趙艷琴，吳元華，伏穎，趙秀香，陳建光

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽市東陵路120號 110866

2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市霍林河大街22號 028000

3.沈陽市疾病防控中心，沈陽市皇姑區(qū)岐山中路37號 110031

煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）細(xì)胞壁降解酶活性分析及其致病作用

趙艷琴1，2，吳元華*1，伏穎3，趙秀香1，陳建光1

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽市東陵路120號 110866

2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市霍林河大街22號 028000

3.沈陽市疾病防控中心，沈陽市皇姑區(qū)岐山中路37號 110031

為揭示煙草靶斑病菌細(xì)胞壁降解酶的致病機(jī)理，進(jìn)行了煙草靶斑病菌細(xì)胞壁降解酶活性變化、產(chǎn)酶條件及對葉片損傷作用的研究。結(jié)果表明：煙草靶斑病菌在煙草活體內(nèi)、外均可產(chǎn)生果膠酶及纖維素酶，其中煙草組織活體外以多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性最高，而在煙草活體內(nèi)羧甲基纖維素酶（Cx）和β-葡萄糖苷酶活性最高，且強(qiáng)致病力菌株的產(chǎn)酶能力強(qiáng)于弱致病力菌株；產(chǎn)酶條件研究表明，培養(yǎng)10 d產(chǎn)生的Cx和β-葡萄糖苷酶的活性最強(qiáng)，而培養(yǎng)12 d產(chǎn)生的PG、PMG、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）和果膠甲基反式消除酶（PMTE）的活性最強(qiáng)；最適宜產(chǎn)生CWDEs的條件為25℃下，pH 5～6連續(xù)黑暗的靜止培養(yǎng)環(huán)境；煙草靶斑病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶可導(dǎo)致煙草葉片明顯受損，其損傷作用大小表現(xiàn)為混合酶明顯高于單一酶，且果膠酶對煙草葉片的損傷作用高于纖維素酶。

煙草靶斑病；立枯絲核菌；細(xì)胞壁降解酶；產(chǎn)酶條件；致病作用

植物病原菌在與寄主植物互作的過程中，病原菌會(huì)分泌一系列降解酶，以突破寄主植物的細(xì)胞壁等屏障，這類酶包括果膠降解酶和纖維素酶。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani kühn）是一種植物病原菌，可以引起多種植物病害，其引起的煙草靶斑病是煙草生產(chǎn)上的重要病害之一［1］。2006年煙草靶斑病在我國遼寧丹東地區(qū)首次大面積發(fā)生，部分地塊產(chǎn)量損失高達(dá)90%以上［2］，此后在黑龍江、廣西等地也有發(fā)生。盡管國內(nèi)外學(xué)者對煙草靶斑病已進(jìn)行了大量研究，但多集中在煙草靶斑病的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、遺傳多樣性及化學(xué)防治等方面［3-5］，對該病原菌致病機(jī)制的研究報(bào)道卻較少［6-7］。目前的研究表明細(xì)胞壁降解酶是重要的致病因子之一［8-11］，但鮮見對立枯絲核菌（R.solani）細(xì)胞壁降解酶致病作用的報(bào)道［12-13］，未見有關(guān)煙草靶斑病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的報(bào)道。為此，進(jìn)行了煙草靶斑病菌細(xì)胞壁降解酶活性、產(chǎn)酶條件及其對煙草葉片損傷作用試驗(yàn)，旨在明確煙草靶斑病菌的致病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為煙草靶斑病菌（R.solani）菌株YC-9及弱致病力菌株LF-1，本試驗(yàn)室保存；供試煙草品種為NC89。

1.2 煙草靶斑病菌細(xì)胞壁降解酶的提取及純化

［14］的方法采用改良查氏培養(yǎng)液于28℃靜置培養(yǎng)煙草靶斑病菌15 d后過濾獲得粗酶液；用硫酸銨沉淀法對人工培養(yǎng)粗酶液進(jìn)行純化［15］，并將酶液保存于-20℃下備用。

細(xì)胞壁降解酶的活體內(nèi)提?。河诮臃N煙草靶斑病菌后5 d切取煙草葉片病斑處、病健交界處、健處各直徑為3 mm的組織圓片備用；將各樣品按每克鮮組織加入4 mL NaCl（l mol·L-1）提取液，研磨后3500 r/min離心15 min，按照李寶聚等［16］的方法提取細(xì)胞壁降解酶，酶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞壁降解酶活性測定

于520 nm處測定反應(yīng)混合液釋放的還原糖含量，計(jì)算人工培養(yǎng)獲得的及煙草活體內(nèi)獲得的Cx、β-葡萄糖苷酶、PG、PMG的活性，以30℃下每分鐘每毫克蛋白酶催化底物釋放1.0 μg還原糖為一個(gè)酶活性單位［15］；并參考文獻(xiàn)［16］的方法在232 nm處測定PGTE和PMTE的酶活性，定義每分鐘每毫克蛋白酶催化底物釋放1.0 μmol不飽和醛酸為一個(gè)酶活性單位。

1.4 不同致病力煙草靶斑病菌產(chǎn)酶能力比較

將煙草靶斑病菌強(qiáng)致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-1分別進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)2，4，6，8，10，12，14和16 d后提取粗酶液，并測定PG，PMG，PMTE，PGTE，Cx和β-葡萄糖苷酶活性，比較不同致病力菌株的產(chǎn)酶能力。

1.5 病菌細(xì)胞壁降解酶的致病作用

分別培養(yǎng)10和12 d后提取果膠酶和纖維素酶，純化備用。取8葉期的煙草葉片分別滴加果膠酶液和纖維素酶液各20 μL于針刺部位，置于28℃光照培養(yǎng)箱覆膜保濕，以酶提取緩沖液為對照，12 h后觀察記錄病變情況；另以果膠酶液和纖維素酶液以及二者等體積混合酶液處理煙草葉片，取各酶液10 mL置于試管中，另取直徑5 mm的煙葉圓片10片浸入各酶液，28℃靜置處理6 h后，以蒸餾水處理為對照（CK），采用電導(dǎo)儀（DD-ⅡA型）測定樣品的電導(dǎo)率，將各樣品煮沸后冷卻再次測量電導(dǎo)率，并計(jì)算相對電導(dǎo)率［15］，比較相對電導(dǎo)率反映的果膠酶及纖維素酶的損失作用。

2 結(jié)果與分析

表1 活體外煙草靶斑病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性①Tab.1Activity of cell wall degrading enzymes produced in vitro from R.solani

2.1 活體外人工離體培養(yǎng)煙草靶斑病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性分析

由表1可知，煙草靶斑病菌于培養(yǎng)液中能產(chǎn)生4種果膠酶，即PG，PMG，PGTE和PMTE，以及2種纖維素酶，即Cx和β-葡萄糖苷酶，這6種酶中PG活性最高，為1117.99 U·mg-1，與其他酶活性差異達(dá)極顯著水平，PMG和PMTE最低，僅為1.45 U·mg-1。因此，煙草活體外培養(yǎng)時(shí)PG和PMG是煙草靶斑病菌產(chǎn)生的主要細(xì)胞壁降解酶。

2.2 不同致病力煙草靶斑病菌菌株的產(chǎn)酶能力比較

由圖1可知，活體外強(qiáng)弱致病力菌株的產(chǎn)酶能力明顯不同。對強(qiáng)弱致病力菌株的PG和PMG活性測定結(jié)果表明各酶變化規(guī)律基本一致。在培養(yǎng)2～10 d內(nèi)，強(qiáng)致病力菌株YC-9的產(chǎn)PG和PMG酶量比弱致病力菌株LF-1略高，在培養(yǎng)12 d時(shí)YC-9的產(chǎn)酶量驟然上升，PG活性達(dá)到LF-1的6.71倍，PMG活性達(dá)到LF-1產(chǎn)酶活性的5.84倍；之后兩種酶活性逐漸下降，到16 d時(shí)與LF-1無明顯差異。這表明強(qiáng)致病力菌株YC-9產(chǎn)PG和PMG酶能力強(qiáng)于弱致病力菌株。

僅在培養(yǎng)10～12 d時(shí)，YC-9的PGTE活性明顯高于LF-1；而在培養(yǎng)10～12 d時(shí)強(qiáng)致病力菌株YC-9的PMTE活性顯著高于LF-1，在12 d時(shí)菌株YC-9的PMTE活性達(dá)到高峰（1.7611 U·mg-1），是LF-1酶活性的6.84倍，之后下降至較低水平，而LF-1在此過程中基本保持穩(wěn)定不變。這表明強(qiáng)致病力菌株YC-9產(chǎn)PGTE和PMTE能力強(qiáng)于弱致病力菌株。

Cx的酶活性在培養(yǎng)期間強(qiáng)弱致病力菌株均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在2～10 d時(shí)YC-9的酶活性比LF-1略高；在培養(yǎng)10 d時(shí)強(qiáng)致病力菌株YC-9達(dá)到酶活性高峰，此后開始下降；而弱致病力菌株LF-1的酶活性在第12天出現(xiàn)高峰后開始下降，12 d以后略高于菌株YC-9，這表明弱致病力菌株LF-1的Cx酶活性高峰出現(xiàn)的時(shí)間滯后于強(qiáng)致病力菌株YC-9。

在培養(yǎng)期間菌株LF-1的β-葡萄糖苷酶活性沒有被測出，而菌株YC-9的β-葡萄糖苷酶卻表現(xiàn)出較高的活性，并于第10天達(dá)到酶活性高峰，表明弱致病力菌株LF-1不能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，由此推測這可能是其對煙草的致病力明顯降低的原因［17］。

2.3 煙草活體內(nèi)病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性

2.3.1 接種后煙葉組織中細(xì)胞壁降解酶的活性變化

由表2可知，煙草與靶斑病菌互作后，病斑的不同部位均檢測出PG，PMG，PGTE和PMTE 4種果膠酶以及Cx和β-葡萄糖苷酶2種纖維素酶，在病斑組織各部位均表現(xiàn)為Cx和β-葡萄糖苷酶的活性最高，PG和PMG次之，PGTE和PMTE活性最低；各種酶也均表現(xiàn)出病健交界處酶活性最高，病斑處次之，病斑外側(cè)健康葉片組織中最低。與活體外培養(yǎng)相比，在活體內(nèi)的病菌各種酶的活性遠(yuǎn)低于活體外培養(yǎng)的酶活性，二者無明顯相關(guān)性。

圖1 強(qiáng)弱致病力菌株產(chǎn)酶活性比較Fig.1Comparison of enzyme activity between strong and weak pathogenicity strains

2.3.2 接種后煙葉中細(xì)胞壁降解酶的活性變化

由圖2可知，隨著接種時(shí)間的延長，各種細(xì)胞壁降解酶的活性變化均呈現(xiàn)出波動(dòng)增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，且各取樣時(shí)間點(diǎn)處理樣品的酶活性均高于對照。其中，Cx、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG活性在接種后第2天出現(xiàn)一次小高峰后下降，在第4天后再次升高，于第6天達(dá)到最高，之后下降至第8天再次上升，升至第14天后略有下降，至第18天仍保持較高活性；在接種后的全過程中，兩種纖維素酶即β-葡萄糖苷酶和Cx的活性最高，而PG和PMG次之，PGTE和PMTE活性最低。這表明在與煙草互作的過程中為了克服煙草的抗性，各種細(xì)胞壁降解酶進(jìn)行了復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致發(fā)病。

表2 不同部位細(xì)胞壁降解酶的活性Tab.2Activities of cell wall degrading enzymes produced in different parts

圖2 接種后煙葉內(nèi)細(xì)胞壁降解酶活性的變化Fig.2Activities of cell wall degrading enzymes produced in vivo from R.solani

2.4 煙草靶斑病菌細(xì)胞壁降解酶的致病作用

2.4.1 對煙草葉片損傷作用的觀察

由圖3可以看出，果膠酶及纖維素酶均能造成煙草葉片明顯損傷，其中果膠酶可使葉片出現(xiàn)邊緣明顯的較大褐色病斑，而接種纖維素酶僅使葉片產(chǎn)生較小的淡黃色病斑，表明均能對煙草葉片產(chǎn)生致病作用。

圖3 煙草靶斑病菌果膠酶及纖維素酶對煙草葉片的損傷作用Fig.3Effects of cell wall degrading enzymes of R.solani on tobacco leaf

2.4.2 對煙草細(xì)胞膜透性的影響

通常相對電導(dǎo)率越大，表明電解物質(zhì)泄露越多，細(xì)胞膜損傷愈嚴(yán)重。表3結(jié)果表明煙草靶斑病菌產(chǎn)生的果膠酶、纖維素酶及二者等體積混合酶的相對電導(dǎo)率均明顯高于對照，且混合酶液處理的相對電導(dǎo)率最大，果膠酶處理次之，纖維素酶處理的電導(dǎo)率最小。表明果膠酶及纖維素酶共同作用對煙草組織的破壞作用增強(qiáng)，致病作用較單一酶更強(qiáng)。

表3 煙草靶斑病菌細(xì)胞壁降解酶對煙草葉片損傷作用Tab.3Comparison of damage effect of cell wall degrading enzymes of R.solani on tobacco leave

3 結(jié)論與討論

煙草靶斑病菌在人工培養(yǎng)條件下，可以產(chǎn)生6種細(xì)胞壁降解酶，其中PG，PMG和Cx活性較高，與陳夕軍等［12］和陳捷等［13］分別對水稻紋枯病菌和玉米紋枯病菌細(xì)胞壁降解酶的測定結(jié)果基本一致。在人工培養(yǎng)條件下，不同致病力菌株的產(chǎn)酶能力比較表明，強(qiáng)致病力菌株產(chǎn)酶能力強(qiáng)于弱致病力菌株，這可能與其致病力差異有關(guān)。

煙草靶斑病菌細(xì)胞壁降解酶在煙草活體內(nèi)與人工培養(yǎng)條件下活性差別較大，煙草活體內(nèi)的細(xì)胞壁降解酶活性較低，與劉志恒等［15］對黃瓜棒孢葉斑病菌細(xì)胞壁降解酶的研究結(jié)果基本一致；活體接種中各細(xì)胞壁降解酶均表現(xiàn)出酶活性的起伏變化，這可能是由于病菌在與煙草互作過程中，煙草表現(xiàn)出一定程度的抵抗作用從而導(dǎo)致酶活性在上升的同時(shí)又有波動(dòng)變化；煙草葉片不同病斑部位酶活性不同，煙草病健交界處細(xì)胞壁降解酶活性高于病斑其他部位，且纖維素酶活性明顯高于果膠酶，這可能是由于致病過程中纖維素酶的作用大于果膠酶的作用造成的。

煙草靶斑病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶能夠損傷煙草葉片并引起與病害相似的癥狀，且果膠酶的破壞作用明顯大于纖維素酶，其對煙草細(xì)胞膜損傷作用明顯，混合酶對煙草細(xì)胞膜的損傷作用高于單一酶，在煙草靶斑病菌致病過程中二者共同發(fā)揮了致病作用。陳夕軍等［12］和楊媚等［18］研究發(fā)現(xiàn)水稻紋枯病菌的果膠酶和纖維素酶單獨(dú)和混合處理都能對水稻葉片細(xì)胞膜造成明顯的損傷，本試驗(yàn)與其結(jié)果基本一致。

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Activity Pathogenic Effect of Cell Wall Degrading Enzyme in Tobacco Target Spot Pathogen Rhizoctonia solani

ZHAO Yanqin1,2,WU Yuanhua*1,FU Ying3,ZHAO Xiuxiang1,and CHEN Jianguang1
1.College of Plant Protection,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China
2.College of Agriculture,Inner Mongolia University for the Nationalities,Tongliao 028000,Inner Mongolia, China
3.Shenyang Center for Disease Prevention and Control,Shenyang 110031,China

In order to reveal the pathogenic mechanism of cell wall degrading enzymes(CWDEs)in tobacco target spot disease pathogen,Rhizoctonia solani(R.solani)was studied in terms of their activities,production condition and damage effect.The results showed that R.solani in tobacco could produce pectinase and cellulase both inside and outside a living body.Outside the living body,the activities of polygalacturonase(PG)and pectin methylgalactuionase(PMG)were the highest;inside the living body,the activities of carboxymethyl cellulase(Cx)and β-glucosidase were the highest,and the enzyme production ability of strains with strong pathogenicity was stronger than that of strains with weak pathogenicity.Cx and β-glucosidase cultured for 10 days reached their highest activities,while PG,PMG,polygalacturonic acid transeliminase(PGTE)and pectin methyltranseliminase(PMTE)cultured for 12 days reached their highest activities.The appropriate conditions for producing CWDEs were:temperature 25℃,pH value 5-6,still culture in the dark.The CWDEs in R.solanicould obviously damage tobacco leaves,the damage caused by a mix of said enzymes was more serious than that caused by a single enzyme,and the damage caused by pectinase was more serious than that caused by cellulase.

Tobacco target spot;Rhizoctonia solani;Cell wall degrading enzyme;Enzyme production condition; Pathogenic effect

S432.41

A

1002-0861（2014）11-0084-05

國家煙草專賣局科技項(xiàng)目“全國煙草有害生物調(diào)查研究”［國煙辦綜（2010）182號］；遼寧省煙草專賣局科技攻關(guān)項(xiàng)目“遼寧省煙草有害生物調(diào)查研究”［遼煙計(jì)（2010）86號］。

趙艷琴（1978—），博士，講師，主要從事植物病原真菌學(xué)研究。E-mail：zhaoyanqin782828@qq.com；*

吳元華E-mail：wuyh09@vip.sina.com

2014-05-16

責(zé)任編輯：董志堅(jiān)E-mail：dzj@tobaccoinfo.com.cn電話：0371-67672650