張美玉+孫丹丹+劉洋+崔悅+趙小亮+張瑩+王志國(guó)+王丹巧

摘要： 目的：觀察腦內(nèi)同步灌流特異性呼吸鏈復(fù)合體 Ⅳ 抑制劑疊氮鈉（sodium azide， NaN3）對(duì)大鼠腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）和海馬細(xì)胞外液中乙酰膽堿（ACh）和膽堿（Ch）含量的影響，建立線粒體損傷的AD急性模型。方法：應(yīng)用腦雙位點(diǎn)雙通道同步微透析采樣技術(shù)，對(duì)清醒自由活動(dòng)正常大鼠mPFC和海馬同步灌流含NaN3（50 μmol·L^-1）和新斯的明（2 μmol·L^-1）的改良Ringer氏液120 min，并同步連續(xù)收集兩腦區(qū)的透析液。采用高效液相色譜-柱后固定化酶反應(yīng)器-電化學(xué)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ACh和Ch含量。結(jié)果：正常大鼠的mPFC細(xì)胞外液中ACh和Ch含量高于海馬區(qū)，NaN3在灌流期間能明顯降低mPFC/海馬細(xì)胞外液中ACh，但顯著升高Ch，并持續(xù)抑制mPFC/海馬區(qū)ACh和Ch含量恢復(fù)。結(jié)論：大鼠腦內(nèi)mPFC和海馬同步灌流NaN3使膽堿能神經(jīng)投射區(qū)域功能受損，可造成ACh和Ch代謝紊亂的AD急性模型，可用于病理機(jī)制和藥理學(xué)研究。

關(guān)鍵詞： 腦雙位點(diǎn)同步微透析；疊氮鈉；乙酰膽堿；膽堿；腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)；海馬

[收稿日期] 2013-06-20

[基金項(xiàng)目] 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項(xiàng)目課題（ZZ2010010，2013007）

[通信作者] 王丹巧，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，Tel：（010）64014411-2232，E-mail：dq_wang96@sohu.com

[作者簡(jiǎn)介] 張美玉，博士，副研究員，E-mail：meiyu96@126.com

目前研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙是阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）發(fā)病早期最主要的特征，與年齡相關(guān)的散發(fā)性AD的發(fā)病機(jī)制和線粒體損傷密切相關(guān)^[1-2]。患者出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、認(rèn)知功能明顯減退等臨床病理癥狀之前，海馬和頂、顳、額葉皮層的糖代謝出現(xiàn)異常，氧化磷酸化系統(tǒng)也遭到破壞。國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道使用特異性呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ抑制劑疊氮鈉（sodium azide， NaN3）用作建立“線粒體損傷”模型的工具藥^[3-5]。因此，本文擬采用本室新開(kāi)發(fā)的腦雙位點(diǎn)雙通道同步微透析采樣方法（brain microdialysis，BMD），對(duì)腦腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（ventromedial prefrontal cortex，mPFC）和海馬同步灌流NaN3造成膽堿能神經(jīng)投射區(qū)域線粒體損傷和膽堿類(lèi)遞質(zhì)代謝異常，建立一種相對(duì)簡(jiǎn)單、快速并適宜微透析動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的AD急性大鼠模型。用于篩選能改善腦能量代謝物質(zhì)的中藥腦保護(hù)劑，為尋找促智藥物提供方法學(xué)參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠12只，雄性，體重250～280 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)環(huán)境室溫度16～20 ℃，相對(duì)濕度為40%～55%，12 h光照周期（7：00至19：00照明）。

1.2 藥品和試劑 氯化乙酰膽堿（貨號(hào)A6625-25G），氯化膽堿（貨號(hào)C7017-5G），新斯的明（貨號(hào)C7017-5G），氯化鉀（貨號(hào)P9541），HPLC Grade，防腐劑 ProClin95（貨號(hào)46878-U），以上產(chǎn)品均購(gòu)自Sigma公司。乙腈和甲醇為Fisher Chemicals公司產(chǎn)品（HPLC級(jí)）。水合三氯乙醛（批號(hào)20111024），氯化鈉（批號(hào)20120413），氯化鈣（批號(hào)F20111116），氯化鎂（批號(hào)20100830），磷酸氫二鈉（批號(hào)20080116），磷酸二氫鉀（批號(hào)20071225），碳酸氫鈉（批號(hào)20120508），氫氧化鈉，磷酸二氫鈉，Na2·EDTA·2H2O 均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 液相檢測(cè)系統(tǒng)包括高效液相色譜，Antec Decade ⅡSDC電化學(xué)檢測(cè)器，鉑金工作電極，銀/氯化銀參比電極，Clarity Lite 色譜工作站，荷蘭Antecleyden公司出產(chǎn)。Microbore column ACh/Ch analytical column（165G-007A， 530×1 mm），AChE/ChOX×IMER（191-H03，50×1 mm），均由美國(guó)BASi公司提供。SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；德國(guó)Sartorius arium 61316反滲透純水系統(tǒng)；德國(guó)Sartorius PB-21 pH計(jì)；天津津騰水相和有機(jī)相微孔濾膜。手術(shù)使用設(shè)備：立體定位儀STRONG8003，動(dòng)物體溫維持儀-69001，顱鉆/90-102，均購(gòu)自深圳瑞沃德公司。玻璃離子體水門(mén)?。ㄅ?hào)201312，上海醫(yī)療器械股份有限公司齒科材料廠）。微透析系統(tǒng)包括CMA/12 MD Elite Probe（Menb length： 4 mm，Menb O.D. 0.5 mm，Cut-off： 20 000 Da； Menb length： 2 mm，Menb O.D. 0.5 mm，Cut-off： 20 000 Da）及探針套管，CMA/402微量注射泵，CMA/470低溫樣品自動(dòng)收集器，均購(gòu)自瑞典CMA Microd AB；五通轉(zhuǎn)環(huán)清醒活動(dòng)裝置（美國(guó)InsteCh公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、腦雙位點(diǎn)套管植入術(shù) 大鼠自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng) 3 d，體重為280～320 g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組）和模型組（M組），每組6只。分別進(jìn)行腦雙位點(diǎn)套管植入術(shù)。水合氯醛（350 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉。大鼠固定于立體定位儀，在腦mPFC（A：+3.2 mm，R：-1.5 mm，V：-2.0 mm，與矢狀面成10°的夾角）和海馬（A：-5.6 mm，R：+4.6 mm，V：-3.4 mm）埋入探針套管，用玻璃離子體水門(mén)汀固定。endprint

2.2 雙通道同步透析取樣 術(shù)后次日，大鼠在清醒狀態(tài)下插入探針，其中將膜長(zhǎng)2 mm探針插入mPFC位點(diǎn)套管中，將 4 mm探針插入于海馬套管中。固定好2個(gè)探針后，大鼠放在清醒活動(dòng)裝置內(nèi)讓其自由活動(dòng)。微透析方案如下：2條通道均用改良的Ringer氏液（含新斯的明2 μmol·L^-1，N-Ringer）以1.5 μL·min^-1進(jìn)行同步灌流。平衡2 h后，開(kāi)始收集透析液，每20 min收集1管。其中C組一直用N-Ringer灌流透析，共收集540 min。M組用N-Ringer平衡2 h后，開(kāi)始收集透析液80 min，作為基礎(chǔ)水平值。改用含NaN3的Ringer氏液（含NaN3 50 μmol·L^-1和新斯的明2 μmol·L^-1）灌流120 min，然后再換為N-Ringer灌流340 min。

2.3 高效液相-酶柱-電化學(xué)法（HPLC-IMER-ED）色譜分析透析液中ACh和Ch 色譜分析條件：等梯度洗脫的流動(dòng)相組成為：50 mmol·L^-1的NaH2PO4·2H2O，0.5 mmol·L^-1的 Na2·EDTA·2H2O，2 mmol·L^-1的KCl，9.5%ProClin 1 mL·L^-1，用NaOH調(diào)節(jié)pH為8.3，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。流速0.13 mL·min^-1。參考電極的電位設(shè)置為+310 mV。柱溫和電極工作室溫為37 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。依次檢測(cè)奇數(shù)管號(hào)中透析液。

2.4 探針體外回收率測(cè)定 不同膜長(zhǎng)探針?lè)謩e放置于2 mix（Ach和Ch）的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，室溫37 ℃，用N-Ringer以 1.5 μL·min^-1灌流，平衡30 min后，開(kāi)始收集透析液，每20 min為1管，共4管。Ach（或Ch）探針體外回收率=（4管透析液的濃度均值/標(biāo)準(zhǔn)放置液中的濃度均值）×100%。

2.5 數(shù)據(jù)處理 測(cè)定 1，3 管透析液中Ach（或Ch）數(shù)值，取平均數(shù)作為基礎(chǔ)值，設(shè)定基礎(chǔ)值采集時(shí)間點(diǎn)為0 min。計(jì)量資料采用±s表示，SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用 Independent-Samples t test，自身前后對(duì)照采用重復(fù)測(cè)量分析方法分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 正常大鼠mPFC和海馬細(xì)胞外液中ACh含量 C組大鼠mPFC細(xì)胞外液中ACh含量在 40～80 min明顯高于海馬（P<0.05），在120～480 min mPFC中ACh具有高于海馬的趨勢(shì)。說(shuō)明正常大鼠mPFC中ACh含量高于海馬區(qū)。mPFC細(xì)胞外液中ACh隨著采集時(shí)間推移，在 200，360～440 min的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)含量低于基礎(chǔ)狀態(tài)值（P<0.05）。同樣，海馬細(xì)胞外液中ACh隨時(shí)間推移也顯著低于基礎(chǔ)值（120～480 min，P<0.01或P<0.001），海馬中ACh含量變化范圍較大（表1）。

3.2 NaN3對(duì)大鼠mPFC和海馬細(xì)胞外液中ACh的影響 與C組相比，M組大鼠mPFC細(xì)胞外液中ACh在灌流NaN3 40～80 min能顯著降低（P<0.01）。隨后逐漸恢復(fù)ACh含量。NaN3在80 min誘導(dǎo)海馬區(qū)ACh明顯下降（P<0.05），自120 min ACh開(kāi)始恢復(fù)，與C組海馬區(qū)ACh含量基本持平（圖1）。

M組大鼠mPFC細(xì)胞外液中ACh含量在NaN3灌流40～160 min能顯著降低（P<0.001或P<0.05），在灌流結(jié)束后360～480 min的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著減少（P<0.001）。同樣，海馬細(xì)胞外液中ACh在NaN3灌流和之后40～480 min均能顯著降低（P<0.001）。說(shuō)明NaN3灌流期間能導(dǎo)致mPFC和海馬細(xì)胞外液中ACh含量顯著降低，其后期抑制效應(yīng)也持續(xù)存在（表2）。

3.3 正常大鼠mPFC和海馬細(xì)胞外液中Ch含量 C組大鼠mPFC細(xì)胞外液中Ch在0，240和320～480 min明顯高于海馬（P<0.05或P<0.01）。說(shuō)明正常大鼠mPFC中Ch含量高于海馬區(qū)。mPFC細(xì)胞外液中Ch隨著采集時(shí)間推移，在120～480 min明顯低于基礎(chǔ)狀態(tài)值（P<0.001）。同樣，海馬細(xì)胞外液中Ch隨時(shí)間推移也顯著低于基礎(chǔ)值（120～480 min，P<0.001）。說(shuō)明mPFC和海馬細(xì)胞外液

與C組相比1）P<0.05，2）P<0.01；A. mPFC；B.海馬（圖2同）。

圖1 對(duì)大鼠mPFC和海馬細(xì)胞外液中ACh的影響（±s，n=6）

Fig.1 The ACh of extracellular fluid in mPFC and hippocampus of C and M group rats （±s，n=6）

圖2 對(duì)大鼠mPFC和海馬細(xì)胞外液中Ch的影響（±s，n=6）

Fig.2 The Ch of extracellular fluid in mPFC and hippocampus of C and M group rats（±s，n=6）

M組大鼠mPFC細(xì)胞外液中Ch含量在NaN3灌流40～120 min能急速顯著升高（P<0.01或 P<0.000 1）。同樣，海馬細(xì)胞外液中Ch在NaN3灌流期間及之后80～200 min均能顯著升高（P<0.05 或P<0.001）。說(shuō)明NaN3灌流能即可導(dǎo)致mPFC和海馬細(xì)胞外液中Ch含量顯著升高，灌流期間海馬區(qū)影響明顯高于mPFC；但灌流結(jié)束后均具有抑制Ch恢復(fù)的趨勢(shì)，對(duì)mPFC中Ch的抑制作用明顯大于海馬區(qū)（表4）。

4 討論endprint

AD是一種進(jìn)行性精神功能衰退性疾病。主要癥狀為進(jìn)行性記憶力和認(rèn)知力減退、言語(yǔ)障礙、精神運(yùn)動(dòng)異常等癥狀。AD包括與年齡相關(guān)的遲發(fā)型散發(fā)性AD和早發(fā)型遺傳性AD。近期有學(xué)者提出散發(fā)性AD的發(fā)病機(jī)制可通過(guò)“線粒體級(jí)聯(lián)假說(shuō)”來(lái)解釋。AD患者腦細(xì)胞中與線粒體氧化代謝有關(guān)的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物及三羧酸循環(huán)中所有酶活性均降低，其中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ（即細(xì)胞色素C氧化酶cytochrome C oxidase， COX）的活性降低明顯。腦切片中皮層及海馬區(qū)COX Ⅳ亞單位的mRNA水平下降， 因此COX缺陷可能是AD的特異性改變^[1-2]。實(shí)際上，線粒體功能障礙是AD發(fā)病早期最

主要的特征，由于線粒體損傷，出現(xiàn)能量代謝障礙、活性氧的產(chǎn)生及鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，從而誘發(fā)AD的發(fā)生。NaN3是特異性COX抑制劑，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道^[5]使用NaN3皮下恒速灌注大鼠，導(dǎo)致ATP合成減少，動(dòng)物腦內(nèi)COX活性下降，引發(fā)學(xué)習(xí)記憶障礙。然而，COX缺陷可能是導(dǎo)致模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制尚未完全闡明。

膽堿能損傷學(xué)說(shuō)是目前公認(rèn)的AD發(fā)病機(jī)制之一^[1]。AD患者皮質(zhì)的膽堿能系統(tǒng)發(fā)生了嚴(yán)重的潰變，引起老年性學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知障礙。正常前腦的膽堿能神經(jīng)元（基底核、斜角帶核和內(nèi)側(cè)隔核）合成大量ACh，經(jīng)投射纖維輸送至大腦皮層和海馬，mPFC參與注意、知覺(jué)和決策功能，而海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要解剖基礎(chǔ)。ACh和Ch是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要遞質(zhì)。Ch既是ACh的代謝產(chǎn)物又是合成ACh的前體物質(zhì)。ACh腦內(nèi)水平的平衡調(diào)節(jié)對(duì)維持學(xué)習(xí)、記憶、注意力和探究行為等腦高級(jí)功能的正常運(yùn)行非常關(guān)鍵。通過(guò)測(cè)定腦內(nèi)ACh的含量可以較可靠的反映腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)的功能。

本研究采用了BMD結(jié)合HPLC-IMER-ED方法，對(duì)NaN3導(dǎo)致的線粒體損傷AD模型的mPFC和海馬細(xì)胞外液中ACh和Ch進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)分析。結(jié)果顯示：正常狀態(tài)下大鼠mPFC細(xì)胞外液中ACh和Ch均高于海馬。NaN3在灌流期間能明顯降低mPFC/海馬細(xì)胞外液中ACh，但相反顯著升高Ch，而其停止灌流后均有抑制mPFC/海馬區(qū)ACh和Ch恢復(fù)的效應(yīng)。有研究^[6]顯示紋狀體內(nèi)灌流NaN390 min后該腦區(qū)細(xì)胞外液ACh水平較正常組持續(xù)下降，最低值在停止NaN3灌流后60 min時(shí)出現(xiàn)。而本研究顯示NaN3在灌流40 min后mPFC和海馬即明顯降低ACh水平，其最低值是在灌流開(kāi)始40～80 min。說(shuō)明NaN3對(duì)紋狀體的作用不如在mPFC和海馬2區(qū)表現(xiàn)更敏感。這可能是由于mPFC和海馬是腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)投射的主要區(qū)域。應(yīng)用NaN3對(duì)大鼠腦內(nèi)進(jìn)行灌流，可建立線粒體損傷而致ACh和Ch代謝紊亂的AD急性模型，可用于AD發(fā)病機(jī)制和藥理學(xué)研究，為篩選能改善腦能量代謝物質(zhì)的中藥腦保護(hù)劑提供了方法學(xué)參考和藥理學(xué)依據(jù)。

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Effect of synchronous perfusion of NaN3 in changes in content of

cholinergic neurotransmitter in medial prefrontal cortex and

hippocampal extra-cellular fluid

ZHANG Mei-yu， SUN Dan-dan， LIU Yang， CUI Yue， ZHAO Xiao-liang， ZHANG Ying， WANG Zhi-guo， WANG Dan-qiao（Medical Experimental Center， China Academy of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China）endprint

[Abstract] Objective： To observe the effect of synchronous perfusion of specific respiratory chain complex IV inhibitor sodium azide （NaN3） in brain on rat ventromedial prefrontal cortex （mPFC） and acetylcholine （ACh） and choline （Ch） contents in hippocampal extra-cellular fluid， and establish the AD rat model induced by mitochondrial acute injury. Method： The synchronous dual-probe dual-channel brain microdialysis sampling technology was applied to synchronously perfuse modified Ringer′s solution containing NaN3 （50 μmol·L^-1） and neostigmine （2 μmol·L^-1） into mPFC and hippocampus of conscious， freely moving normal rats， and continuously collect dialysates from different encephalic areas. Dynamic contents of ACh and Ch were determined by high performance liquid chromatography-post-column immobilized enzyme reactor-electrochemical process. Result： ACh and Ch contents in mPFC extra-cellular fluid of normal rats were higher than that in hippocampus. During the process of perfusion， NaN3 could significantly reduce ACh in mPFC/hippocampal extra-cellular fluid， but remarkably increase Ch， and constantly inhibit the recovery of ACh and Ch contents in mPFC/hippocampus. Conclusion： The synchronous perfusion of NaN3 in rat mPFC and hippocampus can injure functions of the cholinergic nerve projection area， and cause the acute AD model with ACh and Ch metabolic disorders. This model can be used in pathogenetic and pharmacological studies.

[Key words] synchronous dual-probe brain microdialysis； sodium azide； acetylcholine； choline； ventromedial prefrontal cortex； hippocampus

doi：10.4268/cjcmm20140324

[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint