惠非瓊，馬杰，劉劍，聶長(zhǎng)春，高其康，樓兵干*

1.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州市西湖區(qū)余杭塘路866號(hào)310058

2.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，貴陽(yáng)市云巖區(qū)友誼路25號(hào) 550001

3.浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測(cè)試中心，杭州市西湖區(qū)余杭塘路866號(hào) 310058

印度梨形孢誘導(dǎo)煙草的抗病性分析

惠非瓊1，2，馬杰1，劉劍2，聶長(zhǎng)春2，高其康3，樓兵干*1

1.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州市西湖區(qū)余杭塘路866號(hào)310058

2.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，貴陽(yáng)市云巖區(qū)友誼路25號(hào) 550001

3.浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測(cè)試中心，杭州市西湖區(qū)余杭塘路866號(hào) 310058

內(nèi)生真菌印度梨形孢（Piriformospora indica）能夠增強(qiáng)植物體抗生物和非生物脅迫能力。為了明確印度梨形孢對(duì)誘導(dǎo)煙草抗病性的作用，分別進(jìn)行了接種病原菌長(zhǎng)柄鏈格孢、膠孢炭疽菌、終極腐霉和茄絲核菌后印度梨形孢定殖的煙草對(duì)赤星病、炭疽病、猝倒病和立枯病害的抗性試驗(yàn)，同時(shí)分析了接種長(zhǎng)柄鏈格孢后煙葉中丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量、抗氧化酶活性以及病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平。結(jié)果表明：印度梨形孢定殖的煙草，接種長(zhǎng)柄鏈格孢后，煙葉病斑顯著減小，煙葉中MDA含量顯著降低，Pro含量顯著升高，病程相關(guān)蛋白基因PR-1a，PR2，PR3和PR5的表達(dá)量明顯提高；接種膠孢炭疽菌后，煙葉病斑減?。唤K極腐霉和茄絲核菌對(duì)煙草的危害癥狀顯著減輕。印度梨形孢能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗病性，是通過(guò)維持生物膜系統(tǒng)的完整性、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)滲透壓以及膜脂過(guò)氧化在較低水平、并調(diào)控病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

內(nèi)生真菌；印度梨形孢；丙二醛；脯氨酸；煙草病害；病程相關(guān)蛋白基因

煙草在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到各種生物和非生物的脅迫，其中煙草病害是煙草生產(chǎn)中最常見(jiàn)的生物脅迫之一。煙草赤星病、炭疽病、猝倒病和立枯病等是我國(guó)煙葉生產(chǎn)上的主要病害，對(duì)煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重影響［1-2］。目前，主要采用化學(xué)防治的方法來(lái)防治煙草病害，但所帶來(lái)的抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題不容忽視。因此，需要尋求一種既安全又有效的防治煙草病害的方法。Verma等［3］從印度沙漠的灌木根上分離出印度梨形孢（Piriformospora indica），其作用與叢枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF）相似，能定殖于多種植物的根部，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高寄主植物對(duì)生物和非生物逆境的耐受性；且能定殖于擬南芥等非菌根植物的根部，能在多種合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)［4-10］。在生物脅迫方面，印度梨形孢不僅可以增強(qiáng)植物對(duì)根部病害的抗性，還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性［11-12］；印度梨形孢定殖的擬南芥和大麥對(duì)白粉?。≒owdery Mildew）的抗性顯著增強(qiáng)［5，13-14］；印度梨形孢定殖的小白菜中抗病蛋白基因的表達(dá)量顯著提高，對(duì)黑斑病病菌［Alternaria brassica（Berk）Sacc.］的抗性增強(qiáng)［15］；印度梨形孢定殖的玉米組織中抗壞血酸和谷胱甘肽含量增加，對(duì)輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）的抗性增強(qiáng)［16］。但有關(guān)印度梨形孢對(duì)煙草抗病性影響的報(bào)道卻較少。為此，對(duì)印度梨形孢抗煙草赤星?。ˋlternaria longipes）、炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）、猝倒病（Pythium ultimum）和立枯?。≧hizoctonia solani）的作用及其機(jī)理進(jìn)行了初步試驗(yàn)，旨在明確印度梨形孢在煙草抗病性方面的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與煙草品種

印度梨形孢（Piriformospora indica）由德國(guó)耶拿大學(xué)Ralf Oelmüller教授惠贈(zèng)；病原菌：長(zhǎng)柄鏈格孢（Alternaria longipes），菌種編號(hào)：CGMCC3.2946，購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理中心；膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的GenBank號(hào)為JQ277720，終極腐霉（Pythium ultimum）菌株號(hào)為Cuc08，茄絲核菌（Rhizoctonia solani）菌株號(hào)為T(mén)om03，均保存于浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所；供試煙草品種為中煙100，由中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院提供。

1.1.2 菌株的培養(yǎng)

采用陳佑源等［10］的方法進(jìn)行印度梨形孢的培養(yǎng)。

病原菌的培養(yǎng)：將長(zhǎng)柄鏈格孢、膠孢炭疽菌、終極腐霉和茄絲核菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，置于溫度為25℃的黑暗恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5，5，2和4 d后，用打孔器（直徑為5 mm）沿菌落邊緣打孔，供接種用。

1.1.3 植物材料的準(zhǔn)備

煙草種子消毒后放在MS培養(yǎng)基平板上萌發(fā)，兩周后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗與印度梨形孢在MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，將各平板置于25/22℃（白天/黑夜），16/8 h（光暗交替），光照強(qiáng)度為5500 Lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4周后，用臺(tái)盼藍(lán)染色并觀察印度梨形孢在煙草根部的定殖情況，確保印度梨形孢成功定殖于煙草根部。4周后挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗轉(zhuǎn)移到基質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石∶珍珠巖=4∶2∶1）中，置于溫室內(nèi)，在溫度25/22℃（白天/黑夜）、14/10 h（光暗交替）、相對(duì)濕度60%的條件下盆栽培養(yǎng)，按生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。

1.2 方法

1.2.1 印度梨形孢在煙草根部的定殖

采用Sun等［9］的方法檢測(cè)MS平板上與印度梨形孢共培養(yǎng)3～4周后煙草根部印度梨形孢的定殖情況。

1.2.2 煙草病原菌的接種

長(zhǎng)柄鏈格孢和膠孢炭疽菌的接種：選取盆栽10周的煙苗，設(shè)置2個(gè)處理和2個(gè)對(duì)照。對(duì)照1（-Pi+A），將長(zhǎng)柄鏈格孢和膠孢炭疽菌菌絲塊分別接種于根部無(wú)印度梨形孢定殖的煙苗最大葉片上；處理1（+Pi+A），將長(zhǎng)柄鏈格孢和膠孢炭疽菌菌絲塊分別置于根部有印度梨形孢定殖的煙草最大葉片上；對(duì)照2（-Pi-A），將直徑為5 mm的PDA培養(yǎng)基置于根部無(wú)印度梨形孢定殖的煙草最大葉片上；處理2（+Pi-A），將直徑為5 mm的PDA培養(yǎng)基置于根部有印度梨形孢定殖的煙草最大葉片上。采用傷口接種法，在每片葉中部位置，以葉脈為對(duì)稱軸，用滅菌石英砂輕輕摩擦產(chǎn)生微傷口，用無(wú)菌水沖去石英砂后，把菌絲塊置于煙葉微傷口處，對(duì)接種后的煙株進(jìn)行保濕培養(yǎng)48 h，每處理接種5株煙。溫室中培養(yǎng)，定時(shí)觀察、記錄各處理煙草的生長(zhǎng)情況。并于長(zhǎng)柄鏈格孢病原菌接種后的0，6，12，24，48和72 h取樣，迅速放入液氮中冷凍后，保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

終極腐霉和茄絲核菌的接種：選取MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周的煙苗，將終極腐霉、茄絲核菌菌絲塊分別置于有印度梨形孢定殖（處理1，+Pi+A）和無(wú)印度梨形孢定殖（對(duì)照1，-Pi+A）的煙苗根基部，每株煙苗根基部放置一塊菌絲塊；同時(shí)用直徑為5 mm的PDA培養(yǎng)基置于根部有印度梨形孢定殖（處理2，+Pi-A）和無(wú)印度梨形孢定殖（對(duì)照2，-Pi-A）的煙苗根基部；用封口膜將培養(yǎng)皿密封后，置于溫度25/22℃（白天/黑夜）、16/8 h（光暗交替）、光照強(qiáng)度為5500 Lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理接種6株煙苗，定時(shí)觀察并記錄。

1.2.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定

參照陳建勛等［17］的方法測(cè)定樣品中丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 抗病相關(guān)基因表達(dá)量分析

參照惠非瓊等［18］的方法提取各煙草葉片樣品總RNA、合成cDNA第一條鏈并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以Actin為內(nèi)參，根據(jù)已報(bào)道的煙草病程蛋白相關(guān)基因設(shè)計(jì)特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 煙草病程蛋白相關(guān)基因熒光定量PCR特異性引物

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢在煙草根部的定殖狀況

煙草與印度梨形孢共培養(yǎng)4周后，采用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)煙草根系進(jìn)行染色后在顯微鏡下觀察，在與印度梨形孢共培養(yǎng)的煙草根系中，梨形厚垣孢子清晰可見(jiàn)并主要集中在根成熟區(qū)的表皮和皮層細(xì)胞中（圖1）。

2.2 印度梨形孢對(duì)煙草赤星病抗性的影響

從圖2可以看出，接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌后第6天，有印度梨形孢定殖的煙葉病斑直徑明顯小于對(duì)照；此時(shí)可以觀察到對(duì)照煙葉病斑已擴(kuò)大，病斑周圍具有明顯的淡黃色暈環(huán)；而在處理煙葉上，病斑較?。▓D2Ⅰ，圖2Ⅱ）。對(duì)照煙葉赤星病斑直徑是處理煙葉的1.7倍（圖2Ⅲ），處理煙葉病斑面積比對(duì)照的病斑面積下降了64%。觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，空白PDA培養(yǎng)基接種的煙苗未出現(xiàn)異常。

2.3 印度梨形孢對(duì)煙草炭疽病抗性的影響

由圖3可知，在接種膠孢炭疽菌后第4天，觀察到對(duì)照煙葉上出現(xiàn)了明顯病斑，而處理煙葉上病斑不明顯（圖3Ⅰ，圖3Ⅱ）；接種病原菌后的第9天，對(duì)照煙葉上的病斑面積擴(kuò)大，顏色變深，呈黃褐色，而處理煙葉病斑剛出現(xiàn)（圖3Ⅲ，圖3Ⅳ）。接種病原菌后4和9 d，對(duì)照煙草的病斑直徑顯著大于處理煙草（圖3Ⅴ）。

圖1 印度梨形孢在煙草根部的定殖情況

圖2 接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌6 d后煙葉表型上的差異及病斑大小

2.4 印度梨形孢誘導(dǎo)煙草對(duì)猝倒病的抗性

接病原菌后第1天，煙苗根系和葉片未出現(xiàn)明顯的病害癥狀（圖4Ⅰ，圖4Ⅲ）；第7天后，無(wú)印度梨形孢定殖的對(duì)照煙苗停止生長(zhǎng)，根系呈褐色并腐爛，葉片枯萎變黃（圖4Ⅳ）；而根部有印度梨形孢定殖的煙草僅表現(xiàn)出生長(zhǎng)減緩，老葉變黃癥狀（圖4Ⅱ）。第10天后，處理煙苗表現(xiàn)出葉片黃化癥狀，而對(duì)照煙苗幾乎全部死亡。

圖3 接種膠孢炭疽菌后煙草表型上的差異及病斑大小

圖4 接種終極腐霉菌后的煙草病害癥狀

圖5 接種茄絲核菌的煙草病害癥狀

2.5 印度梨形孢對(duì)煙草立枯病抗性的影響

接種病菌7 d后，觀察發(fā)現(xiàn)根部無(wú)印度梨形孢定殖和有印度梨形孢定殖的煙苗生長(zhǎng)均停止；第20天后，對(duì)照煙苗根系開(kāi)始腐爛，顏色加深呈褐色（箭頭所示），葉片變黃，而處理煙苗根系肉眼未見(jiàn)病變癥狀，只是葉片出現(xiàn)黃化（圖5）。

2.6 接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌對(duì)煙葉中MDA和Pro含量的影響

未接種病原菌時(shí)，印度梨形孢定殖的煙草和對(duì)照煙草葉片中MDA含量無(wú)顯著差異（圖6Ⅰ）；接種病菌24 h后，對(duì)照煙草葉片中MDA含量上升，是處理煙草的1.2倍；隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，處理和對(duì)照煙草葉片中MDA含量均上升，對(duì)照煙草葉片中上升的速率快于處理；接種病菌48 h后，對(duì)照煙草葉片中MDA含量是處理煙草的1.7倍；接種病菌72 h后，處理和對(duì)照煙草葉片中MDA含量均有所下降，但對(duì)照葉片中含量是處理的1.4倍。說(shuō)明病原菌侵染時(shí)，處理煙草葉片MDA含量顯著低于對(duì)照。表明接種病原菌后，印度梨形孢的定殖能增強(qiáng)煙草抗氧化脅迫能力，減輕膜脂過(guò)氧化程度，提高煙草抵御逆境脅迫的能力。

圖6 接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌后煙草葉片中MDA和Pro含量

接種病原菌前，有印度梨形孢定殖的處理煙草和對(duì)照煙草葉片中Pro含量無(wú)顯著差異（圖6Ⅱ）；接種病原菌后第24 h，處理煙草葉片中Pro含量上升；接種后第48和72 h，處理煙草葉片中Pro含量分別是對(duì)照的1.5和1.3倍，顯著高于對(duì)照煙草。表明病原菌侵染時(shí)，印度梨形孢通過(guò)促進(jìn)煙草中Pro的積累，進(jìn)而提高煙草對(duì)病菌的抵御能力。

2.7 接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌對(duì)煙葉中CAT，POD和SOD活性的影響

接種病原菌前，有印度梨形孢定殖的處理煙草和對(duì)照煙草葉片中CAT，POD和SOD的活性基本一致；接種病原菌后，煙草葉片中SOD，POD和CAT活性呈先增加后降低的趨勢(shì)；接種病原菌24 h，處理煙草葉片中CAT，POD和SOD活性均顯著高于對(duì)照，分別是對(duì)照的1.2，1.6和1.2倍；接種病原菌48 h，煙葉中CAT，POD和SOD酶活性達(dá)到最大值，處理煙葉中酶活性顯著高于對(duì)照，分別是對(duì)照的1.6，1.9和1.3倍；接種72 h，處理和對(duì)照煙葉中CAT，POD和SOD酶活性均下降，但處理煙葉中酶活性仍高于對(duì)照，分別比對(duì)照煙葉高24.7%，39.8%和13.4%（表2）。說(shuō)明病原菌侵染時(shí)，印度梨形孢的定殖能提高煙葉中抗氧化酶活性。

表2 接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌后煙葉中CAT，POD和SOD活性①

2.8 接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌對(duì)煙葉中病程蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的影響

從實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖7）可以看出，未接種病原菌時(shí)，有印度梨形孢定殖的煙草和無(wú)印度梨形孢定殖的煙草葉片中病程蛋白基因PR-1a，PR2，PR3和PR5的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異；接種長(zhǎng)柄鏈格孢菌后，處理和對(duì)照煙葉中基因PR-1a，PR2，PR3和PR5的表達(dá)量呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，對(duì)照煙草葉片中基因PR-1a，PR，PR3和PR5的表達(dá)上升幅度不大，而在處理煙葉中表達(dá)量顯著上升。接種病原菌后第6 h，PR3和PR5表達(dá)量達(dá)到最大值，此時(shí)這2個(gè)基因在處理煙葉中的表達(dá)量分別是對(duì)照的4.2倍和2.7倍（圖7Ⅲ，圖7Ⅳ）；接種后第12 h，基因PR-1a和PR2的表達(dá)量達(dá)到最大值，此時(shí)處理煙草中基因表達(dá)量分別是對(duì)照的2.1倍和3.8倍（圖7Ⅰ，圖7Ⅱ）。說(shuō)明病原菌侵染后，印度梨形孢能誘導(dǎo)煙草葉片中PR-1a，PR2，PR3和PR5基因超量表達(dá)。

圖7 煙葉病程相關(guān)蛋白基因的相對(duì)表達(dá)水平

3 結(jié)論與討論

印度梨形孢能在煙草根部定殖；病原菌侵染煙草時(shí)，印度梨形孢能顯著減輕煙草受害的嚴(yán)重程度，誘導(dǎo)煙草對(duì)終極腐霉和茄絲核菌的抗性，顯著增強(qiáng)植物對(duì)根部病害的抵抗力；同時(shí)還能誘導(dǎo)煙草對(duì)葉部病害赤星病和炭疽病的抗性，明顯降低赤星病和炭疽病對(duì)煙草的危害。說(shuō)明印度梨形孢可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)性抗病性。

接種病原菌后，病程相關(guān)蛋白基因PR-1a，PR2，PR3和PR5在處理煙草中的表達(dá)量顯著提高。這與Moliter等［19］的研究結(jié)果一致，表明印度梨形孢能夠更早更快地誘導(dǎo)煙草中病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。由此推斷，印度梨形孢通過(guò)誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白快速、超量表達(dá)而對(duì)病原菌起到抑制作用，從而增強(qiáng)煙草的抗病性。

接種病原菌后，印度梨形孢的定殖提高了煙葉中SOD，POD和CAT活性，平衡植物中活性氧自由基，減輕活性氧自由基對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害，表明印度梨形孢能有效激活煙草葉片中活性氧清除系統(tǒng)，減輕膜脂過(guò)氧化損傷，這與前人的研究結(jié)果一致［6，9］；印度梨形孢還能維持煙草葉片中MDA含量的相對(duì)穩(wěn)定，促進(jìn)煙草葉片中脯氨酸的積累。說(shuō)明印度梨形孢是通過(guò)增強(qiáng)煙草細(xì)胞抗氧化能力，增加煙草內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，進(jìn)而提高煙草的抗病性。

總之，印度梨形孢能誘導(dǎo)煙草對(duì)土傳和葉部病害的抗性，病原菌侵染時(shí)，印度梨形孢能調(diào)控?zé)煵葜锌鼓嫖镔|(zhì)的積累量和誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的超量表達(dá)。印度梨形孢提高煙草抗病性是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在相關(guān)代謝物質(zhì)調(diào)節(jié)和印度梨形孢對(duì)基因的調(diào)控方面還有待于進(jìn)一步深入研究。

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Disease Resistance Analysis of Nicotiana tabacum Induced by Piriformospora indica

HUI Feiqiong1,2,MA Jie1,LIU Jian2,NIE Changchun2,GAO Qikang3,and LOU Binggan*1
1.Institute of Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China
2.China Tobacco Guizhou Industrial Co.,Ltd.,Guiyang 550001,China
3.Analysis Center of Agrobiology and Environmental Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China

Piriformospora indica(P.indica),a root-colonizing endophytic fungus,can improve the resistance of plants against biotic and abiotic stresses.In order to clarify the influences of P.indica on the disease resistance of Nicotiana tabacum,the resistance experiments against tobacco brown spot,anthracnose,damping off and sore shin were conducted wherein P.indica-colonized N.tabacum was inoculated with Alternaria longipes(A. longipes),Colletotrichum gloeosporioides(C.gloeosporioides),Pythium ultimum(P.ultimum)and Rhizoctonia solani (R.solani),respectively;and the contents of malondialdehyde(MDA)and proline,antioxidant enzyme activity and the expression levels of pathogenesis-related protein genes in tobacco leaves inoculated with A.longipes were analyzed.The results showed that comparing with the control,the size of disease spots and the MDA content in the leaves of P.indica-colonized N.tabacum inoculated with A.longipes reduced significantly,while the proline content and the expression levels of pathogenesis-related protein genes PR-1a,PR2,PR3 and PR5 increased significantly;the size of disease spots in the leaves of P.indica-colonized N.tabacum inoculated with C.gloeosporioides reduced;and damage symptoms of the leaves of P.indica-colonized N.tabacum inoculated with P.ultimum and R.solani significantly decreased.P.indica can improve the disease resistance of N. tabacum through maintaining the integrity of cell biomembrane system,keeping intracellular osmotic pressureand the peroxidation of membrane lipid at a lower level and regulating the expression of pathogenesis-related protein genes.

Endophyticfungus；Piriformosporaindica；Malondialdehyde；Proline；Tobaccodisease；Pathogenesis-related protein gene

TS414

A

1002-0861（2014）11-0074-06

貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目“印度梨形孢對(duì)煙草的誘導(dǎo)抗病及降低煙葉重金屬含量的作用”（201216）。

惠非瓊（1988—），在讀碩士研究生，研究方向：植物病理。E-mail：hfq543@126.com；*

樓兵干E-mail：bglou@zju.edu.cn

2014-05-30

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