楊 玭 黃中偉 劉 春

1 江蘇省南通市急救中心 226001； 2 江蘇省南通大學(xué)附屬醫(yī)院急診科； 3 江蘇省南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心

嚴(yán)重膿毒癥是指膿毒癥伴低血壓或低灌注和至少一種器官功能障礙［1］。膿毒癥的本質(zhì)是炎癥介質(zhì)的失控釋放和炎癥反應(yīng)紊亂［2］。腸道是人體內(nèi)最大的“內(nèi)毒素庫”和“貯菌所”，機(jī)體發(fā)生膿毒癥時(shí)，為保護(hù)心、腦等重要器官，全身血液被重新分配，胃腸血流減少，引起腸黏膜缺血，腸道屏障功能受損［3］，腸腔內(nèi)毒素和細(xì)菌向腸道外移位可引發(fā)腸道局部或全身性不可控制的炎癥反應(yīng)，可以認(rèn)為胃腸道是SIRS的觸發(fā)器或始動器，是膿毒癥的“中心器官”。在炎癥因子復(fù)雜的連鎖反應(yīng)中TNF－α和PAF可能起著重要作用。TNF－α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早的炎性介質(zhì)，PAF是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板聚集誘導(dǎo)劑，通過和細(xì)胞膜表面的Pafr結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建膿毒癥動物模型，誘導(dǎo)TNF－α、PAF、Pafr表達(dá)變化，應(yīng)用血必凈干預(yù)治療，分析膿毒癥腸道炎癥因子表達(dá)規(guī)律并探討血必凈對膿毒癥大鼠腸道保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 健康雄性SD大鼠72只，體重（250±20）g（南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），隨機(jī)分成3組，即對照組、模型組、治療組，各組又按術(shù)后6h、12h、24h和48h時(shí)間點(diǎn)分成亞組，每亞組6只大鼠。膿毒癥動物模型采用盲腸結(jié)扎穿孔致腹腔感染的方法。3%戊巴比妥鈉腹腔注射（40mg／kg）麻醉后，在腹部下方正中切開2cm，逐層分離，探查盲腸，將盲端游離，生理鹽水濕潤后取出，在遠(yuǎn)端1／2處結(jié)扎，留約直徑0.5cm的線環(huán)，用18號針頭貫通腸道穿刺2次，擠出糞便于腹腔內(nèi)，回納，逐層縫合，術(shù)后在皮下注射生理鹽水10ml／只抗休克。對照組開腹翻動盲腸后關(guān)腹，皮下補(bǔ)液。治療組術(shù)前3d起腹腔注射血必凈2ml／只，q12h，持續(xù)至各亞組實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對照組與模型組給予等量生理鹽水。

1.2 標(biāo)本采集與組織勻漿制備 制模后于6h、12h、24h、48h再次麻醉后腹主動脈抽血，分離血清，距回盲部5cm處取回腸3cm兩段，一段置于－80℃冰箱凍存用于制備勻漿，一段放入Ep管中，置于液氮中速凍后，保存于－80℃冰箱，留做RNA提取備用。

1.3 ELISA測定血漿PAF、腸組織勻漿 TNFαPAF ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物有限公司），TNF－αELISA檢測試劑盒（R＆D Systems），嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.4 RT－PCR法半定量測定Pafr mRNA水平引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。（1）RNA提?。翰捎肨RIzol法提取大鼠腸組織中RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄：以RNA作為模板，采用Oligo（dt）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。（3）PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為20μl：SYBR Green Master Mix 10μl、引物上1μl、引物下1μl、cDNA1μl、補(bǔ)滅菌雙蒸水7μl。反應(yīng)條件：95℃下預(yù)變性4min，94℃下變性15s，60℃下退火20s，72℃延伸20s并讀取熒光值，45次循環(huán)，循環(huán)后設(shè)置55～90℃每隔0.3℃讀熒光值生成熔解曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用PASS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組大鼠麻醉蘇醒后精神萎靡，隨時(shí)間推移出現(xiàn)寒戰(zhàn)、腹圍增加、腹瀉，開腹可見渾濁腹水、腸組織粘連、盲腸結(jié)扎端發(fā)黑腫脹明顯、表面有膿苔。治療組較同時(shí)間點(diǎn)模型組癥狀輕，各時(shí)間點(diǎn)大鼠均無死亡發(fā)生。

2.2 血漿血小板活化因子（PAF）含量測定 6h時(shí)間點(diǎn)開始模型組較對照組血漿PAF含量明顯上升（P＜0.05），并在模型組內(nèi)隨時(shí)間先上升至24h后回落；治療組在6h、12h、24h、48h血漿PAF含量較模型組有明顯下降（P＜0.05）。數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿PAF值比較（ng／L，±s）

表1 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿PAF值比較（ng／L，±s）

注：與對照組各時(shí)間點(diǎn)比較，＊P＜0.05，與模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，＃P＜0.05。

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2.3 腸組織勻漿中腫瘤壞死因子－α（TNF－α）含量測定 6h時(shí)間點(diǎn)，三組腸組織TNF－α無明顯變化（P＞0.05）。12h時(shí)間點(diǎn)開始模型組較對照組腸組織TNF－α含量明顯上升（P＜0.05），并在模型組內(nèi)呈先上升至24h后回落；治療組在12h、24h、48h腸組織TNF－α含量較模型組有明顯下降（P＜0.05）。數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腸組織勻漿TNF－α值比較（ng／L，±s）

表2 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腸組織勻漿TNF－α值比較（ng／L，±s）

注：與對照組各時(shí)間點(diǎn)比較，＊P＜0.05，與模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，＃P＜0.05。

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2.4 腸組織Pafr基因表達(dá) 6h時(shí)間點(diǎn)開始模型組較對照組腸組織Pafr基因表達(dá)明顯下降（P＜0.05），并呈進(jìn)行性回升；治療組在6h、12h、24h腸組織Pafr基因表達(dá)較模型組明顯升高（P＜0.05），治療組在48h腸組織Pafr基因表達(dá)與模型組差異不顯著（P＞0.05），數(shù)據(jù)詳見表3。

表3 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腸組織勻漿Pafr的mRNA表達(dá)百分比（%，±s）

表3 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腸組織勻漿Pafr的mRNA表達(dá)百分比（%，±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

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3 討論

目前認(rèn)為革蘭氏陰性菌感染和內(nèi)毒素生成、炎癥通路和凝血通路被激活、基因多態(tài)性以及信號傳導(dǎo)等機(jī)制參與了膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程，炎癥介質(zhì)的失控釋放和炎癥反應(yīng)紊亂是膿毒癥的本質(zhì)［2］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CLP法制備膿毒癥模型，由于盲腸的結(jié)扎穿孔，造成腹腔的混合細(xì)菌感染，接著細(xì)菌內(nèi)毒素移位進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)［4］。結(jié)果顯示，模型組與治療組大鼠在制模后有明顯的膿毒癥表現(xiàn)，出現(xiàn)發(fā)熱、腹脹、腹瀉等器官功能障礙，模擬了臨床上嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)病過程。

在正常的免疫應(yīng)答中，各種相關(guān)的細(xì)胞因子協(xié)調(diào)和諧，炎癥介質(zhì)失衡在膿毒癥的病理生理過程中起決定性作用［5～7］。在膿毒癥機(jī)體，LPS能促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡、疏松緊密連接促進(jìn)細(xì)菌移位，損傷腸黏膜屏障，并可激發(fā)炎癥介質(zhì)如TNF－α、IL－6等連鎖反應(yīng)，引起全身器官的損傷［3］。TNF－α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，在造成機(jī)體損傷的同時(shí)激活炎癥效應(yīng)細(xì)胞釋放更多的炎癥因子如IL－1β、IL－6、IL－8等，使炎癥信號產(chǎn)生“級聯(lián)放大”作用［8］。本研究中膿毒癥模型組大鼠TNF－α隨時(shí)間點(diǎn)逐漸升高至24h后回落。

研究認(rèn)為PAF在諸多參與胃腸黏膜損害的炎癥介質(zhì)中可能起到“中心放大”的介導(dǎo)作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板聚集誘導(dǎo)劑。它通過和細(xì)胞膜表面的Pafr結(jié)合發(fā)揮生物作用，具有使血小板聚集、中性粒細(xì)胞聚集、中性粒細(xì)胞脫顆粒等作用。本實(shí)驗(yàn)誘發(fā)腸組織產(chǎn)生內(nèi)源性PAF。PAF很可能是內(nèi)毒素作用的主要效應(yīng)因子。本實(shí)驗(yàn)中對照組血漿中可檢測到PAF，腸組織中檢測到Pafr，且水平不隨時(shí)間推移而變化，提示正常機(jī)體內(nèi)存在PAF及組在6h、12h、24h明顯上升，提示血必凈不是通過下調(diào)Pafr的表達(dá)來減弱PAF的生物效應(yīng)，可能是通過抑制PAF的生成，或是抑制PAF與其受體的結(jié)合來減弱PAF的生物效應(yīng)，從而抑制白細(xì)胞活化和其他炎癥細(xì)胞的釋放，最終達(dá)到保護(hù)微循環(huán)的功能。Pafr的表達(dá)。模型組大鼠血漿PAF和腸組織Pafr的表達(dá)是動態(tài)變化的。PAF明顯高于對照組且隨時(shí)間點(diǎn)先升高后回落，與腸組織中TNF－α的表達(dá)一致，提示二者參與了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)從受體基因表達(dá)角度觀察膿毒癥時(shí)大鼠腸Pafr基因表達(dá)的情況。模型組與對照組在相同時(shí)間點(diǎn)比較，6h模型組的Pafr水平顯著低于對照組，后各時(shí)間點(diǎn)逐漸回升，說明模型組腸組織的Pafr表達(dá)在膿毒癥早期即降低，這與此前有學(xué)者在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中Pafr表達(dá)降低是一致的。由于本實(shí)驗(yàn)未在膿毒癥早早期設(shè)時(shí)間點(diǎn)觀測，因此無法了解到Pafr表達(dá)在何時(shí)間點(diǎn)開始下降。本實(shí)驗(yàn)中模型組Pafr先下降后逐漸回升，與PAF的表達(dá)趨勢相反，提示內(nèi)源性的PAF升高與Pafr表達(dá)水平下降可能屬于一種反應(yīng)性負(fù)反饋調(diào)節(jié)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PAF在24h處達(dá)高峰，而其受體在6h處達(dá)低值，峰值的不一致性提示Pafr的表達(dá)不是受PAF單因素影響，是受多種機(jī)制調(diào)控的綜合作用。由于本實(shí)驗(yàn)采用大鼠膿毒癥模型無法精確分析Pafr表達(dá)變化的影響因素，只能從整體上對該模型條件下Pafr表達(dá)變化作出評價(jià)，但其結(jié)果更能反映生物體的實(shí)際情況，可為以后的深入研究提供思路。

血必凈注射液是王今達(dá)教授以“細(xì)菌、內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)并治”的理論為指導(dǎo)，反復(fù)篩選精煉出的靜脈制劑?，F(xiàn)代藥理研究證明，活血化淤能改善微循環(huán)，減少血小板黏附和聚集，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少炎性滲出，使抗炎和促炎反應(yīng)趨向平衡，從而有效減少致炎因子對機(jī)體的損傷［9］。本實(shí)驗(yàn)用血必凈干預(yù)治療膿毒癥大鼠后，PAF、TNF－α指標(biāo)較模型組降低，提示膿毒癥時(shí)血必凈能有效拮抗內(nèi)毒素，抑制炎癥因子的釋放，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而發(fā)揮對膿毒癥腸道的保護(hù)作用。治療組的Pafr表達(dá)較模型

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