伍 彬，章超樺，吉宏武，曹文紅，劉 亞，朱國萍

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

凡納濱對蝦（Penaeus vannamei Boone），又名南美白對蝦。原產(chǎn)于美洲太平洋沿岸水域，我國以廣東、福建、浙江及海南為其主要產(chǎn)地，殼薄體肥，含肉率高，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富。其產(chǎn)品以去頭凍蝦為主，導(dǎo)致在加工過程中產(chǎn)生占蝦體重30%左右的蝦頭等下腳料，大部分工廠因未加利用而廢棄。蝦頭中含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、蝦紅素等營養(yǎng)物質(zhì)，同時含有各種氨基酸及人體必需的微量元素等[1-2]。蛋白質(zhì)在降解過程中除了產(chǎn)生游離氨基酸以外，還會產(chǎn)生不同分子量大小的肽段，短肽常具有不同的味感，包括甜味肽，苦味肽，咸味肽，還有鮮味肽等[3-5]。關(guān)于肽分離純化的方法，一般有鹽析法、超濾法[6]、離子交換層析、凝膠過濾層析和反相高效液相色譜等[7]。超濾法很難確定主要的呈味組分，而離子交換，凝膠過濾等其他方法又存在上樣量小，流速慢，耗時等問題。大孔吸附樹脂是一類不含離子交換基團(tuán)的高分子吸附劑，具有與活性炭相似的吸附性能，且理化性質(zhì)穩(wěn)定，因此被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如分離制備高F值寡肽、血壓肽等[8-10]。本文采用超濾與大孔吸附樹脂洗脫相結(jié)合的方法，對凡納濱對蝦蝦頭自溶產(chǎn)物中的短肽進(jìn)行分離純化，并結(jié)合感官評價，初步確定了自溶產(chǎn)物中短肽的呈味特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凡納濱對蝦蝦頭 廣東湛江國聯(lián)水產(chǎn)有限公司提供；馬尿酰組氨酰亮氨基酸（MW 423U）日本Peptide Institute；標(biāo)準(zhǔn)多肽混合物（含有Triosephosphateisomerase（MW 26625U），Myoglobin（MW 16950U），Aprotinin（MW 6512U），Insulin-B（MW 3496U），Bacitracin（MW 1423U） 美國Biorad公司；AB-8大孔吸附樹脂、NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂 天津興南允能高分子技術(shù)有限公司；XAD-1600、XAD16、MD130、X-5大孔吸附樹脂 上海速摩化工原料有限公司；Z型玻璃層析柱（1.6mmx60mm） 上海精科實業(yè)有限公司。

UV-2501PC紫外-可見光分光光度計 上海尤尼科儀器廠；Waters 600E高效液相色譜儀 美國waters公司；N-2000液相色譜工作站、QT-智能紫外檢測器、TH-1000A梯度混合器、DBS-100-LCD電腦全自動部分收集器 上海琪特分析儀器有限公司；超濾機Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦頭自溶產(chǎn)物的制備 將蝦頭在高速組織勻漿器中勻漿，勻漿后置于燒杯中，按料液比1∶3加水?dāng)嚢杌靹颍{(diào)節(jié)pH至7.85，置于50℃水浴鍋中保溫自溶反應(yīng)3h，后于100℃水浴滅酶10m in，冷卻，5000r/m in離心15min，取上清液，即為樣品溶液[11]。

1.2.2 自溶產(chǎn)物的超濾 將自溶產(chǎn)物分別用截留量為8000、5000、1000u超濾膜超濾（Am icon model 8200，M illipore Corporation），分離的條件：壓力0.25MPa，溫度4℃。

1.2.3 超濾組分肽基態(tài)氮含量的測定 分別采用凱氏定氮法[12]和甲醛滴定法[12]測定，肽基態(tài)氮含量=總氮量-總氨基態(tài)氮量。

1.2.4 超濾組分的感官評價 方法參考文獻(xiàn)[13]，感官評價小組成員由受過感官培訓(xùn)（經(jīng)三點檢驗試驗合格者確定為品評員）的5名女生，5名男生組成（年齡在20～30歲之間）。選用谷氨酸鈉、蔗糖、食鹽、硫酸奎寧和檸檬酸分別作為鮮味、甜味、咸味、苦味和酸味五種風(fēng)味的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。五種基本呈味標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成不同的濃度，品嘗鑒定。在室溫條件進(jìn)行評定，將樣品配成固形物為2%的溶液，取20m L盛放在杯中，評品員依次從低濃度開始品嘗標(biāo)準(zhǔn)味感物質(zhì)后，用小勺將溶液含在口中停留15s（勿咽下）活動口腔，使樣品溶液接觸整個舌頭，仔細(xì)辨別味道，然后吐出樣液，每次品嘗完后用清水漱口，需等待1m in，再品嘗。最后品嘗樣液，然后根據(jù)五種標(biāo)準(zhǔn)味感物質(zhì)給出相應(yīng)的分?jǐn)?shù)（五分制）。評分標(biāo)準(zhǔn)：5—非常強，4—強，3—標(biāo)準(zhǔn)，2—弱，1—很弱，0—不可鑒別。

1.2.5 超濾組分的HPSEC分析 采用高效體積排阻色譜（HPSEC）法測定超濾組分的分子量分布，流動相為50mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）。將分子量標(biāo)準(zhǔn)品配制成水溶液，上樣10μL至Waters-PROTEINPAK60柱進(jìn)行高效液相色譜洗脫，流動相流速0.7m L/m in，監(jiān)測214nm處的吸光值，建立分子量M的對數(shù)與洗脫保留時間t之間的回歸方程。將自溶產(chǎn)物經(jīng)過針式過濾頭（0.45μm）過濾后在相同的條件下進(jìn)行高效液相色譜洗脫，利用分子量回歸方程考察酶解產(chǎn)物的分子量分布。

1.2.6 超濾組分的大孔吸附樹脂的分離純化

1.2.6.1 大孔吸附樹脂型號的選擇 大孔吸附樹脂的預(yù)處理：用95%醇浸泡24h，過濾后用大量蒸餾水洗至澄清、無醇味，然后用2～3倍體積1%鹽酸浸泡3～5h，浸泡過程不斷攪拌。用蒸餾水充分洗樹脂至中性后再用2倍體積1%NaOH浸泡處理，最后用蒸餾水洗至中性并去除懸浮物，備用。

大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸實驗：靜態(tài)吸附實驗：于250m L具塞錐形瓶中加入5.0g處理好的干樹脂，用無水乙醇充分溶脹，再用去離子水洗凈乙醇，吸干水分。加入50m L經(jīng)感官實驗得出最好的的超濾組分（蛋白濃度為12.86mg/m L），塞好塞子，將該錐形瓶放入25℃水浴恒溫振蕩器中振蕩24h（振蕩速度為160r/min），使樹脂與料液充分接觸；振蕩結(jié)束后，濾紙過濾，將樹脂與溶液分離；測定溶液中的蛋白質(zhì)含量。按以下公式計算[14]：

其中：解吸液濃度，mg/m L；解吸液體積，m L；吸附液濃度，mg/m L；吸附液體積，m L。

1.2.6.2 大孔吸附樹脂對呈味肽的分離 用已選好型號且經(jīng)預(yù)處理好的大孔吸附樹脂裝填1.6×60cm的層析柱，在室溫條件下將經(jīng)感官評價確定的最優(yōu)的超濾液上柱，用紫外檢測器檢測流出液的A220nm，以A220nm=0.05為透過點。用10%、30%、50%、70%和90%乙醇分別洗脫樹脂，流速為1.0m L/m in。收集洗脫峰，減壓濃縮除去乙醇，再將溶液冷凍干燥用于分析。

1.2.7 氨基酸組成分析 樣品經(jīng)處理后，采用氨基酸自動分析儀測定，參照GB/T14965-1994，將樣品液堿解后上氨基酸自動分析儀。測定條件：No.2619離子交換柱（26×150mm），柱溫53℃，泵流速0.225m L/m in，泵壓8.8MPa，分析時間72m in，進(jìn)樣量50μL。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)均實驗三次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 自溶產(chǎn)物的超濾

蝦頭自溶產(chǎn)物經(jīng)將截留量為8000、5000、1000u超濾膜超濾，分離出四種超濾組分：8000u以上；8000～5000u；5000～1000u；1000u以下。各個組分中5000～1000u組分肽態(tài)氮的含量最高，達(dá)12.86mg/m L，其次是1000u組分，為10.01mg/m L，其含量最少的是8000u以上組分。這說明，蝦頭中的蛋白質(zhì)在自身酶系的作用下，降解為一系列分子量大小不同的肽段，而且這些肽短的分子量主要集中在5000u以下。

2.2 超濾組分的感官評價

由圖1知，分子截留量在5000u以上，以苦味為主，5000u以下，以鮮味和甜味為主。再分析各超濾組分的呈味特點：8000u以上組分，最突出的味感是苦味，其次再是鮮味和甜味；8000～5000u組分，最突出的味感也是苦味，其次再是鮮味和甜味；5000～1000u組分中，最突出的味感是鮮味和甜味，苦味很弱；1000u以下組分，突出的味感是鮮味和甜味，還有是咸味。由2.1可知，5000～1000u組分肽基態(tài)氮含量最高，因此5000～1000u組分選取作為進(jìn)一步分離純化的目標(biāo)。

圖1 超濾組分的風(fēng)味輪廓圖Fig.1 Flavor outline drawing of ultrafiltration components

2.3 超濾組分的HPSEC分析

圖2為6種分子量標(biāo)準(zhǔn)多肽（Triosephosphateisomerase、Myoglobin、Aprotinin、Insulin-B、Bacitracin和HHL）的HPSEC圖，將分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間t和分子量的對數(shù)LgM在平面坐標(biāo)系中描點，得到分子量回歸方程為LgM=-0.2177t+6.2791，相關(guān)系數(shù)R= 0.9868，說明兩者線性相關(guān)性及回歸性良好。

圖2 分子量標(biāo)準(zhǔn)的HPSEC圖譜Fig.2 HPSECmapping ofmolecular weight standard

采用HPSEC研究了5000～1000u超濾組分的分子量分布情況，結(jié)果見圖3。計算出5000～1000u超濾組分分子量分布情況（表1）。在5000～1000u超濾組分中，分子量5000u以下的組分比重達(dá)到82.07%，而且主要是集中在3000～1000u，占了50.80%；1000u以下達(dá)26.23%，跟超濾分離是粗分離有較大關(guān)系，小肽有可能通過氫鍵結(jié)合為較大的分子，被截留在了5000～1000u之間。結(jié)合2.2感官實驗，推斷出呈鮮味和甜味的肽分子量主要集中在3000～1000u，與宋美等[15]研究大豆蛋白呈鮮組分所得到的結(jié)果類似。

圖3 5000～1000u超濾液Fig.3 Ultrafiltrate between 5000～1000u

表1 5000～1000u超濾組分分子量分布（%）Table1 Molecularweight distribution of the 5000～1000u（%）

2.4 超濾組分的大孔吸附樹脂分離純化

2.4.1 大孔吸附樹脂型號的選擇 六種大孔吸附樹脂對5000～1000U組分的吸附量和解吸率見圖4，可以得出XAD-16這種型號的大孔吸附樹脂效果最好，吸附量84.95mg/g，解吸率為56.99%。

圖4 六種樹脂的吸附量與解吸率Fig.4 Absorption capacity and desorption rate of 6 resins

另外，大孔吸附樹脂是一種表面吸附劑，其吸附力強弱與樹脂的比表面積、表面電性及能否與被吸附物質(zhì)形成氫鍵和疏水相互作用等有關(guān)。通常認(rèn)為比表面積決定吸附劑的飽和吸附量，而平均孔徑和極性決定吸附劑的吸附速率[16]。由圖4知，XAD-16樹脂的比表面積最大，且在分離生物活性物質(zhì)時，具有可逆性，解吸率也高，因此，本研究選擇該樹脂進(jìn)行吸附動力學(xué)實驗。

2.4.2 大孔吸附樹脂分離條件的確定

2.4.2.1 洗脫劑的選擇 一般可以用溶劑的溶解度參數(shù)來預(yù)測，溶解度參數(shù)越小的溶劑解吸效率越高。常見溶劑水、甲醇、乙醇和丙酮的溶解度參數(shù)分別為23.2、14.5、12.7和10.0[17]。還考慮到在大孔吸附樹脂分離后，還要品評其分離出的組分，因此本實驗中采用乙醇-水溶液作為解吸劑。

2.4.2.2 上樣濃度的確定 將5000～1000u收集液真空冷凍成干粉，然后取一定的干粉分別配制成0.5、1.0、2.0mg/m L水溶液上樣，用乙醇-水作為洗脫液，以確定其最佳上樣濃度。從圖5可以看出，不同上樣濃度，其泄漏體積是不一樣的，當(dāng)樣品濃度為0.5mg/m L時，肽的泄漏體積為50m L，而且收集的洗脫液中肽含量也是最高的。這是因為濃度低時，樣品能夠和樹脂充分接觸，在疏水相互作用下，充分吸附到樹脂上，從而和高濃度條件下相比，損失率較低，結(jié)果確定以0.5mg/m L為最佳樣品濃度。

圖5 不同樣品濃度的洗脫曲線Fig.5 Eluting curve of difference sample concentration

2.4.2.3 流速的確定 根據(jù)2.4.2.2確定的上樣濃度上樣，然后分別將恒流泵的流速設(shè)定為0.5、1.0、2.0mg/min、以確定最佳流速。由圖6可知，隨著流速的增加，小肽回收率降低。這是因為流速增加，減少了洗脫劑與樹脂接觸的時間，疏水性肽不能被完全置換下來。但是0.5mg/m in和1.0mg/m in相比，小肽回收率相差不大，但進(jìn)一步提高流速到達(dá)2.0mg/m in，小肽回收率下降比較顯著?？紤]到生產(chǎn)中希望盡量縮短周期并保證較高回收率，選擇1.0mg/m in為最佳流速。

圖6 不同上樣流速的洗脫曲線Fig.6 Eluting curve of difference sample speeds

2.4.2.4 分級洗脫 裝好層析柱，將5000～1000u組分，按前兩節(jié)所確定的上樣濃度（0.5mg/m L），和流速（1.0mg/m in）上樣。為了分離出呈味的組分，本實驗采用改變洗脫液的極性，來達(dá)到分離的目的，因此，依次采用10%、30%、50%、70%和90%的乙醇作為洗脫劑，對呈味肽進(jìn)行分級洗脫。分別收集各個組分，并測其肽態(tài)氮含量（見圖7）。從圖7還可以看出，大部分小肽在乙醇濃度10%和30%下被洗脫，而且隨著乙醇濃度增大，被洗脫出來的組分的肽態(tài)氮含量逐步下降。洗脫后，收集到五種洗脫組分，分別是X 10%（表示用10%乙醇洗脫出來的組分，下同）、X30%、X50%、X70%和X90%，再通過減壓蒸餾除去各個組分中的乙醇，冷凍干燥，進(jìn)行感官品評，并對其感官評分最好的分析其結(jié)構(gòu)氨基酸。

圖7 洗脫組分的肽態(tài)氮含量Fig.7 Contentof peptide nitrogen in elution fractions

2.4.2.5 各洗脫組分的感官評價 經(jīng)感官品價，各洗脫組分的呈味特點的結(jié)果如圖8所示，五種洗脫組分主要的呈味特點都是鮮味和甜味突出，其中味道最佳的是X30%洗脫組分，其次是X90%組分。進(jìn)一步分析X30%洗脫組分中的結(jié)構(gòu)氨基酸。

圖8 各洗脫組分的感官評價Fig.8 Sensory evaluation of elution fractions

2.4.2.6 X30%洗脫組分的氨基酸構(gòu)成 凡納濱對蝦蝦頭酶解液中的氨基酸組成如表2所示，洗脫組分中Asp、Glu、Gly、Ala、Pro等呈鮮味和呈甘味的氨基酸總含量達(dá)35.71g/100g，占總游離氨基酸的36.11%，尤其是谷氨酸、脯氨酸含量較高，分別達(dá)15.29、11.89g/100g，這也正好印證了2.4.2.5中30%乙醇洗脫組分的感官得分最高。

3 結(jié)論

蝦頭自溶產(chǎn)物經(jīng)三種超濾膜超濾，發(fā)現(xiàn)5000～1000u組分肽態(tài)氮的含量最高，達(dá)12.86mg/m L。且該組分味道最為鮮美，且經(jīng)HPSEC分析，發(fā)現(xiàn)其分子量主要分布3000～1000u之間。選取XAD-16大孔吸附樹脂作為分離用樹脂，確定了最佳的分離條件為：洗脫液，乙醇-水混合溶液；最佳上樣濃度：0.5mg/m L；最佳上樣流速：1.0mg/min。采用大孔吸附樹脂在最優(yōu)條件下分離呈味肽，用30%乙醇洗脫出來的組分感官評價最好，其呈鮮味和呈甘味的氨基酸總含量達(dá)35.71g/100g，占氨基酸總量的36.11%。

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表2 X30%洗脫組分中結(jié)構(gòu)氨基酸含量Table2 Contents of amino acids in autolysates of

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