王洋+徐燁華+熊愛琴+袁婭妮+鄭萍+馬萍+戴貴東+徐清斌

摘要： 目的：探討氧化苦參堿抑制異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)大鼠慢性心力衰竭及其對非對稱二甲基精氨酸（ADMA）代謝通路的影響。方法：雄性Sprague-Dawley大鼠，皮下注射ISO 5 mg·kg^-1·d^-1，連續(xù)給藥7 d誘發(fā)大鼠慢性心力衰竭。氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）于ISO注射前7 d灌胃給藥，共14 d。檢測血清學(xué)指標、心功能血流動力學(xué)參數(shù)、心臟質(zhì)量，并觀察心肌組織病理變化，同時采用Western blotting法測定相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果：氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）可顯著降低ISO誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠升高的血清心肌肌鈣蛋白I（cTn I）水平，改善左心室收縮和舒張功能及左心室重構(gòu)，顯著減輕ISO致大鼠心肌的病理學(xué)改變。還可降低ISO誘導(dǎo)心力衰竭大鼠血清ADMA含量（P<0.01），增加心室肌組織中二甲基二甲胺水解酶2（DDAH2）蛋白的表達（P<0.01），但對ISO誘導(dǎo)升高的蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（PRMT1）無影響。結(jié)論：氧化苦參堿可改善ISO誘導(dǎo)的慢性心力衰竭大鼠的心功能，抑制心室重構(gòu)，其作用機制與降低血清ADMA水平和增高心肌組織DDAH2表達水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 氧化苦參堿；異丙腎上腺素；慢性心力衰竭；ADMA；PRMT1；DDAH2

[收稿日期] 2013-11-06

[基金項目] 國家自然科學(xué)基金項目（81060024）

[通信作者] *徐清斌，副主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，Tel：（0951）6744205，E-mail： xu-qb@163.com

[作者簡介] 王洋，碩士研究生，E-mail：nick.nye-0313@163.com

氧化苦參堿（oxymatrine）又名苦參素，是從豆科槐屬植物寧夏特色回藥材苦豆子Sophora alopecuroides L.中提取的一種具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)的生物堿。具有抗炎、保肝和抗腫瘤等多種藥理作用^[1]，其對心血管系統(tǒng)的作用尤為顯著^[1-2]。研究表明，氧化苦參堿可以減少左冠狀動脈前降支結(jié)扎所致急性心肌缺血大鼠心肌梗死范圍，抑制心肌細胞凋亡^[3]。慢性心力衰竭是各種心臟疾病最為嚴重的階段，其發(fā)病率和死亡率均較高^[4]。血清非對稱性二甲基精氨酸（ADMA）水平與各類心血管事件的發(fā)生呈正相關(guān)，被認為是引發(fā)心血管事件的獨立危險因子之一^[5-6]。臨床及動物實驗表明，心力衰竭患者和試驗動物模型血清ADMA含量均顯著升高^[7-8]。本實驗旨在以ISO誘導(dǎo)大鼠慢性心力衰竭為模型，研究氧化苦參堿對大鼠慢性心力衰竭的抑制作用及其對ADMA代謝通路的影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重210～250 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（寧）2012-0001。

1.2 藥品和試劑 氧化苦參堿（寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司，純度99.8%，批號20091028）；異丙腎上腺素（ISO，上海梯西愛有限公司，純度>99.0%，批號MVSTF-NF）；心肌肌鈣蛋白I（cTn I），ADMA酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測試劑盒（武漢華美試劑有限公司）；烏拉坦、氯化鈉、多聚甲醛（Sigma公司）；凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；兔抗山羊PRMT1和山羊抗兔DDAH2抗體（Abcam公司）；小鼠抗β-actin抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。山羊抗兔、兔抗山羊和山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate購自Thermo Scientific公司；實驗用水為超純水。

1.3 儀器 BL-420E四道生物機能實驗系統(tǒng)（成都盟泰科技有限公司）；TY96-ⅡN型超生細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1850R型臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；Mutiskan Go 酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；PowerPac Basic電泳儀（美國BIO-RAD公司）；培清JS-860B凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。

2 方法

2.1 慢性心力衰竭動物模型的制備及分組 60只大鼠，隨機分為5組，每組12只，分別是：正常對照組（Control）、單用氧化苦參堿組（100 mg·kg^-1）、ISO組和氧化苦參堿高、低劑量組（100，50 mg·kg^-1）。根據(jù)文獻[9]，采用皮下注射ISO 5 mg·kg^-1·d^-1，連續(xù)注射7 d建立慢性心力衰竭大鼠模型。氧化苦參堿各組和ISO組皮下注射ISO 5 mg·kg^-1，每天1次，連續(xù)7 d。對照組和單用氧化苦參堿組大鼠皮下注射相應(yīng)體積生理鹽水。以上各組均于ISO注射前7 d灌胃給予氧化苦參堿，共14 d，灌胃給藥體積為5 mL·kg^-1。對照組和ISO組灌胃給予等體積生理鹽水。

2.2 心功能血流動力學(xué)參數(shù)的測定 各組動物末次給藥后禁食不禁水24 h，稱體重，20%烏拉坦（6 mL·kg^-1，ip）麻醉。于頸部偏右側(cè)行縱向切口，分離出右頸總動脈，結(jié)扎遠心端，用大鼠動脈夾封閉近心端，于兩端內(nèi)剪開血管并插入含有肝素生理鹽水（500 U·mL^-1）的心導(dǎo)管（PE50）至右頸總動脈，放開動脈夾，通過壓力換能器連接到BL-420E四道生物機能實驗記錄儀，記錄動脈血壓變化：動脈收縮壓（SAP）、動脈舒張壓（SDP）、平均動脈壓（MAP），穩(wěn)定后記錄15 min， 然后沿頸動脈向心方向?qū)?dǎo)管輕輕插入3～4.5 cm，當動脈壓力波形突然有大幅度的變化、舒張壓明顯下降時，說明導(dǎo)管已進入左心室，穩(wěn)定后記錄左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室壓力最大上升/下降速率 （+LVdp/dtmax / -LVdp/dtmin）、心率 （HR） 等。endprint

2.3 全心質(zhì)量/體重比值及左心室質(zhì)量/體重比值測定 各組動物在取血后立即處死，開胸取心臟，稱全心濕重，沿冠狀溝走行分離左心室并稱重。計算全心質(zhì)量/體重的比值和左心室質(zhì)量/體重的比值。

2.4 血清心肌肌鈣蛋白 I（cTn I）和ADMA水平的測定 全血于6 000×g離心15 min，取血清，嚴格按照ELISA試劑盒廠家說明書所述方法操作，檢測血清cTn I和ADMA的含量。

2.5 病理組織學(xué)觀察 切取心尖組織，置于10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片4 μm，行常規(guī)HE染色，200×鏡檢觀察。參照文獻[10]，將心肌病理損傷分為4級：0級（-），心肌細胞結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，無炎細胞浸潤，無細胞水腫、壞死或纖維化，間質(zhì)毛細血管無擴張或輕度擴張；I級（+），心肌細胞排列稀疏，少量炎細胞浸潤、心肌細胞水腫，間質(zhì)血管擴張，心肌組織可見局灶性纖維化，限于心內(nèi)膜下；Ⅱ級（），較多炎細胞浸潤，心肌細胞水腫，心肌細胞纖維化呈片狀分布，累及心壁全層，間質(zhì)可見明顯血管擴張；Ⅲ級（），有明顯的間質(zhì)血管擴張、水腫及炎細胞浸潤，心肌廣泛性大面積纖維化，灶間相互連接累及心壁全層。

2.6 Western blotting檢測 在約50 mg經(jīng)液氮研磨的心肌組織中加入0.3 mL冷裂解緩沖液，冰浴下超聲破碎細胞。4 ℃，1萬 r·min^-1離心10 min，取上清蛋白定量，剩余上清液加入上樣緩沖液100 ℃水浴10 min，-20 ℃保存。取蛋白樣本60 μg上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳（80 V/120 V電壓），200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別用抗PRMT1抗體（1∶300）、抗DDHA2抗體（1∶300）及抗β-actin抗體（內(nèi)參，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。分別加入山羊抗兔、兔抗山羊二抗（偶聯(lián)有HRP，1∶3 000）和兔抗小鼠二抗（偶聯(lián)有HRP，1∶5 000）常溫孵育2 h，加入超級化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液，曝光膠片。膠片掃描結(jié)果采用Quantity-one軟件分析，將目的條帶的吸光度與其相對應(yīng)的內(nèi)參β-actin的吸光度相比以校正誤差，所得比值代表該目的蛋白的相對含量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果以SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件包進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)的比較采用One-way ANOVA分析，P<0.05為存在統(tǒng)計學(xué)差異的界限。

3 結(jié)果

3.1 氧化苦參堿對心肌損傷標志物cTn I的影響 單用氧化苦參堿組與對照組相比血清cTn I無顯著性差異。與對照組相比，ISO組血清cTn I水平升高（P<0.01），提示ISO導(dǎo)致大鼠心肌損傷。氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）組血清cTn I含量明顯降低（P<0.01）。提示氧化苦參堿對心肌損傷具有保護作用，見圖1。

與對照組相比1）P<0.01；與模型組相比2）P<0.01（圖3，4同）。

圖1 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠血清cTn I的影響（±s，n=8）

Fig.1 Effect of oxymatrine on level of cTn I in ISO-induced chronic heart failure in rats （±s，n=8）3.2 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠血 流動力學(xué)的改善 單用氧化苦參堿組與對照組相比，血流動力學(xué)各項指標均無顯著差異。模型組與對照組比較，心率（HR），SAP，MAP，LVSP，+LVdp/dtmax均降低（P<0.01），-LVdp/dtmin增高（P<0.01）。提示ISO可降低動脈血壓和心肌舒縮功能。給予氧化苦參堿（100 mg·kg^-1）組SAP，MAP，LVSP明顯增高（P<0.01），HR和+LVdp/dtmax增高（P<0.05），-LVdp/dtmin明顯降低（P<0.01）。氧化苦參堿（50 mg·kg^-1）組HR，SAP，LVSP增高（P<0.05），-LVdp/dtmin降低（P<0.05）。提示氧化苦參堿可提高ISO誘導(dǎo)的動脈血壓，增強慢性心力衰竭大鼠心肌的收縮性能，改善左心室功能。舒張壓（SDP）各劑量組間比較無顯著性差異，見表1。

3.3 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠全心質(zhì)量/體重比值及左心室質(zhì)量/體重比值的影響 單用氧化苦參堿組與對照組比較，全心質(zhì)量/體重比值及左心室質(zhì)量/體重比值無顯著性差異。ISO組全心質(zhì)量/體重比值及左心室質(zhì)量/體重比值與對照組相比明顯增高（P<0.01），給予氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）組全心質(zhì)量/體重比值（P<0.01）和左心室質(zhì)量/體重比值（P<0.01）均下降。提示氧化苦參堿可以抑制ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚，見表2。

3.4 病理組織學(xué)HE染色觀察 單用氧化苦參堿組和對照組相比，大鼠心肌組織未見異常，病理損傷均為0級。ISO組心肌纖維排列松散，出現(xiàn)炎細胞浸潤，大面積心肌纖維化，心肌細胞腫脹和毛細血管擴張嚴重，僅見少量正常心肌組織細胞，病理損傷以Ⅱ，Ⅲ級為主。氧化苦參堿隨給藥劑量的增高，心肌纖維化程度依次有所改善，并且氧化苦參堿（100 mg·kg^-1）改善情況較為明顯，但未見炎細胞浸潤、心肌細胞腫脹及毛細血管擴張有明顯改善，病理損傷以I，Ⅱ級為主。提示氧化苦參堿可以減輕ISO誘導(dǎo)慢性心衰大鼠心肌損傷及心室重構(gòu)，見圖2和表3。

A.對照組；B.單用氧化苦參堿組；C.ISO組；D.氧化苦參堿高劑量+ISO組；E.氧化苦參堿低劑量+ISO組。

圖2 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠心肌組織形態(tài)的影響（HE，×200）endprint

Fig.2 Effect of oxymatrine on cardiac histopathological changes of ISO-induced chronic heart failure in rats（HE，×200）

3.5 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠血清ADMA的影響 單用氧化苦參堿組與對照組血清ADMA無顯著性差異。與對照組相比，ISO組血清ADMA含量明顯升高（P<0.01）。氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）組血清ADMA含量明顯降低（P<0.01）。提示氧化苦參堿抑制ISO誘導(dǎo)的大鼠心室重構(gòu)，與降低血清ADMA含量有關(guān)，見圖3。

3.6 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠心肌組織PRMT1和DDAH2表達的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，單用氧化苦參堿組心肌組織PRMT1和DDAH2未見顯著性差異，而ISO組PRMT1表達明顯增加（P<0.01），DDAH2的表達明顯降低（P<0.01）。給予氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）組PRMT1表達與ISO組無顯著性差異，而DDAH2的表達明顯增多（100 mg·kg^-1組P<0.01，50 mg·kg^-1組P<0.05）。提示氧化苦參堿可增加ISO誘導(dǎo)心肌組織DDAH2的表達，但對升高的PRMT1表達無影響，見圖4，5。

4 討論

氧化苦參堿是苦豆子中主要生物堿之一，具有對抗急性心肌缺血損傷，改善慢性心力衰竭大鼠心肌細胞功能及血流動力學(xué)，逆轉(zhuǎn)心室重塑等顯著的心血管作用[1-3， 11]，ADMA是新的獨立于傳統(tǒng)心血管疾病危險因素的預(yù)測因素，血清ADMA的濃度與慢性心力衰竭密切相關(guān)，降低血清ADMA含量對改善慢性心力衰竭有益^[5-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苦豆子中的另一主要生物堿苦參堿對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血損傷具有保護作用其機制與ADMA代謝通路有關(guān)^[8]。為此，本研究進一步探討了氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)大鼠慢性心力衰竭的抑制作用的機制是否與ADMA代謝通路有關(guān)。研究結(jié)果表明，氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)的大鼠慢性心力衰竭具有保護作用，可改善左心室功能和結(jié)構(gòu)，其作用機制與調(diào)控ADMA代謝通路有關(guān)。

cTn I是心肌纖維高特異性的調(diào)節(jié)蛋白，是心肌損傷敏感且特異的血清標志物，當心肌細胞損傷時，可大量釋放入血^[12]。動物實驗研究結(jié)果表明，ISO致急性心肌缺血大鼠血清cTn I濃度升高^[12]。本實驗研究結(jié)果表明，氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）能夠顯著降低ISO所致血清cTn I的水平，提示氧化苦參堿對心肌損傷具有保護作用。5 mg·kg^-1異丙腎上腺素連續(xù)給藥7 d，可以顯著降低心臟收縮和舒張功能，本實驗研究表明，ISO可以明顯降低大鼠HR，

圖3 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠血清ADMA的影響（±s，n=8）

Fig.3 Effect of oxymatrine on level of serum ADMA in ISO-induced chronic heart failure in rats （±s，n=8）

圖4 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)的慢性心力衰竭大鼠心肌組織PRMT1表達的影響（±s，n=7）

Fig.4 Effects of oxymatrine on expression of PRMT1 in hearts from ISO-induced heart failure rats （±s，n=7）

SAP，MAP，LVSP和+LVdp/dtmax并升高-LVdp/dtmin，與已有文獻報道一致^[9]。氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）可不同程度的改善ISO所致的各項異常血流動力學(xué)指標，提示氧化苦參堿對慢性心力衰竭大鼠的心功能具有保護作用。此外，ISO組大鼠全

與對照組相比1）P<0.01；與模型組相比2）P<0.01，3）P<0.05。

圖5 氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)的慢性心力衰竭大鼠心肌組織DDAH2表達的影響（±s，n=6）

Fig.5 Effects of oxymatrine on expression of DDAH2 in hearts from ISO-induced heart failure rats （±s，n=6）

心質(zhì)量/體重比值及左心室質(zhì)量/體重比值與對照組相比均顯著增高；心肌病理組織切片表明，ISO組心肌組織損傷嚴重，以心肌組織纖維化為主，與文獻報道結(jié)果一致^[9]。氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）可顯著降低慢性心力衰竭大鼠全心質(zhì)量與體重的比值及左心室質(zhì)量與體重的比值；明顯減輕心肌組織損傷程度，尤其是減輕ISO所致慢性心力衰竭大鼠心肌組織纖維化最為明顯，而對炎細胞浸潤、心肌細胞水腫及毛細血管擴張無明顯改善。提示氧化苦參堿可改善心力衰竭大鼠心室重構(gòu)和心肌損傷。

ADMA是一種內(nèi)源性一氧化氮合酶（NOS）抑制劑，能夠降低內(nèi)源性一氧化氮水平。研究表明，慢性心力衰竭患者血清ADMA水平明顯增高，體內(nèi)過多ADMA可增加心血管事件的風(fēng)險^[5-6]。動物實驗表明，ISO誘導(dǎo)的急性心肌缺血大鼠血清ADMA含量顯著增高^[8]。 本實驗結(jié)果表明，ISO誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠血清ADMA含量較正常大鼠明顯增高，給予氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）可明顯降低血清ADMA水平。提示氧化苦參堿抑制ISO誘導(dǎo)大鼠慢性心力衰竭作用與降低血清ADMA水平有關(guān)。endprint

ADMA在體內(nèi)是以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（PRMT1）作用下催化，經(jīng)蛋白水解酶水解生成；其代謝主要是被二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）分解為胍氨酸和二甲胺。DDAH是一種胞漿蛋白酶，存在2個亞型，DDAH1和DDAH2，其中DDAH2多存在于以內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達為主的組織中，如心肌組織和血管等^{[5-6，13]}。本實驗結(jié)果表明，ISO可誘導(dǎo)心肌組織PRMT1表達增多，并降低心肌組織中DDAH2的表達。氧化苦參堿（100，50 mg·kg^-1）可明顯增加DDAH2的表達，但對升高的PRMT1表達無影響。提示，氧化苦參堿通過恢復(fù)ISO誘導(dǎo)的心肌組織中降低的DDAH2，而減少ADMA含量。

綜上所述，氧化苦參堿對ISO誘導(dǎo)大鼠慢性心力衰竭具有抑制作用，其機制與增加心肌組織DDAH2的表達，進而降低血清ADMA水平有關(guān)。

氧化苦參堿是一種藥理作用廣泛的藥物，臨床用于治療乙型肝炎、肝纖維化，對慢性腎臟病患者可防止腎間質(zhì)纖維化，其不良反應(yīng)發(fā)生率低^[14-15]。氧化苦參堿尚具有抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成等作用；與環(huán)磷酰胺、平陽霉素、順鉑和5氟尿嘧啶等抗腫瘤藥物聯(lián)合使用可增強療效，并降低放化療的副作用^[16]。本實驗研究結(jié)果進一步明確了氧化苦參堿對大鼠慢性心力衰竭的保護作用與機制，一方面，為今后氧化苦參堿用于治療慢性心力衰竭提供了實驗依據(jù)，另一方面，也為研究氧化苦參堿是否對抗腫瘤藥所致心臟損傷具有保護作用提供了重要線索。

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Protective effect of oxymatrine on chronic heart failure and ADMA

metabolism pathway in isoproterenol-induced chronic heart failure in rats

WANG Yang1， XU Ye-hua2， XIONG Ai-qin2， YUAN Ya-ni1， ZHENG Ping1， MA Ping2， DAI Gui-dong3， XU Qing-bin2*

（1.Department of Pharmacology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

2. Department of Cardiology， General Hospital of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

3.Department of Pharmaceutical Engineering， School of Chemical and Materials Engineering， Kaili University， Kaili 556011， China）

[Abstract] Objective： To investigate the protective effects of oxymatrine on chronic heart failure induced by isoproterenol （ISO） and to observe its effects on ADMA metabolism pathway in ISO-induced chronic heart failure in rats. Method： Male Sprague-Dawley rats were given oxymatrine （100，50 mg·kg^-1） orally for 14 days. Heart failure was induced in rats by subcutaneous injection of isoproterenol （5 mg·kg^-1·d^-1） at the 8th day for 1 week. Serum parameters， haemodynamic parameters， Heart weight， and histopathological variables were analysed. Expression of protein levels were measured by Western blot. Result： Oxymatrine （100，50 mg·kg^-1） significantly attenuated serum content of cTn I， improved left ventricle systolic and diastolic function and left ventricular remodeling， reduced the ISO-induced myocardial pathological changes compared with ISO group. In addition， oxymatrine （100，50 mg·kg^-1） significantly reduced serum level of ADMA （P<0.01）， normalize the reduced dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 （DDAH2） expression （P<0.01）， but had no effect on the isoproterenol-induced upregulated protein arginine methyltransferases 1 expression. Conclusion： Oxymatrine could ameliorate the experimental ventricular remodeling in ISO-induced chronic heart failure in rats and the mechanism involved in reducing serum content of ADMA and increased DDAH2 expression.

[Key words] oxymatrine； isoproterenol； chronic heart failure； ADMA； PRMT1； DDAH2

doi：10.4268/cjcmm20140321

[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint