷曲性狀.本實驗中的葉片卷曲是由基因突變造成的，不受環(huán)境影響.對野生型及2個卷葉突變體泡狀細胞的數(shù)目統(tǒng)計結果顯示，野生型葉片中泡狀細胞數(shù)目平均為6個（圖2G）；內(nèi)卷突變體和外卷突變體葉片中平均為4個（圖2H、I）.這一結果說明2個卷葉突變體葉片的卷曲與泡狀細胞數(shù)目的減少有密切關系.

2.3 野生型與2個卷葉突變體葉片纖維素含量的比較

纖維素是植物細胞壁的主要組成成分，與細胞壁的構建密切相關.本文就野生型和2個卷葉突變體植株的葉片及莖中的纖維素含量進行分析.結果表明，野生型與外卷突變體植株的葉片和莖中的纖維素含量沒有顯著差異，而內(nèi)卷突變體葉片及莖中的纖維素含量顯著減少，如圖3所示.這些結果說明內(nèi)卷突變體和外卷突變體可能由不同的基因控制.

圖3 野生型與突變體的纖維素含量Fig.3 Cellulose content of wild type and 2mutants

2.4 卷葉突變體的遺傳學分析

為了揭示卷葉突變體的遺傳規(guī)律，分別以這2個卷葉突變體為母本與野生型配制雜交組合.F1植株均表現(xiàn)出野生型性狀，收取F1植株種子播種，在F2代中均出現(xiàn)了性狀分離，分離出了預期的突變表型的植株，說明2個卷葉突變體均可以穩(wěn)定遺傳，并且是由隱性基因控制的.統(tǒng)計F2群體中突變體與野生型植株的個數(shù)，結果如表1所示.外卷突變體F2中，31株F2單株中有5株表現(xiàn)為突變體性狀，χ2（3∶1）檢驗表明該卷葉性狀符合3∶1分離；內(nèi)卷突變體F2中，53株F2單株中有14株表現(xiàn)突變體性狀，χ2（3∶1）檢驗表明該卷葉性狀也符合3∶1分離.這些結果說明2個卷葉突變體的性狀均由隱性單基因控制.

表1 2個卷葉突變性狀的遺傳規(guī)律分析Tab.1 Genetic analysis of 2rolled leaf mutants

3 討論

水稻中葉片的適度卷曲有利于改善水稻基部的受光條件，提高植株的光能利用率；但葉片過度卷曲會產(chǎn)生許多不利影響，如有效葉面積指數(shù)較小、光合有效輻射和有效利用率偏低等.本研究通過對2種卷葉突變體的表型分析，發(fā)現(xiàn)二者在表型及細胞學結構上存在一定差異，與野生型相比，突變體葉片中泡狀細胞的數(shù)量也發(fā)生了變化.王曉等[19]通過對1個DS轉座子插入的卷葉突變體進行細胞學觀察，發(fā)現(xiàn)其泡狀細胞數(shù)目與野生型相比有明顯差異；Zhang等[11]對sll1突變體的研究也證實了葉片的卷曲與泡狀細胞的數(shù)目有關.

目前，在水稻中已經(jīng)鑒別并克隆出一系列卷葉基因，絕大多數(shù)是由隱性單基因控制的，也有研究發(fā)現(xiàn)了部分不受隱性單基因控制的基因[20-21].本文配制的F2分離群體可能由于秈粳雜交育性受到影響，獲得的F2種子數(shù)量較少，但遺傳分析發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)計群體中二者的突變性狀都符合3∶1的分離比，這表明2個卷葉突變體都由隱性單基因控制.目前課題組已經(jīng)定位并克隆了內(nèi)卷突變體的基因，發(fā)現(xiàn)其編碼1個細胞壁纖維素合成酶（另文發(fā)表）.結合2.3結果，說明內(nèi)卷突變體由于纖維素合成酶基因的突變造成了合成途徑受阻，從而造成纖維素含量減少.但外卷突變體的纖維素含量正常，說明外卷突變體與內(nèi)卷突變體可能由不同基因控制.課題組已經(jīng)擴大了外卷突變體的F2群體，并通過基因定位進一步克隆控制葉片外卷的基因，以揭示葉片不同方向卷曲的分子機理.

植物葉片的發(fā)育包括葉原基的形成和葉極性的建立，后者對葉的形態(tài)有重要影響[22].近年來在擬南芥（Arabidop sithaliana）和金魚草（Antirrhinum majus）中研究發(fā)現(xiàn)，控制葉片近軸-遠軸發(fā)育的基因發(fā)生突變會引起葉片卷曲，如 PHAN[23]，YABBY[24]、KANADI基因[25]和HD-ZIPⅢ基因家族中的 PHB、PHV、REV、ATHB15[26].玉米顯性突變體kn1（knotted1）基因造成葉片發(fā)育的基-頂軸破壞，植株葉鞘組織沿側生葉脈向上伸出進入葉片，從而使葉基部的表皮和葉肉細胞具有葉鞘的特點[27].在水稻中，已經(jīng)克隆得到的RL9基因可以編碼GARP結構域蛋白，并且與擬南芥中的KANADI基因是同源基因[28].Luo等[12]預測的在秈稻Ⅱ-32B中的動態(tài)卷葉突變體基因是一個編碼類似Myb的轉錄因子，與擬南芥中的KANADI基因同源[15].此外，研究發(fā)現(xiàn)植物葉片的發(fā)育還與生長素有關，在擬南芥和矮牽牛（Petunia hybrida）中發(fā)現(xiàn)的基因YUCCA和FLOOZY的突變，會引起內(nèi)源吲哚乙酸含量變化，從而使葉片卷曲[29-30].在水稻中也發(fā)現(xiàn)了類似基因，如NAL7與YUCCA同源，編碼一種黃素單加氧酶，該基因突變會引起IAA含量的變化，導致葉片卷曲[31].因此葉片卷曲涉及較為復雜的生理過程及調(diào)控網(wǎng)絡，要精確了解葉片卷曲的分子機理，必需研究多基因相互作用及調(diào)控網(wǎng)絡，以更好利用卷葉資源.

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