，，

（1.濟(jì)南出入境檢驗檢疫局，山東濟(jì)南 250014；2.山東正邦養(yǎng)殖有限公司，山東濟(jì)南 250010）

LAMP快速檢測犬傳染性肝炎方法的建立及應(yīng)用

曹丙蕾1，凌宗帥1，邱洪凱2

（1.濟(jì)南出入境檢驗檢疫局，山東濟(jì)南 250014；2.山東正邦養(yǎng)殖有限公司，山東濟(jì)南 250010）

根據(jù)GenBank上公布的犬腺病毒I型（CAV-I）E3基因序列，設(shè)計了3對特異性環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）引物，以CAV-I DNA為模板，通過條件優(yōu)化建立了犬傳染性肝炎LAMP快速檢測方法，該方法能夠在63℃恒溫下30min內(nèi)實現(xiàn)目的核酸的大量擴(kuò)增，在可見光下即可直接觀察擴(kuò)增產(chǎn)物熒光顏色變化來判定結(jié)果。特異性和靈敏度試驗表明，該LAMP檢測方法只對CAV-I有特異性擴(kuò)增，對其他無關(guān)核酸無擴(kuò)增。與常規(guī)PCR檢測相比，LAMP的檢測靈敏度較好，最低檢出限為10-7TCID50，是PCR檢測方法的100倍。臨床樣品檢測結(jié)果表明，LAMP陽性檢出率為36%，與病毒分離鑒定的結(jié)果符合率達(dá)96.8%，與PCR檢測的結(jié)果符合率達(dá)100%，且快速簡便，成本低，適用于基層實驗室的快速疾病診斷。

LAMP；犬傳染性肝炎；犬腺病毒I型

犬傳染性肝炎（infectious canine hepatitis，ICH）是由犬腺病毒I型（canine adenovirus I，CAV-I）感染引發(fā)的犬的一種急性敗血性傳染病。該病于1925年首次被發(fā)現(xiàn)[1]，1984年，我國首次分離到該病毒，CAV-I在臨床上可導(dǎo)致犬傳染性肝炎、狐貍和熊腦炎等疾病的發(fā)生[2]。臨床上以肝小葉中心壞死、肝實質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)包涵體以及出血為特征，常引起急性壞死性肝炎和角膜混濁（即藍(lán)眼?。3-4]。該病以剛斷乳到一歲以內(nèi)的幼犬感染率和死亡率為最高，死亡率可高達(dá)40%[2]。本病在世界范圍內(nèi)流行，既嚴(yán)重威脅著家養(yǎng)寵物的身體健康，又對我國養(yǎng)犬業(yè)、皮毛動物養(yǎng)殖業(yè)等危害較大，給養(yǎng)犬業(yè)和寵物愛好者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

突然發(fā)病和出血時間延長是犬傳染性肝炎的暗示，重癥病例初期與犬瘟熱極為相似，僅靠臨床癥狀和病理變化難以進(jìn)行鑒別診斷，確診尚需依賴于實驗室特異性診斷，如病毒分離、血凝抑制試驗及皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)等檢測方法，而且還要與犬瘟熱進(jìn)行鑒別診斷[4-6]。針對病毒核酸的檢測，無論從特異性、靈敏度還是檢測效率角度考慮都可視為最佳方法。

目前，PCR、熒光定量PCR、分子雜交等技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用于各類疾病的快速診斷當(dāng)中，較高的檢測成本以及昂貴的檢測儀器都限制了技術(shù)的推廣應(yīng)用。LAMP檢測方法是Notomi等報道的一種新穎核酸擴(kuò)增技術(shù)，即核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，利用4條或6條特異性引物，在恒溫條件60～65℃下1h內(nèi)其擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010個數(shù)量級，結(jié)果易判定[7]。本文利用快速、高效、簡便的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplifcation assay，LAMP）技術(shù)對犬傳染性肝炎進(jìn)行檢測應(yīng)用，選取保守序列片段，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了直觀、可視化的一步法LAMP方法，大大提高了結(jié)果準(zhǔn)確率，降低檢測成本，縮短檢測周期，為基層現(xiàn)場檢驗檢疫提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 生物材料。

犬傳染性肝炎病毒、犬細(xì)小病毒病、鴨瘟病毒等病毒樣品及臨床樣品由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院謝之景教授提供。

1.1.2 試劑及耗材。

Bst DNA聚合酶購自NEB公司；2000bp DNA Marker、dNTPs、病毒DNA/RNA提取試劑盒、組織DNA提取試劑盒、Taq DNA酶等購自Takara公司；恒溫擴(kuò)增試劑、熒光染料（鈣黃綠素與氯化錳）均為廣州迪澳（DEAOU）公司產(chǎn)品；引物和探針?biāo)徒簧虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)服務(wù)有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物的設(shè)計。

根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列，通過MegAline找出CAV-I的相對保守序列E3，利用Primer Explorer V4在線軟件（http：//primerexplorer.jp/）設(shè)計LAMP引物，其中包括2條外引物（F3/ B3）、2條內(nèi)引物（FIP/BIP）和2條環(huán)引物（LF/ LB）（表1）[7-9]及犬腺病毒PCR檢測的2條檢測引物（表2）[6，9]。

表1 犬腺病毒I型LAMP的引物序列

表2 犬腺病毒I型E3基因的PCR檢測引物序列

1.2.2 反應(yīng)模板的制備。

根據(jù)病毒DNA/RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行病毒核酸的提取，提取產(chǎn)物于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立。

參照Nagamine等[7-8]方法，制備LAMP的反應(yīng)體系，在25μL的反應(yīng)體系中，添加熒光染料鈣黃綠素作為熒光指示劑，并對Mg2+、dNTP、Betaine、內(nèi)外引物的濃度和反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等條件進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)混合物置于恒溫金屬浴中在59，60，61，62，63，64，65℃恒溫下分別作用30min、45min、50min和55min，80℃孵育2min終止反應(yīng)，通過交叉試驗進(jìn)行條件優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光顏色來判定結(jié)果，最終確立最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，建立LAMP檢測方法[8，10-11]。

1.2.4 PCR檢測CAV方法與LAMP方法的比較。

以提取的CAV-I病毒基因組DNA為模板，CAV-F、CAV-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置PCR反 應(yīng) 體 系：10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+（25mM）1μL，dNTP Mixture（2.5mM）2μL，Taq DNA酶（1U/μL）0.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板1μL，ddH2O補(bǔ)充至25μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 1min，55℃30s，72℃ 30s，共35個循環(huán)；72℃ 7min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR檢測結(jié)果與LAMP檢測方法進(jìn)行比較，來分析LAMP方法的檢測優(yōu)勢。

1.2.5 LAMP特異性檢測。

以CAV-I、犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、鴨瘟病毒（DPV）和藍(lán)耳病病毒（PRRSV）的核酸作為待測樣品模板，設(shè)立陰性對照進(jìn)行LAMP，觀察結(jié)果，檢驗LAMP方法的特異性 [8，12]。

1.2.6 LAMP的靈敏性檢測。

對CAV-I病 毒（TCID50為10-4.12/0.1mL） 進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8TCID50，提取模板DNA進(jìn)行LAMP試驗，觀察結(jié)果檢測LAMP方法的靈敏度[8，12]。

1.2.7 LAMP檢測方法的應(yīng)用。

對28份臨床檢驗疑似患病的待檢病料，核酸提取后進(jìn)行LAMP檢測，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光顏色變化來判定檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測方法的建立

通過對Mg2+、dNTP、Betaine、內(nèi)外引物的濃度等條件的優(yōu)化，確立最優(yōu)反應(yīng)體系，即10×Thermo Pol Buffer 2.5μL，Mg2+（25mM）2.5μL，dNTP（10mM each）4μL，F(xiàn)IP和 BIP（均為50 μM）1μL，F(xiàn)3和B3（均為50 μM）0.25μL，LF和LB（ 均 為50μM）0.5μL， 熒光 染 料 2μL，Betaine（5 M）4μL，Bst DNA polymerase（8U/μl）1μL，模板DNA 2μL，補(bǔ)水至總體積25μL。

通過ABI 7500進(jìn)行熔解曲線分析，63℃時反應(yīng)出現(xiàn)的熒光值最高，說明LAMP在此溫度下擴(kuò)增效率最高，重復(fù)進(jìn)行3次同樣的試驗，均取得相似的結(jié)果。

在30min、45min、50min和55min的作用時間下觀察發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果差異不明顯，均獲得較好的結(jié)果，且效率較高，故確定30min為最佳反應(yīng)時間。因此，本文建立的LAMP反應(yīng)優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：最佳反應(yīng)溫度為63℃，最佳反應(yīng)時間為30min，80℃作用2min終止反應(yīng)。結(jié)果判定直接用肉眼進(jìn)行直觀觀察，陽性反應(yīng)管呈現(xiàn)明顯的翠綠色，而陰性對照則為淡橙色。

CAV-I進(jìn)行PCR對比檢測結(jié)果如圖1所示，目的片段大小與預(yù)期大小相符。

圖1 CAV-I的PCR檢測擴(kuò)增出590bp的片段

2.2 LAMP檢測方法的靈敏性

對CAV-I病毒作10倍系列稀釋后進(jìn)行LAMP檢測，結(jié)果表明，LAMP的最低檢測限為10-7TCID50（圖2）。與PCR反應(yīng)擴(kuò)增后的電泳結(jié)果進(jìn)行比較，LAMP方法的最低檢測限比普通PCR靈敏度高100倍（數(shù)據(jù)圖略）。

圖2 LAMP的靈敏度檢測

2.3 LAMP檢測方法的特異性

特異性試驗結(jié)果表明，CAV-I陽性反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)果特異性好，肉眼觀察熒光顏色清晰可見，呈翠綠色，CDV、CPV、DPV和PRRSV的非目的性擴(kuò)增和陰性反應(yīng)無任何明顯顏色變化，無特異性擴(kuò)增（圖3）。與PCR反應(yīng)擴(kuò)增后的電泳結(jié)果一致。

圖3 LAMP的特異性檢測

2.5 臨床檢驗

應(yīng)用本試驗建立的LAMP檢測方法檢測，對收集的28份臨床樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAV-I陽性樣品10份，陰性樣品18份；與病料分離鑒定結(jié)果相比，符合率為96.8%；與PCR檢測結(jié)果相比，符合率為100%。

3 討論

目前，對于許多傳染性疾病的診斷常常需要進(jìn)行實驗室檢測，以便能夠進(jìn)一步進(jìn)行確診，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)方法主要依賴病毒分離、病理學(xué)及血清學(xué)方法等，但這些方法不僅繁瑣耗時，且敏感性和特異性較差，不能及時確診。近年來，由于核酸雜交、PCR等技術(shù)的應(yīng)用，使CAV-I感染的診斷進(jìn)入到分子生物學(xué)階段，建立的PCR和real-time PCR方法需要昂貴的儀器，要求一定的實驗室條件和經(jīng)過技能培訓(xùn)的技術(shù)人員[2，4-5]。

LAMP方法是在恒溫條件下反應(yīng)，只需要一臺恒溫水浴鍋或培養(yǎng)箱即可，無需進(jìn)行電泳檢測，簡便快捷，這使得LAMP方法可以很容易在基層或者現(xiàn)場查驗中開展檢測。而且，由于LAMP采用4或6條引物共識別6個特異性的目的區(qū)域[7-8，11]，這使得LAMP檢測方法比PCR方法等具有更好的靈敏度和特異性。

本研究建立的犬傳染性肝炎病毒（CAV-I）的LAMP檢測方法，可在63℃等溫條件下1h內(nèi)完成擴(kuò)增檢測，由于在LAMP引物設(shè)計中引入了一對環(huán)引物，可以在30min左右的時間完成反應(yīng)，使得LAMP的擴(kuò)增效率大幅提高。同時，在結(jié)果判定中，為防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果，反應(yīng)前在反應(yīng)體系中添加了鈣黃綠素與氯化錳組成的一種熒光染料，呈淡橙色，不發(fā)熒光，隨著特異性擴(kuò)增反應(yīng)的發(fā)生，反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸根離子與錳離子結(jié)合，釋放的鈣黃綠素可以自發(fā)熒光，擴(kuò)增效率越高，激發(fā)的熒光越強(qiáng)。反應(yīng)結(jié)束后可在可見光或紫外線下直接觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定結(jié)果，既避免了開蓋污染環(huán)境造成的假陽性，又實現(xiàn)了反應(yīng)結(jié)果的可視化，解決了LAMP技術(shù)的臨床應(yīng)用問題[12]。

與傳統(tǒng)的PCR檢測方法相比，LAMP檢測方法具有更高的特異性，利用本試驗建立的LAMP檢測方法對CDV、CPV、DPV、PRRSV等病原進(jìn)行特異性檢測證明，建立的LAMP方法能夠特異性的檢測CAV-I，對其他病毒無擴(kuò)增。同時，LAMP檢測方法靈敏度較好，是PCR檢測反應(yīng)的100倍，結(jié)果一致性也較好，對28份可疑樣本的檢測證實，LAMP陽性檢出率高于PCR方法，能有效防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，這一快速簡便的LAMP檢測方法在基層檢疫或現(xiàn)場查驗中具有很高的實用價值，能夠?qū)膊「玫淖鞒鼍_判斷，應(yīng)用前景較為廣闊。

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Establishment and Application of LAMP for the Rapid Detection of Infectious Canine Hepatitis

Cao Binglei1，Ling Zongshuai1，Qiu Hongkai2
（1. Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jinan，Shandong 250014；2. Shandong Zhengbang Breeding Group CO.，LTD.，Jinan，Shandong 250010）

To develop a rapid method for the detection of infectious canine hepatitis，LAMP was established using three pairs of specifc primers for the E3 gene of CAV-I according to the sequences in GenBank. The assay was optimized to obtain a big amount of amplifcation products at 63℃ for 30min and the amplifcation products could be observed by the naked eyes. It was shown that the LAMP was able to specifcally amplify CAV-I DNA，without cross-reaction with other irrelevant nucleotides and it was 100 times more sensitive than PCR assay with a lowest detection limit value of 10-7TCID50/0.1mL. The detection of clinical samples showed that the positive rate of LAMP was 43%. In addition，the agreement rate between LAMP and the virus isolation was 96.8% but between LAMP and PCR was up to 100%.LAMP was more sensitive and simple and could be applied to rapid diagnosis of CAV-I.

LAMP；infectious canine hepatitis；canine adenovirus I

S855.3

：A

：1005-944X（2014）06-0073-04

國家質(zhì)檢總局項目科技計劃項目（2012IK015）

曹丙蕾，E-mail：caobinglei8079@163.com