鄒金華，張忠貴，魏愛琪

（1.天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.天津市市容環(huán)境宣傳教育培訓(xùn)中心，天津300201）

近年來，隨著工業(yè)“三廢”和大量固液廢棄物的處理不當，農(nóng)業(yè)殺蟲劑和肥料用量的增加[1]，環(huán)境中重金屬的含量大量增加[2].在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，鎘（Cd）是環(huán)境中的主要重金屬污染源，是生物毒性最強的重金屬之一.Cd不是植物生長所必需的元素，具有很強的生理毒性，和其他重金屬相比，Cd在土壤中的化學(xué)活性較強，更容易被植物根系吸收.這不僅會使農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量下降，還很容易被植物吸收而進入食物鏈，導(dǎo)致動植物的異常生理反應(yīng)和遺傳變異[3-4]，甚至是猝死和細胞程序性死亡.Cd對植物的毒害作用，主要表現(xiàn)為根和葉長度的減小、葉片變黃、萎蔫[4]及生理生化指標的弱化等[5].植物在長期進化過程中，形成了自身的保護系統(tǒng)來對抗和適應(yīng)鎘脅迫[6-9].

毛蔥（Allium cepa var.agrogarum）為百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）洋蔥的變種，適應(yīng)性強，是我國東北地區(qū)的名優(yōu)特產(chǎn).毛蔥易培養(yǎng)，生根快，休眠期短，不受季節(jié)限制，是非常經(jīng)典的抗逆研究材料.本文以毛蔥為材料，利用營養(yǎng)液培養(yǎng)法和亞細胞組分差速分離技術(shù)，研究在不同濃度的Cd2+脅迫下，毛蔥不同器官Cd吸收積累的特點、Cd吸收積累對幾種礦質(zhì)元素代謝的影響以及根、葉中Cd的亞細胞分布特點，探討Cd脅迫對毛蔥的毒害機理，為Cd污染的毒理學(xué)研究提供資料.

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)和Cd脅迫處理

選取長勢相近的毛蔥100個，平均分成4組，固定于帶孔的泡沫板上，分別置于4個4L的培養(yǎng)盆中.室溫20℃下于塑料盤中進行自來水培養(yǎng)，每24h更換1次水.培養(yǎng)1周后改用Hoagland全營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，營養(yǎng)液配方為：Ca（NO3）2，5.78×10-3mg/L；KNO3，8.03×10-3mg/L；NH4H2PO4，1.34×10-3mg/L；MgSO4，4.18×10-3mg/L；MnSO4，8.91×10-6mg/L；H3BO3，4.84×10-5mg/L；ZnSO4，0.95×10-6mg/L；CuSO4，0.20×10-6mg/L；（NH4）2MoO4，0.015×10-6mg/L；Fe-EDTA，7.26×10-5mg/L.4組毛蔥中，3組分別在Hoagland營養(yǎng)液中加入不同濃度的Cd2+，使其濃度分別為1、10、100μmol/L，脅迫12d；設(shè)1個對照組，僅用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng).

1.2 各部位Cd及Fe、Mn、Cu、Zn含量的測定

毛蔥幼苗經(jīng)Cd2+脅迫3、6、9、12d后，每組隨機選取10株幼苗，進行根長和葉長的測定.幼苗經(jīng)脅迫處理12d后，用去離子水沖洗，去掉表面的Cd2+和其他礦質(zhì)離子，并將根、莖、葉分開，分別進行編號，放到干凈的培養(yǎng)皿內(nèi).45℃下干燥3 d，80℃下干燥1d，105℃過夜，至樣品恒重.用電動研磨機將樣品研磨成粉末，裝入小試劑瓶，密封.

稱取0.25g干燥樣品放入50mL燒杯中，加入濃硝酸和高氯酸，進行濕法消化[10].消化完全后向燒杯中加入10mL體積分數(shù)為10%的硝酸，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，去離子水定容.樣品溶液用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）進行Cd及Fe、Mn、Cu、Zn含量的測定.

1.3 各亞細胞組分分離、消化和Cd含量的測定

亞細胞組分中Cd的含量是指1g新鮮根或葉片細胞組織中Cd的質(zhì)量.毛蔥在Cd2+營養(yǎng)液中生長12d后，取葉片和根系，去離子水沖洗干凈，然后用濾紙將葉和根表面的水分吸干.準確稱取待測樣品4g，加入20mL的組分提取液［蔗糖，0.25mol/L；Tris-HCl緩沖液（pH約7.5），50mmol/L；二硫赤蘚糖醇，1mmol/L］，在冰上充分研磨勻漿.勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管中，冷凍離心機4℃下離心：2000r/min離心10min，所得沉淀為細胞壁組分；上清液在4000r/min下離心15min，所得沉淀為細胞核和葉綠體組分；第2次離心后的上清液在10000r/min下離心20min，所得沉淀為線粒體組分，第3次離心后的上清液即為包含核糖體的可溶性組分.

將差速分級離心法分離出的不同細胞組分置于80℃的烘箱中烘干至恒重，然后轉(zhuǎn)移至50mL的小燒杯中，分別加入濃HNO310mL和HClO41mL，蓋上培養(yǎng)皿，放置在電熱板上進行濕法消化[10].消化完全后轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中，去離子水定容，振蕩搖勻，得待測含Cd的溶液.

所有待測樣品均用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）進行Cd含量的測定.

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003和Sigmaplot 9.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)液中Cd2+對毛蔥幼苗葉片和根生長的影響

各處理組和對照組毛蔥幼苗根和葉片的生長情況如圖1所示.

圖1 不同濃度Cd2+對毛蔥葉長和根長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Cd2+on root length and leaf length of Allium cepa var.agrogarum

整個實驗過程中，對照組毛蔥的根系發(fā)達，長勢良好，為乳白色，有一定光澤，而且有側(cè)根不斷生長.1μmol/L Cd2+處理組的毛蔥長勢略好于對照組，差異不明顯.10μmol/L Cd2+處理組的長勢與對照組基本一致，植株上部生長良好，但根呈現(xiàn)淡黃色.100μmol/L Cd2+處理組的毛蔥根系稀少，呈黃色，根脆且易斷，后期根有腐爛現(xiàn)象，無側(cè)根生長.由圖1（a）可知，對照組、1μmol/L Cd2+處理組和 10μmol/L Cd2+處理組的根系生長幅度較大，長勢良好，尤其在6～9d根長顯著增加；100μmol/L Cd2+處理組則對根系有較強抑制作用，根系生長緩慢，后期甚至發(fā)生腐爛.

實驗過程中對照組葉片呈油綠色，生長旺盛.1μmol/L Cd2+處理組比對照組長勢好.10μmol/L Cd2+處理組與對照組的長勢基本一致，但葉片顏色較淺.100μmol/L Cd2+處理組葉片較短，呈黃色，后期葉片有萎蔫干枯現(xiàn)象.由圖1（b）可知，對照組、1μmol/L Cd2+處理組、10μmol/L Cd2+處理組的葉片生長幅度較大，尤其在6～9d顯著增加，1μmol/L Cd2+處理對毛蔥葉片生長有輕微促進作用，100μmol/L Cd2+處理組的葉片生長則受到較強的抑制作用，6d后葉片長度顯著低于其他組葉片的長度.

2.2 營養(yǎng)液中Cd2+對毛蔥幼苗各器官金屬元素含量的影響

不同濃度的Cd2+脅迫12d后，毛蔥根、莖、葉中Cd、Fe、Mn、Cu、Zn的含量如表1所示.

表1 不同濃度Cd2+脅迫后毛蔥不同部位幾種金屬元素的含量Tab.1 Several minerals contents in different parts of Allium cepa var.agrogarum after treatments with different concentrations of Cd2+

由表1可知，對照組毛蔥幼苗的根、莖、葉中Cd含量極低.3個處理組中根、莖、葉中Cd的含量均遠遠高于對照組，且同一部位Cd含量隨營養(yǎng)液中Cd2+濃度的提高而大幅增加，尤其是Cd2+濃度達到100μmol/L時，3個部位中Cd的含量均呈幾何級數(shù)增加.比較毛蔥幼苗不同部位，除了對照組幼苗的莖中Cd含量高于根部外，3個處理組中，根中的Cd含量均遠高于莖、葉中的，相差10倍以上；其次是葉片；莖中Cd含量最低.這些表明，毛蔥根系從溶液中吸收的Cd主要積累在根部，向地上部轉(zhuǎn)移的Cd量極低.

Cd2+脅迫總體上增加了毛蔥幼苗各部位對Fe的吸收.根部Fe的含量隨著Cd2+處理濃度的增大一直呈增加趨勢；莖中3個處理組Fe的含量都高于對照組，但Cd2+處理濃度為100μmol/L時，莖中Fe的含量低于其他2個處理濃度；葉片中Fe的含量隨著處理濃度的增加先降低，之后大幅增加，處理濃度為10μmol/L和100μmol/L時葉片中Fe的含量相近.部位之間進行比較，4組幼苗均是根中Fe的含量最大，莖中最低.Cd2+脅迫也影響了毛蔥幼苗各部位對Mn的積累.總的來看，葉片中Mn含量最高，其次為莖，根中最少.與對照相比，低濃度Cd2+脅迫增加了毛蔥各部位對Mn的積累，而高濃度則減少了各部位Mn的含量.不同濃度的Cd2+脅迫降低了毛蔥根、莖、葉中Cu和Zn的含量，且營養(yǎng)液中Cd2+濃度越高，毛蔥這2種金屬的含量降低得越多.

2.3 Cd2+脅迫下毛蔥幼苗根、葉中Cd的亞細胞分布

不同濃度的Cd2+脅迫下，毛蔥幼苗根和葉片各亞細胞組分中Cd的含量如圖2所示.

圖2 不同濃度Cd2+處理對毛蔥根、葉Cd亞細胞分布的影響Fig.2 Subcellular distribution of Cd in roots and leaves of Allium cepa var.agrogarum under the stress of different concentrations of Cd2+

由圖2可以看出，在根和葉片的各亞細胞組分中，Cd含量均以細胞壁組分最高，可溶性細胞質(zhì)組分次之，線粒體組分、細胞核與葉綠體組分的Cd含量相近，均低于細胞壁和細胞質(zhì)組分中Cd的含量.隨著Cd2+處理濃度的增加，各亞細胞組分中Cd含量均呈現(xiàn)上升趨勢，尤其是Cd2+濃度由10μmol/L增加到100μmol/L時，細胞壁組分Cd含量的增加幅度最大，細胞質(zhì)組分次之.

圖3顯示了不同的Cd2+處理濃度下，Cd在毛蔥幼苗根和葉片各亞細胞組分中的分配比例.

圖3 毛蔥根、葉各亞細胞組分Cd含量的分配比例Fig.3 Cd percentages in different subcellular fractions in roots and leaves of Allium cepa var.agrogarum

由圖3（a）可以看出，隨著營養(yǎng)液中Cd2+處理濃度的增加，Cd在根部的細胞壁和細胞質(zhì)中的分配比例逐漸增加，在線粒體、細胞核中的分配比例下降.由圖3（b）可以看出，隨著營養(yǎng)液中Cd2+處理濃度的增加，Cd在葉片細胞壁中的分配比例先是大幅度增加，如當Cd2+濃度為10μmol/L時，Cd在細胞壁中的比例達到65%，隨著Cd2+濃度進一步增加到100μmol/L時，Cd在細胞壁中的分配比例略有下降.Cd在細胞質(zhì)中分配比例先是隨著培養(yǎng)液中Cd2+濃度的增大而降低，在Cd2+濃度為10μmol/L時，分配比例僅為17%，但隨著培養(yǎng)液中Cd2+濃度提高到100μmol/L，Cd在葉片細胞質(zhì)中分配的比例又大幅度增加，達到29%.Cd在葉片線粒體、細胞核和葉綠體中的分配比例同在根中一樣，也是隨著培養(yǎng)液中Cd2+濃度的增大，分配比例逐漸下降.總體上，Cd在葉片各亞細胞組分中的分配比例與在根中相似，都是在細胞壁中的比例最大，其次是細胞質(zhì)，在線粒體、細胞核及葉綠體中的Cd分配比例最小.

由以上結(jié)果可知，Cd在毛蔥根和葉片亞細胞組分中的分配情況相似，根和葉片細胞吸收的Cd均主要分布在細胞壁組分和細胞質(zhì)可溶性組分中，線粒體、葉綠體和細胞核組分中相對較少.與對照組相比，隨著Cd2+處理濃度的增加，細胞壁組分和細胞質(zhì)組分中Cd的分配比例呈明顯上升趨勢，而線粒體、葉綠體和細胞核組分中Cd的分配比例呈下降趨勢.

3 討論與結(jié)論

植物具有多種抗逆機制應(yīng)對Cd的毒害，途徑主要有2種：金屬排斥和金屬富集作用.當重金屬進入植株后，起初富集在植物根部，隨后逐漸被運送到葉片部分[10-11].對大蒜[10]、玉米[12]、向日葵[13]、楊樹[14-15]中Cd分布的研究表明，Cd被植物根部吸收后，大部分保留在根系.本文對毛蔥的研究結(jié)果也表明，當增加營養(yǎng)液中Cd2+濃度時，毛蔥根系中Cd增加的幅度遠遠大于莖和葉，說明根部是Cd在毛蔥植株內(nèi)積累的主要部位，Cd向地上部分運輸量很少.一方面是由于根系浸泡在營養(yǎng)液中，為Cd的直接接觸部位，另一方面，重金屬更多地積累在根部，降低了對地上部分的毒害作用，這也是植物對重金屬脅迫的有效應(yīng)對機制.

重金屬對植物的毒害作用之一是干擾植物對養(yǎng)分的吸收，從而破壞植物體內(nèi)養(yǎng)分平衡.多數(shù)學(xué)者認為，Cd2+作為一種重金屬離子，或與植物必需營養(yǎng)元素競爭根部的吸收位點，進而影響植物對礦質(zhì)元素的吸收；或通過影響細胞質(zhì)膜透性來影響礦質(zhì)元素的吸收，改變細胞內(nèi)礦質(zhì)元素的濃度和組成[16-19].本研究結(jié)果表明，毛蔥Cd的吸收和積累改變了各器官中Fe、Mn、Cu、Zn等金屬元素的含量，根中的變化最明顯，可能是因為根部直接接觸Cd2+，根部細胞質(zhì)膜的選擇透過性受到嚴重影響所致.

本研究中根和葉片各亞細胞組分中Cd含量的測定結(jié)果表明，根和葉片細胞吸收的Cd均主要分布在細胞壁組分和細胞質(zhì)可溶性組分中，線粒體、細胞核及葉綠體組分中相對較少.植物細胞壁結(jié)構(gòu)除了有機械保護作用外，還是重金屬離子從細胞外進入到細胞內(nèi)的第一道屏障，在植株對重金屬離子的絡(luò)合、螯合中起關(guān)鍵作用，從而可以防止更多的重金屬離子通過細胞壁進入原生質(zhì)體中[20-21].結(jié)合到細胞壁上的重金屬由于已被螯合，因此對植物的生理生化活動沒有毒性，這樣便從源頭上控制了超出植物耐受量的重金屬的進入，使其毒害作用降到最小.當重金屬離子在細胞壁上的含量達到所能承受的最大極限時，細胞質(zhì)可溶性部分，尤其是細胞質(zhì)中的金屬硫蛋白、植物螯合肽等一些富含巰基的小分子，能夠有效螯合進入細胞內(nèi)的Cd，形成電子密度顆粒，然后以囊泡的方式對其進行包裹，小囊泡逐漸增多，將電子密度顆粒轉(zhuǎn)移到液泡中，從而把金屬離子進行液泡區(qū)室化而儲存在液泡中.重金屬經(jīng)區(qū)隔化或與細胞內(nèi)緩沖體系作用后，原生質(zhì)中重金屬的含量會大幅減少.本研究結(jié)果也表明，新陳代謝旺盛的細胞核、葉綠體和線粒體組分結(jié)合的Cd量較少，從而減少了Cd對細胞功能的影響.因此，細胞壁固持和液泡區(qū)室化可能在植物對重金屬的解毒、耐性和超富集方面起著非常重要的作用[20-23].

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著Cd2+處理濃度的增加，根和葉片細胞壁組分和細胞質(zhì)組分中Cd的分配比例呈明顯上升趨勢，而線粒體、細胞核及葉綠體組分中Cd分配比例呈下降趨勢.這表明，環(huán)境中Cd的含量越高，毛蔥根和葉片中積累的Cd越多，其細胞壁組分和細胞質(zhì)組分對Cd的固持和液泡區(qū)室化作用越強，降低了Cd對線粒體、細胞核、葉綠體等新陳代謝活躍部位的影響.低Cd2+濃度時，雖然細胞核和線粒體組分中Cd分配比例高，但由于Cd2+總濃度低，因此對細胞的代謝活動影響也較小，本實驗室前期的研究結(jié)果[3-5]證明了這一點.

綜上可知，毛蔥吸收的Cd2+主要積累在根部，向地上部分轉(zhuǎn)移很少，從而降低了Cd對地上部分的毒害作用，這是植物抵御Cd毒害的機理之一.從細胞水平來看，Cd主要分布在根、葉的細胞壁組分和細胞質(zhì)可溶性組分中，而結(jié)合在細胞核、線粒體、葉綠體等新陳代謝活動旺盛的細胞器上的Cd相對較少，這樣可以最大程度地減輕Cd對植物生理活動的影響.這些結(jié)果進一步證實細胞壁沉淀螯合和液泡區(qū)室化是植物抵抗重金屬毒害的一種重要機制，對于提高植物的抗逆性尤其是抗重金屬能力至關(guān)重要.

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