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（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000；2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046）

豬瘟病毒C株雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建及單克隆抗體的制備與鑒定

楊明1，陳伯祥1，郭慧琳2，李杰1，豆林濤1

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000；2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046）

采用豬瘟病毒C株毒（CSFV C strain）免疫BALB/C小鼠，按照常規(guī)單克隆抗體制作方法構(gòu)建并篩選出能穩(wěn)定分泌抗豬瘟單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株4株，分別命名為1C9，1B11，3C8和3G9，經(jīng)鑒定，4株單克隆抗體腹水效價達(dá)到104～106。交叉試驗及特異性試驗表明，所制備的McAb與鴿新城疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、雞減蛋綜合征病毒無交叉反應(yīng)性，均完全針對豬瘟病毒（CSFV）抗原決定簇，具有高度特異性?？笴SFV McAb的成功制備，為進(jìn)一步研究建立CSFV的快速診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

豬瘟C株；雜交瘤細(xì)胞；單克隆抗體；鑒定

豬瘟是由豬瘟病毒（CSFV）引起的豬的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病，呈世界性分布，是豬的最重要傳染病之一。豬感染了CSFV后不但發(fā)病造成較高的死亡率，而且還具有不斷排毒的危險性。鑒于其危害程度高，對養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失巨大，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將本病列入法定報告?zhèn)魅静1-3]。自50年代以來，隨著豬瘟兔化弱毒中國株等疫苗的推廣應(yīng)用，我國豬瘟疫情得到了有效的控制。然而近年來國內(nèi)外仍有豬瘟散發(fā)性流行的報道，其原因除了豬瘟病毒在野外長期馴化發(fā)生了變異外，還在于不能及時確診而不能及早清除傳染源。要消滅豬瘟就需要建立一種快速準(zhǔn)確的診斷技術(shù)。單克隆抗體是具有高度特異性和靈敏性的免疫學(xué)診斷試劑，制備抗CSFV 單克隆抗體對豬瘟的臨床診斷、病原學(xué)研究及其在宿主細(xì)胞中的增殖和定位都有重要意義[4-6]。本研究通過細(xì)胞融合技術(shù)制備了抗CSFV 單克隆抗體，為豬瘟快速診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及實驗動物 豬瘟兔化弱毒株為豬瘟兔淋脾毒，由本所課題組保存；PK-15細(xì)胞，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所饋贈；SP2/0細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；BALB/C小鼠，購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所小動物室，18～20g，6～8周齡，雌性；家兔，購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所小動物室，體重約1.5Kg；鴿新城疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒PL株和SH株及EDS-76病毒均由本所課題組保存。

1.1.2 試劑 DMEM、RPMI-1640（GIBCO）；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone）；新生牛血清、胎牛血清（杭州四季青）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（Sigma）；L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、Hepes、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷、 氨基喋呤、8-氮鳥嘌呤、牛血清白蛋白、羊抗小鼠IgGHRP、Tween-20（Solarbio）；PEG1500（Merck）；30%H2O2（上海生工）；Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit（Roche）；四蒸水（本實驗室自制）。

1.1.3 主要器材 CO2培養(yǎng)箱（上海一恒）；DNM9602A型酶標(biāo)分析儀（北京普朗）；倒置生物顯微鏡（廣西）；-86℃超低溫冰箱（上海楓田）；臺式高速冷凍離心機(jī)（HEAL FORCE）；核酸蛋白檢測儀四件套（上海天呈）；SP-752型紫外可見分光光度計（上海）；96孔、24孔細(xì)胞板（coaster）等耗材，均由Solarbio公司提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原制備

1.2.1.1 豬瘟兔化弱毒病毒液的制備 選擇成年健康家兔4只，耳靜脈注射處理好的豬瘟弱毒，1mL /只。另設(shè)對照4只，每隔12h測量家兔體溫，當(dāng)體溫連續(xù)三次超過正常值1℃或1℃以上的家兔立即撲殺，無菌取其脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，置無菌研缽研磨，加適量滅菌生理鹽水，離心后取上清，制成豬瘟兔化弱毒病毒液備用。

1.2.1.2 病毒的濃縮和提純 取培養(yǎng)24h、生長良好的80%單層PK-15細(xì)胞，吸出舊培養(yǎng)液，取CSFV弱毒株，用DMEM不完全培養(yǎng)基稀釋，接種于細(xì)胞，加入量剛好蓋過瓶底為止，塞好膠塞，感作1h，吸出病毒感染液，同時換上PK-15維持液，塞緊膠塞，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。接種病毒60 h后的細(xì)胞反復(fù)凍融3次，收集毒液。在收集的病毒液中緩慢加入PEG6000和NaCl，搖勻，使最終濃度PEG6000為7.5%，NaCl為0.3M，1mol/L NaOH調(diào)pH值至7.5，置4℃過夜。第二天10000r/min離心30min，棄去上清液，將沉淀懸浮于pH7.5的TNE緩沖液（（0.05M Tris HCl，1M EDTA，0.1M NaCl） 中，約相當(dāng)于原液的2%，置4℃冰箱過夜，其間攪拌幾次。第二天4℃10000r/ min離心30min，去除沉淀，吸取上清液備用進(jìn)行Sephadex G-200凝膠過濾。

1.2.1.3 Sephadex G-200凝膠純化 將Sephadex G-200凝膠煮沸，漂洗，活化后裝柱，平衡。取上一步濃縮物加至平衡好的Sephadex G-200柱子內(nèi)進(jìn)行純化，用BSZ-100電子鐘控自動部份收集器收集樣品，用SP-752紫外可見分光光度計測量洗脫物的分布。用ELISA鑒定純化后的豬瘟弱毒，測定蛋白含量后備用。

1.2.2 動物免疫 選6-8周齡雌性BALB/C小鼠，用上述提純的豬瘟弱毒抗原，免疫3次，每次間隔兩周，第一次抗原加等量的弗氏完全佐劑，經(jīng)乳化分點注射于小鼠背部皮下，共注射0.2mL；第二次加等量的弗氏不完全佐劑，方法同前；第三次不加佐劑腿部肌肉注射，10d后尾部采血測血清效價，達(dá)到要求時于融合前3d加強(qiáng)免疫用不含佐劑的等量抗原腹腔注射，3d后融合。

1.2.3 檢測豬瘟抗體間接ELISA方法的確定 將制備的病毒包被抗原稀釋成150μg/mL，用包被液稀釋抗原從1:5稀釋到1:20，100μL /孔包被酶標(biāo)板；將陽性和陰性血清用血清稀釋液由1:200稀釋到1:1000；用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋成由1:2400 稀釋到1:8000，采用間接ELISA方法進(jìn)行方陣實驗。用酶標(biāo)分析儀測定OD490值，記錄結(jié)果。以P/N≥2.0的抗原、陽性、酶標(biāo)二抗的最大稀釋度作為抗原、陽性血清和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度。

1.2.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立 將免疫好的小鼠眼球采血后，無菌取出脾臟，除去脂肪及結(jié)締組織，將脾臟剪成小段，用滅菌注射器內(nèi)芯碾壓脾臟使淋巴細(xì)胞釋放出來，吸出細(xì)胞懸液。1000r/min離心10min，脾細(xì)胞重懸于RPMI-1640不完全培養(yǎng)基中，計數(shù)，備用。將骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）融合前24h換液培養(yǎng)，融合當(dāng)天，取生長良好細(xì)胞的用不完全RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕吹下，收集，1000r/ min離心10min，重懸于不完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，計數(shù)，備用。將SP2/0細(xì)胞及脾細(xì)胞兩種細(xì)胞按l:10（1×107:1×108）的比例混合于離心管，用50%的PEG1500作為融合劑進(jìn)行細(xì)胞融合，加入含1 %HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，小心吹散混勻細(xì)胞，在準(zhǔn)備好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上每孔加入0.1mL融合細(xì)胞懸液置37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后應(yīng)每日觀察細(xì)胞的生長情況。骨髓瘤細(xì)胞多在融合后2～3d內(nèi)明顯退化，細(xì)胞縮小、核濃縮、破碎。巨噬細(xì)胞增生、肥大，并開始吞噬細(xì)胞碎片。第6天可見隆狀雜交廇細(xì)胞生長。此時觀察判斷每孔的細(xì)胞克隆情況，并作好記錄。一般融合后6～7d，每孔移去HAT培養(yǎng)液0.1mL，補(bǔ)加等量的HT培養(yǎng)液。待融合后的細(xì)胞生長到覆蓋細(xì)胞孔底部1/4～1/3時，細(xì)胞生長良好時，可用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測上清液中的抗體，檢測為陽性的細(xì)胞孔采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，陰性孔3d后再檢測一次，如仍為陰性則棄之。對陽性孔采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，進(jìn)行3次克隆和亞克隆，直到所有的孔都為陽性。最后選擇OD490值高、細(xì)胞活力好的細(xì)胞孔，轉(zhuǎn)入24孔板，繼而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時凍存。

1.2.5 單克隆抗體腹水的生產(chǎn) 取10周齡BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL滅菌液體石蠟油進(jìn)行預(yù)處理。1周后，將生長良好雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞輕吹下，1000r/min離心10min后棄上清，細(xì)胞重懸于不完全1640培養(yǎng)基中，計數(shù)并調(diào)細(xì)胞數(shù)至1.5×106個/mL。每只小鼠腹腔注射0.5mL。待小鼠腹部膨大，用注射器采集腹水，將腹水3000 r/ min離心20min，收集上清，分裝后-80℃保存。

1.2.6 單克隆抗體效價測定 用豬瘟弱毒抗原包被酶標(biāo)板，測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水的效價，同時以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和SP2/0誘生的陰性腹水做陰性作為對照。以P/N≥2.0的抗體最大稀釋度作為效價終值。

1.2.7 單克隆抗體亞類及染色體數(shù)測定 采用Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit進(jìn)行單克隆抗體亞型鑒定。染色體計數(shù)參照文獻(xiàn)[7]介紹的方法進(jìn)行。秋水仙素阻抑雜交瘤細(xì)胞分裂中期，加入KCl低滲處理，固定液固定，制片，染色鏡檢。

1.2.8 單克隆抗體特異性試驗 用間接ELISA方法測定單克隆抗體分別與鴿新城疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗。

1.2.9 雜交瘤細(xì)胞凍存和復(fù)蘇及穩(wěn)定性檢驗 雜交瘤細(xì)胞的凍存：選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，輕輕將細(xì)胞從瓶壁上吹下，1000 r/min離心10min，棄上清，用凍存液將細(xì)胞沉淀懸浮，分裝于細(xì)胞凍存管中，1mL/管，加蓋封嚴(yán)，注明細(xì)胞名稱，凍存日期。將凍存管置4℃冰箱1h，-20℃1h，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱過夜，次日移入液氮中。

雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水中，輕輕晃動使其盡快融化。1000 r/min離心10 min，棄上清。用含20%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將沉淀懸浮，加入細(xì)胞瓶，置37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)8代，并檢測培養(yǎng)上清液中的抗體效價，檢查細(xì)胞株分泌抗體的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 豬瘟兔化弱毒病毒液的制備

豬瘟弱毒接種家兔后，家兔體溫陸續(xù)升高，家兔體溫變化情況見圖1。對體溫連續(xù)三次超過正常值1℃或1℃以上的家兔立即進(jìn)行撲殺，取其淋巴結(jié)及脾臟，研磨加適當(dāng)生理鹽水離心后取上清制成病毒液。

圖1 家兔體溫曲線

從圖1可見，1、2、3、4號兔在注射弱毒后，第三天體溫開始超過正常體溫，第四天可以捕殺采集病毒。

2.2 蛋白含量

純化收集樣品稀釋后用SP-752紫外可見分光光度計測量OD2600.088和OD2800.072，50倍稀釋。按公式（1.45×OD280～0.74×OD260）×稀釋倍數(shù)，計算得濃縮抗原的蛋白含量為1.964mg/mL。

2.3 間接ELISA法檢測單克隆重抗體中血清和酶最佳工作濃度的確定

根據(jù)矩陣法，將制備純化的豬瘟病毒先用包被抗原稀釋成150μg/mL，再用包被液稀釋抗原確定純化豬瘟病毒抗原最佳工作濃度為1:10，即最佳包被條件時病毒的蛋白含量為15μg/mL；陰陽性血清最佳工作濃度為1:600；最佳酶標(biāo)二抗工作濃度為1:6400。

2.4 免疫小鼠血清效價

用分離提純的豬瘟弱毒與弗氏佐劑等量乳化制備免疫抗原，小鼠通過背部皮下分點注射進(jìn)行免疫，第三次不加佐劑后腿肌肉注射免疫，三次免疫后10d尾靜脈采血分離血清，稀釋后進(jìn)行間接ELISA檢測血清效價，結(jié)果見表1。

表1 小鼠免疫血清效價測定結(jié)果

2.5 細(xì)胞融合與克隆

將免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞用PEG 1500方法進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)不斷改進(jìn)技術(shù)，最后細(xì)胞融合率達(dá)到了90%以上，陽性率為10%。將10株陽性單克隆細(xì)胞株用有限稀釋法進(jìn)行3次克隆，經(jīng)檢測和篩選最終獲得能夠穩(wěn)定分泌抗CSFV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞4株，隨著克隆代數(shù)的增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清CSFV抗體OD490值逐步升高，到第3次克隆時最終達(dá)到穩(wěn)定。

2.6 單克隆抗體腹水的制備及抗體效價

滅菌液體石蠟油處理BALB/C小鼠，1周后分別接種4株陽性雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部膨大，用注射器無菌抽取腹水。將腹水3000 r/min離心20 min，收集上清，進(jìn)行效價測定，結(jié)果見表2。由表2可知，雜交瘤細(xì)胞的腹水抗體效價為104-106以上，細(xì)胞培養(yǎng)液的效價為1:1600-1:6400。

表2 不同雜交瘤細(xì)胞株在腹水和細(xì)胞培養(yǎng)液效價的測定結(jié)果

2.7 單克隆抗體亞類及染色體數(shù)測定

篩選出的4株單克隆細(xì)胞株經(jīng)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit試劑盒檢測后，3G9亞類為IgG1，1C9、1B11和3C8的抗體亞類均為lgG2b，4株單抗的輕鏈為κ鏈。經(jīng)染色體計數(shù)，4株雜交瘤細(xì)胞株的平均染色體數(shù)為92～103條，符合雜交瘤細(xì)胞株的規(guī)律87～110條，與理論值相符。

2.8 單克隆抗體特異性試驗

用間接ELISA檢測單克隆抗體與其它病毒的交叉反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它只與豬瘟病毒呈陽性反應(yīng)，而與鴿新城疫病毒、豬呼吸繁殖綜合癥病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒都不發(fā)生交叉反應(yīng)，說明這4株單克隆抗體都是針對豬瘟病毒的特異性單克隆抗體。

2.9 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢驗

對4株克隆后雜交瘤細(xì)胞在凍存前后各連續(xù)培養(yǎng)8代，并用間接ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中的抗體效價，結(jié)果傳代過程中和復(fù)蘇前后抗體效價沒有明顯變化，這說明各株雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體的能力穩(wěn)定。

3 討論

單克隆抗體是用預(yù)先免疫小鼠的脾細(xì)胞與能在體外無限生長的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成具有雙親特征的雜交瘤細(xì)胞，通過克隆化得到來自單個細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞系，它們分泌的是針對同一抗原決定簇、分子具有高度同質(zhì)性和特異性的抗體。單克隆抗體技術(shù)是1975年法國的Kohler和英國的Milstein用細(xì)胞融合技術(shù)獲得了第一株能分泌抗羊紅細(xì)胞單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。此后，單克隆抗體的研制與應(yīng)用已成為醫(yī)學(xué)、動物學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和食品衛(wèi)生等領(lǐng)域的研究熱點[7]。

豬瘟病毒只有一個血清型，常規(guī)血清學(xué)方法很難將其從不同地區(qū)不同時間分離的毒株區(qū)分開來。近年的研究表明，不同地區(qū)分離的CSFV毒株的抗原性差異不大，但病毒的遺傳特性上有差異。用單克隆抗體與不同毒株間的反應(yīng)性的差別來分析CSFV不同毒株之間微小的抗原差異，是目前研究較多的一種較好的方法[8-10]。

1985年Wenvoort G C首次應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)的豬瘟病毒免疫小鼠建立和制備13株抗豬瘟病毒的McAb以來[11]，McAb不僅在豬瘟診斷方面得到廣泛應(yīng)用，而且越來越多的抗豬瘟病毒的McAb被制備并應(yīng)用于豬瘟病毒的分子生物學(xué)研究。

豬瘟病毒為單股正鏈RNA病毒，其基因組編碼一個多聚蛋白，經(jīng)宿主細(xì)胞的病毒蛋白酶后產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白，豬瘟病毒自然感染后，可產(chǎn)生針對E2、Erns和NS3蛋白的抗體，目前，國內(nèi)外能夠穩(wěn)定分泌針對這三種蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞均有構(gòu)建成功的報道[12-16]，國內(nèi)外的學(xué)者也借助豬瘟單克隆抗體建立了一系列針對豬瘟的抗原和抗體診斷方法[17-20]。

用CSFV的McAb可用于引起豬瘟爆發(fā)流行的CSFV毒株進(jìn)行流行病學(xué)跟蹤研究。由于McAb具有一定的分“型”能力，只能檢出病毒的表型差異，而不能檢測到病毒的變異；而且，用于病毒分型的大部分McAb可能只對少數(shù)具有高免疫原性的位點呈現(xiàn)反應(yīng)性，可能僅作用于該病毒的一小部分區(qū)域，故難以應(yīng)用McAb全面和深入地闡明CSFV及其相關(guān)病毒的內(nèi)在結(jié)構(gòu)、組成和相互關(guān)系。目前PCR技術(shù)與核酸測序技術(shù)相結(jié)合被廣泛用于豬瘟病毒的分子流行病學(xué)研究。

本試驗以豬瘟弱毒免疫兔子，取其脾臟、淋巴結(jié)制備種毒，在PK15細(xì)胞是增殖，PEG6000濃縮病毒，經(jīng)Sephadex G-200純化后免疫BALB/C小鼠，經(jīng)過多次細(xì)胞融合和亞克隆篩選，最終篩選出4株高效分泌抗CSFV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。4株雜交瘤細(xì)胞的腹水抗體效價為達(dá)104-106以上，細(xì)胞培養(yǎng)液的效價為達(dá)1:1600-1:6400。單克隆抗體特異性鑒定和雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測定等試驗表明，所制備的單克隆抗體與其他抗原無交叉反應(yīng)性，具有較高的特異性和敏感性；所制備的雜交瘤細(xì)胞無論是連續(xù)傳代培養(yǎng)還是凍存后復(fù)蘇傳代均能穩(wěn)定分泌特異性抗體。該單克隆抗體的成功制備，為下一步相關(guān)ELISA檢測方法的建立、免疫層析快速診斷試紙的制備及基于單抗技術(shù)的豬瘟強(qiáng)弱毒的鑒別診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation and Identifcation of Monoclonal Antibodies against Classical Swine Fever Virus C Strain

Yang Ming1，Chen Boxiang1，Guo Huilin2，Li Jie1，Dou Lintao1
（1. Gansu Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Pingliang，Gansu 744000；2. Gansu Province Animal Disease Prevention and Control Center，Lanzhou，Gansu 730046）

Four monoclonal antibodies designated as 1C9，1B11，3C8 and 3G9 against classical swine fever virus C strain（CSFV C strain） were generated by immunization of BALB/C mice with purifed CSFV C strain. The titers of ascetic fuids of the four McAbs were up to 104～106in indirect ELISA. The McAbs were only positive against CSFV，and negative against Newcastle disease virus of pigeon，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，transmissible gastroenteritis virus and egg drop syndrome virus. The preparation of the McAbs provided a basis to establish rapid diagnostic method of CSFV．

CSFV C strain；hybridoma；monoclonal antibody；identifcation

S852.651

A

1005-944X（2014）08-0065-06

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目（GNSW-2005-15）

陳伯祥