王報(bào)貴，王廣峰，武曉麗，董素琴，明 星，魏 華，徐 鋒，*

（1.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047；2.菏澤學(xué)院園林工程系，山東菏澤274000；3.江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江西南昌330004）

副溶血弧菌是一種能夠引起急性腸胃炎且廣泛存在的食源性致病菌，主要存在于海水、水生生物及海底沉淀物中，其特點(diǎn)是在高鹽的環(huán)境中才能生長(zhǎng)。所以該菌引起的食物中毒主要爆發(fā)于沿海地帶，由于從業(yè)人員衛(wèi)生意識(shí)薄弱，使食品之間因交叉污染和再次污染所引起的食物中毒的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生[1-2]。目前副溶血弧菌所引起的微生物性食物中毒、發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，現(xiàn)已成為我國(guó)首要的食源性致病菌[3]。為了提高人們對(duì)副溶血弧菌的重視程度，降低食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，建立一種快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)方法對(duì)及時(shí)控制副溶血弧菌食源性疾病具有重要意義。

針對(duì)于副溶血弧菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，包括：生理生化實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附法。目前最廣泛的定量檢測(cè)方法為最大可能數(shù)方法，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且操作復(fù)雜且靈敏度有限[4]。而以PCR[5]及ELISA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，不僅需要專業(yè)的技術(shù)研究人員，嚴(yán)格的檢測(cè)環(huán)境而且設(shè)備價(jià)格昂貴[6]。免疫膠體金層析技術(shù)近幾年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域中得到了日益廣泛的應(yīng)用，具有方便快捷、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，但常規(guī)免疫膠體金層析技術(shù)顯色強(qiáng)度具有一定的局限性，不利于肉眼對(duì)陽(yáng)性信號(hào)的判斷。本實(shí)驗(yàn)為了對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，降低疾病發(fā)生范圍和危害，在常規(guī)試紙條免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，首次利用金標(biāo)二抗增強(qiáng)副溶血弧菌試紙條的顯色強(qiáng)度，15m in檢測(cè)結(jié)果即達(dá)到穩(wěn)定，滿足了非專業(yè)人員在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血弧菌單抗 購(gòu)自上?；墼派锛夹g(shù)有限公司；弗氏佐劑、K2CO3、BSA、氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸鈉 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；二抗（羊抗鼠、羊抗兔、驢抗鼠）、TMB顯色液、LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；副溶血弧菌顯色培養(yǎng)基 購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；健康日本大耳朵白兔（雌性） 購(gòu)自南昌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；新鮮活魚 購(gòu)自南昌市周圍超市；濾紙、樣品墊、膠金墊、NC膜、吸水紙、PVC底板、PNPB重懸液復(fù)溶液 中德伯爾生物技術(shù)有限公司提供；副溶血弧菌（ATCC 17802）、副溶血弧菌（CMCC 1.1616）、副溶血弧菌（CMCC 1.997）、副溶血弧菌（PVPA 0125）、霍亂弧菌（ATCC 14035）、霍亂弧菌（ATCC27562）、阪崎腸桿菌（ATCC 51329）、阪崎腸桿菌（CMCC 45402）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 13311）、福氏志賀氏菌（ATCC 29903）、粉塵腸桿菌（PESA5）、單核增生李斯特（ATCC 19115）、大腸桿菌O157∶H 7（EDC）、腸致病性大腸桿菌（CMCC 44496）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 13311）、陰溝腸桿菌（CMCC 45301）、白假絲酵母（Z1）、藤黃微球菌（CMCC 28003）、短雙岐桿菌（WBBR 04）、長(zhǎng)雙歧桿菌（WBLO 01）、青春雙岐桿菌（WBAD 08）、動(dòng)物雙歧桿菌（WBBR 05）、乳雙歧桿菌（WLABO 9）、嬰兒雙岐桿菌（WBAN 07）、兩歧雙歧桿菌（WBBI 01）、唾液乳桿菌（ATCC 11741）、德式乳桿菌（ATCC 9649）、鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）、嗜酸乳桿菌（ATCC 4356）、保加利亞乳桿菌（WLAB 02）、植物乳桿菌（ATCC 8014） 共30株菌株等均為實(shí)驗(yàn)室保存，用20%的甘油保菌，-80℃保存。

BIO-DOT XYZ-3050點(diǎn)噴系統(tǒng)、M illi-Q水處理系統(tǒng)、HGS-201可編程切條機(jī)、ZX-6090B真空干燥箱、卡殼、HG-8膠體金試紙條讀取儀 江西中德生物工程有限公司提供；超聲破碎儀 浙江新芝生物科技公司；DNM 9026全自動(dòng)酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株生長(zhǎng)條件 副溶血弧菌采用含有3.5% NaCl的Luria-Bertani（LB）高鹽液體培養(yǎng)基，35℃過(guò)夜，其他所用菌株采用LB或MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，所有菌株用PBS洗滌經(jīng)甲醛滅活后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多克隆抗體的制備 副溶血弧菌免疫日本大耳朵兔獲得兔抗副溶血弧菌的多克隆抗體[7]。采用間接ELISA方法測(cè)定多抗血清效價(jià)[8]。采用斑點(diǎn)雜交檢測(cè)多抗血清及鼠單抗的特異性，以便于觀察是否與其他雜菌具有交叉反應(yīng)。

1.2.3 多克隆抗體的純化 本實(shí)驗(yàn)參照[9-10]等方法，采用辛酸硫酸銨沉淀和菌體逆向吸附法除去雜蛋白及非特異性的抗體，已獲得特異性針對(duì)副溶血弧菌的兔多抗，但與金黃色葡萄球菌有一定的交叉反應(yīng)[11]。

1.2.4 多克隆抗體與單克隆抗體的配對(duì)實(shí)驗(yàn) 采用雙抗夾心ELISA進(jìn)行抗體的配對(duì)實(shí)驗(yàn)[12]。捕獲抗體的包被：純化的多克隆抗體，從400倍開始稀釋，100μL/孔，設(shè)無(wú)捕獲抗體空白對(duì)照，37℃反應(yīng)1h。用PBST洗滌3次后，用3%的BSA于37℃封閉1h，再用PBST洗滌3次后加入抗原（108CFU/m L）100μL/孔反應(yīng)1h，設(shè)無(wú)抗原對(duì)照孔，洗滌去除多余抗原后，加入購(gòu)買的單克隆抗體，從200倍開始稀釋，設(shè)無(wú)檢測(cè)抗體對(duì)照孔，37℃溫育1h，PBST洗滌3次后加入經(jīng)5000倍稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠的IgG，100μL/孔，37℃溫育30m in后，用PBST洗滌干凈，加入顯色液，100μL/孔，37℃溫育15min后，加入10%的H2SO4，50μL/孔，終止顯色，于450nm下測(cè)定OD值。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)無(wú)捕獲抗體、無(wú)檢測(cè)抗體和無(wú)抗原孔作為陰性對(duì)照孔，排除假陽(yáng)性的干擾。

1.2.5 膠體金的制備 膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法[13]。將100m L 0.01%的HAuCl4溶液加熱煮沸，立即加入1.2m L 1%的檸檬酸三鈉溶液，并不斷攪拌，溶液的顏色由淺黃-藍(lán)色-深藍(lán)-紅色依次變化，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時(shí)，停止加熱，冷卻至室溫，4℃保存。

1.2.6 免疫膠體金的標(biāo)記 將1個(gè)干凈的小燒杯加入2m L膠體金，用48μL的0.2mol/L的K2CO3溶液將pH調(diào)整為8.0。緩慢滴加200μL單抗或羊抗鼠的二抗，使終濃度分別為25μg/m L，磁力攪拌并避光反應(yīng)1h后緩慢加入10%BSA使終濃度1%，常溫下避光攪拌封閉1h。4℃8000r/min轉(zhuǎn)離心30min，棄上清，沉淀用含0.4%Tween-20的PNPB重懸液復(fù)溶，重懸液的用量為標(biāo)記時(shí)膠體金體積的1/10，于4℃保存一周觀察標(biāo)記膠體金的穩(wěn)定性。

1.2.7 免疫層析紙條的制備 硝酸纖維素膜（CN140，檢測(cè)帶為1.5mg/m L的兔多抗，質(zhì)控線為1.0mg/m L驢抗鼠IgG）、吸水墊，依次固定于PVC底板上，切割成4mm的條子，組裝成卡，用放入干燥劑的薄膜包裝，封口，備用。

1.2.8 免疫膠體金標(biāo)記的檢測(cè) 將80μL的106CFU/m L副溶血弧菌菌液（實(shí)驗(yàn)組）及PBS（對(duì)照組）分別加入到2個(gè)組裝好的試紙條（標(biāo)記為0和1）中進(jìn)行層析，5m in后在標(biāo)記為1的試紙條樣品墊上加入4μL的羊抗鼠標(biāo)記的膠體金，再加入80μL的PBS進(jìn)行層析。2m in后由膠體金讀卡儀每隔30s讀取試紙條T線、C線吸光值以及T/C比值，連續(xù)監(jiān)控30m in。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，T線、C線吸光值以及T/C比值為縱坐標(biāo)繪制試紙條免疫動(dòng)力學(xué)曲線，檢測(cè)加入羊抗鼠標(biāo)記的膠體金是否提高顯色效果及確定試紙條定量檢測(cè)的最佳時(shí)間。檢測(cè)線與質(zhì)控線均有條帶為陽(yáng)性，僅質(zhì)控線顯色為陰性，如質(zhì)控線無(wú)條帶，說(shuō)明試紙條失效[14]。

1.2.9 免疫層析試紙條靈敏性的檢測(cè) 副溶血弧菌純培養(yǎng)物，用PBS稀釋成不同的濃度（108、107、106、105CFU/m L），備用。將80μL不同梯度的副溶血菌液滴入加樣孔中，15m in后進(jìn)行檢測(cè)。增強(qiáng)顯色實(shí)驗(yàn)，將80μL不同梯度的副溶血菌液滴入加樣孔中，5min后在加樣孔加入4μL的羊抗鼠標(biāo)記的膠體金，再加入80μL的PBS，根據(jù)1.2.8所確定的最佳時(shí)間，用膠體金讀卡儀進(jìn)行顯色強(qiáng)度的測(cè)定。

1.2.10 食品中試紙條靈敏度的檢測(cè) 取魚肉樣品，碾磨成糜，經(jīng)2層濾紙過(guò)濾后，取濾液混入阪崎腸桿菌與志賀氏菌至終濃度為108CFU/g后，然后摻入不同稀釋度的副溶血弧菌于混入阪崎腸桿菌與志賀氏菌的濾液中，至終濃度為108、107、106、105CFU/g，分別取80μL加入到制備好的試紙條加樣孔中，進(jìn)行增強(qiáng)顯色實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行結(jié)果的觀察。

1.2.11 免疫層系試紙條的異性的檢測(cè) 以副溶血弧菌為陽(yáng)性對(duì)照，材料中各菌株為陰性對(duì)照，進(jìn)行試紙條的特異性檢測(cè)。調(diào)整各菌液的濃度為108CFU/m L，取將80μL各菌液滴入加樣孔中，15m in后進(jìn)行檢測(cè)。1.2.12 檢出率的測(cè)定 將副溶血弧菌按照1.2.9的方法隨機(jī)混入含108CFU/g阪崎腸桿菌、志賀氏菌的魚肉樣本，共接種80份樣品。同時(shí)設(shè)定用無(wú)菌的PBS代替副溶血弧菌的陰性對(duì)照組20份。按照前述方法進(jìn)行副溶血弧菌檢出率的測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理圖

實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，當(dāng)加入檢測(cè)物后，隨著免疫層析的進(jìn)行，目標(biāo)菌與金標(biāo)墊上偶聯(lián)膠體金的鼠單抗發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，被檢測(cè)線上的抗體捕獲，從而使檢測(cè)線顯色，而過(guò)量的膠體金偶聯(lián)的鼠單抗被質(zhì)控線上的驢抗鼠的二抗捕獲從而使質(zhì)控線顯色。當(dāng)加入偶聯(lián)膠體金的羊抗鼠二抗時(shí)，被已經(jīng)在檢測(cè)線捕獲的鼠單抗結(jié)合形成偶聯(lián)物，從而進(jìn)一步提高顯色強(qiáng)度，有利于陽(yáng)性結(jié)果的判斷。

2.2 多克隆抗體和單克隆抗體配對(duì)

通過(guò)間接ELISA對(duì)抗體效價(jià)的檢測(cè)得出：兔多抗的效價(jià)為100萬(wàn)[11]，鼠單抗的效價(jià)為32萬(wàn)。說(shuō)明單抗、多抗均具有較高的效價(jià)。由表1雙抗夾心ELISA的配對(duì)實(shí)驗(yàn)可以看出：在捕獲抗體稀釋12800倍，檢測(cè)抗體稀釋5400倍時(shí)，仍具有較高的OD值（OD值＞0.45）且陰性對(duì)照組OD值均小于0.1，說(shuō)明購(gòu)買的單抗與制備的兔多抗配對(duì)成功，可以用于制備膠體金試紙條。

圖1 試紙條原理圖Fig.1 Test-strip diagram

2.3 試紙條檢測(cè)結(jié)果

偶聯(lián)的膠體金放于4℃一周未發(fā)現(xiàn)死金現(xiàn)象，說(shuō)明偶聯(lián)的膠體金具有很好的穩(wěn)定性。T、C線吸光度比值（T/C比值法）在一定程度上可有效地消除內(nèi)在因素（環(huán)境溫度、不同試紙條的加工差異、樣品中基質(zhì)效應(yīng)）的干擾，實(shí)現(xiàn)試紙條的定量檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)記錄了30m in內(nèi)試紙條T線、C線的顯色強(qiáng)度的變化，結(jié)果如圖2所示，T線、C線吸光值25m in后進(jìn)入穩(wěn)定期（圖2-A，圖2-B），而T/C比值僅需15m in即可進(jìn)入穩(wěn)定（圖2-C）。從圖2可以看出，加入羊抗鼠二抗偶聯(lián)的膠體金可明顯的提高T線的顯色強(qiáng)度，但對(duì)C線及T/C比值影響較小。

表1 多克隆抗體與單克隆抗體雙抗夾心ELISA結(jié)果Table1 Resultof double-antibody sandwich ELISA

從圖3對(duì)106CFU/m L的副溶血弧菌的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可以看出：加入羊抗鼠二抗偶聯(lián)的膠體金能將顯色強(qiáng)度提高5倍，有利于肉眼進(jìn)行觀察，更準(zhǔn)確的對(duì)陽(yáng)性信號(hào)加以判斷，同時(shí)由對(duì)照組（PBS組）可以看出加入羊抗鼠二抗偶聯(lián)的膠體金不會(huì)產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)而引起假陽(yáng)性，說(shuō)明了該方法的可行性。因此下面的實(shí)驗(yàn)均采用該方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 膠體金試紙條免疫動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 The immune kinetic reaction curve of colloidal gold test strip

圖3 免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of Vibrio parahemolyticusis by using the strip test

2.4 免疫層析試紙條靈敏性的檢測(cè)

將80μL不同稀釋度的副溶血弧菌純培養(yǎng)物滴入加樣孔中，待樣品層析完畢后觀察檢測(cè)結(jié)果。如圖4所示，用肉眼可以觀測(cè)到檢測(cè)限為106CFU/m L。

圖4 不同濃度副溶血性弧純培養(yǎng)菌膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of the strip test for Vibrio parahemolyticusis samples at different concentrations

2.5 食品中試紙條靈敏度的檢測(cè)

為了模擬實(shí)際樣本的檢測(cè)效果，驗(yàn)證在魚肉糜樣本的檢測(cè)中，檢測(cè)限是否會(huì)受到食品基質(zhì)和雜菌的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)人工添加副溶血弧菌到含阪崎腸桿菌、志賀氏菌的魚肉糜樣本測(cè)定最低檢出限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在魚肉糜樣本的模擬檢測(cè)中，最低檢測(cè)限均為107CFU/g，如圖5所示。比在純培養(yǎng)物樣本中的檢測(cè)限要高（見圖4），可能是由于魚肉糜樣本成分的復(fù)雜對(duì)檢測(cè)限有一定的影響，但高濃度雜菌不影響該方法的特異性。

圖5 魚肉糜樣品中副溶血弧菌膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of the strip test for Vibrio parahemolyticusis in fish paste samples

2.6 試紙條特異性的檢測(cè)

以副溶血弧菌（ATCC 17802）為陽(yáng)性對(duì)照，材料中各菌的菌液分別取80μL用膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，副溶血弧菌不同菌株檢測(cè)后試紙條的T、C線均顯色，結(jié)果為陽(yáng)性。各常見菌株及PBS空白組只有C線顯色，結(jié)果為陰性，如表2所示。結(jié)果說(shuō)明改進(jìn)的膠體金試紙條能對(duì)不同的副溶血性弧菌檢測(cè)成陽(yáng)性結(jié)果，但對(duì)相近種屬的霍亂弧菌及其他常見菌株均無(wú)交叉反應(yīng)，表明該方法制備的膠體金試紙條較高的特異性。

表2 副溶血弧菌膠體金免疫層系試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果Table2 Specificity of the strip test in detection of Vibrio parahemolyticusis

圖6 3株不同副溶血性弧菌膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection results of the strip test for three different Vibrio parahemolyticusis

2.7 模擬實(shí)際樣本的檢出測(cè)定

模擬實(shí)際樣本檢測(cè)的結(jié)果在80個(gè)陽(yáng)性樣本中有79份顯示陽(yáng)性，檢出率為98.7%，在陰性對(duì)照組中均未檢出，說(shuō)明該方法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表3 模擬實(shí)際樣本的檢出測(cè)定Table3 Determination of actual sample

3 結(jié)論與討論

免疫膠體金層析技術(shù)是繼免疫熒光、酶免疫和放射免疫后發(fā)展的一種新技術(shù)，因具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，樣品不需要特殊處理及不需借助復(fù)雜設(shè)備僅用肉眼就能判斷結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于野外及實(shí)驗(yàn)條件不具備的場(chǎng)所使用[15]，現(xiàn)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)檢測(cè)和診斷方面得到廣泛應(yīng)用[16]。

試紙條的靈敏度、特異性與所用的捕獲抗體與檢測(cè)抗體具有直接的關(guān)系，當(dāng)抗體的特異性好時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的靈敏性與特異性。本實(shí)驗(yàn)所用的單抗較好的特異性相關(guān)，所以膠體金標(biāo)記的單抗對(duì)常見的一些菌株均沒(méi)有交叉反應(yīng)的現(xiàn)象。在副溶血弧菌試紙條檢測(cè)中，為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，本研究在常規(guī)試紙條免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用羊抗鼠的抗體能與鼠單抗特異性免疫結(jié)合，而與兔多抗不結(jié)合的原理，進(jìn)行免疫試紙條的檢測(cè)。當(dāng)檢測(cè)線上的兔多抗捕獲到抗原抗體復(fù)合物時(shí)，即能與膠體金標(biāo)記的羊抗鼠的二抗免疫結(jié)合，從而使更多的膠體金在檢測(cè)線上得到聚集，提高了顯色強(qiáng)度，有利于肉眼進(jìn)行觀察。當(dāng)檢測(cè)線上未捕獲到鼠單抗時(shí)，即不能與膠體金標(biāo)記的羊抗鼠的二抗免疫結(jié)合，因此不會(huì)改變?cè)嚰垪l的特異性。加入膠體金標(biāo)記的羊抗鼠的二抗時(shí)，能明顯的提高檢測(cè)限的顯色強(qiáng)度，方便了結(jié)果的判斷。由于在周邊超市所購(gòu)買的魚肉樣本中副溶血弧菌均未檢出，所以實(shí)驗(yàn)中采用添加菌到魚肉糜樣本中模擬實(shí)際樣品。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)模擬樣品時(shí)出現(xiàn)1例假陰性可能的原因：溫度的影響，溫度過(guò)低反應(yīng)速度降低，從而使弱陽(yáng)性不能完全顯示出來(lái)；灰塵、風(fēng)的影響，灰塵落在試紙條上及風(fēng)吹影響樣品的擴(kuò)散速度，導(dǎo)致結(jié)果不能正常觀察。本實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)純培養(yǎng)物及魚肉糜樣本中的檢測(cè)限分別為106CFU/m L和107CFU/g，且高濃度雜菌的存在不影響檢測(cè)靈敏度和特異性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，副溶血弧菌膠體金免疫層系試紙條具有較好的特異性及靈敏度，結(jié)合試紙條在15m in內(nèi)就可以完成快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，說(shuō)明該試紙條比酶聯(lián)免疫技術(shù)、PCR技術(shù)具有更廣泛的適用范圍，對(duì)常見細(xì)菌性食物中毒的初篩具有重要意義。

[1]林秋云，曾樹權(quán)，尹映華，等.一起副溶血性弧菌引起食物中毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24（2）：178-180.

[2]丁建華，周壽榮.一起副溶血弧菌引起的學(xué)生集體食物中毒[J].中國(guó)校醫(yī)，2004，18（12）：155-157.

[3]劉秀梅.食源性疾病監(jiān)控技術(shù)的研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2004，16（1）：3-9.

[4]Habib I，Sampers I，Uyttendaele M，et al.Performance characteristics and estimation of measurement uncertainty of three plating procedures for Campylobacter enumeration in chickenmeat[J].Food Microbiology，2008，25（1）：65-74.

[5]Lehmann LE，Hunfeld K-P，Emrich T，et al.A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood samples[J].MedicalMicrobiology and Immunology，2008，197（3）：313-324.

[6]Madi M，Hamilton A，Squirrell D，et al.Rapid detection of foot-and-mouth disease virus using a field-portable nucleic acid extraction and real-time PCR amplification platform[J].The Veterinary Journal，2012，193（1）：67-72.

[7]鄭晶，申洪.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶的基因克隆，蛋白表達(dá)，抗體制備及其致病性研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2008.

[8]王謙.抗鏈霉素單克隆抗體制備與ELISA方法的建立[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[9]Perosa F，Carbone R，F(xiàn)errone S，et al.Purification of human immunoglobulins by sequential precipitation with caprylic acid and ammonium sulphate[J].Journal of Immunological Methods，1990，128（1）：9-16.

[10]張燕欣，趙云英，李富桂.應(yīng)用辛酸硫酸銨法提純兔抗雞傳染性法氏囊病IgG抗體[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（1）：106-108.

[11]王報(bào)貴，武曉麗，董素琴，等.副溶血弧菌的磁珠捕獲及檢測(cè)[J].食品工業(yè)科技，2013，34（13）：147-152.

[12]黃嶺芳.快速檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7膠體金免疫層析方法的建立[D].南昌：南昌大學(xué)，2011.

[13]宋宏新，符海英，薛海燕，等.兩種膠體金制備方法的比較研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，33（1）：53-56.

[14]Banchongaksorn T，Hurtado A JC，Chauhan V，etal.A rapid dipstick antigen capture assay for the diagnosis of falciparum malaria[J].Bulletin of the World Health Organization，1996，74（1）：47-54.

[15]王振東，姜超，楊宇，等.貝氏柯克斯體重組抗原P1表達(dá)純化及膠體金免疫層析方法的建立[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2012，23（4）：285-288.

[16]曾小軍，陳紅根，袁建華，等.快速膠體金免疫層析法的建立及其對(duì)血吸蟲病的診斷效果[J].中國(guó)血吸蟲病防治雜志，2005，17（1）：24-27.