劉瑩瑩，劉 穎，張 光，孫冰玉，王金鳳，石彥國(guó)

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

毛霉高產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

劉瑩瑩，劉 穎，張 光，孫冰玉，王金鳳，石彥國(guó)*

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

以雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實(shí)驗(yàn)材料，采用單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種毛霉高產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基最佳成分為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為2.5%、KH2PO4添加量為0.4%、CaCl2添加量為0.11%，此條件下中性蛋白酶酶活力達(dá)1310.56U/mL；五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基最佳成分為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為3.0%、KH2PO4添加量為0.37%、CaCl2添加量為0.07%，此條件下中性蛋白酶酶活力達(dá)1306.38U/mL。兩種毛霉酶活力提高的百分比分別為60.1%和46.7%，此研究成果為縮短腐乳后酵周期及直裝腐乳發(fā)酵工藝的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)酵培養(yǎng)基，毛霉，中性蛋白酶酶活力

腐乳是我國(guó)具有民族特色的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品，在世界飲食文化之林中有著特殊的地位。其口味鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，是深受大眾喜愛的佐餐食品，被稱為“東方奶酪”[1]。釀造腐乳包括一系列的物理化學(xué)和生物化學(xué)過程，大豆浸泡、磨漿、點(diǎn)漿、壓榨成型制成豆腐的工序?qū)儆谖锢砘瘜W(xué)過程，豆腐前發(fā)酵培菌和加輔料后發(fā)酵等主要屬于生物化學(xué)過程，每一道工序都會(huì)影響其品質(zhì)[2]。在腐乳生產(chǎn)過程中有多種微生物和酶參與，其共同作用造就了腐乳的獨(dú)特風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和一些特殊的保健功能[3-4]。腐乳發(fā)酵階段是微生物發(fā)揮作用的主要階段，發(fā)酵階段可分為前期培菌和后期發(fā)酵。前期培菌是在半開放條件下培養(yǎng)微生物的酶系；后期發(fā)酵主要是酶系與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程[5-7]。因此，腐乳的生產(chǎn)離不開微生物。常用于生產(chǎn)腐乳的微生物有毛霉、根霉、米曲霉、酵母菌、紅曲霉及細(xì)菌等，其中，毛霉產(chǎn)蛋白酶種類較多、產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。本研究以腐乳生產(chǎn)常用的雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實(shí)驗(yàn)菌株，通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，提高毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力，從而縮短腐乳發(fā)酵周期、解決腐乳生產(chǎn)受季節(jié)限制的問題，提高腐乳的生產(chǎn)效率、滿足市場(chǎng)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）菌種編號(hào)3118、五通橋毛酶（Wutungkiao Mucor）菌種編號(hào)40477 購于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；氯化鈣、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、碳酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蔗糖 分析純，西隴化工股份有限公司；三氯乙酸 分析純，天津市巴斯夫化工有限公司；黃豆粉、豆坯 哈爾濱珍味糧油冷凍產(chǎn)品商貿(mào)集團(tuán)公司；可溶性淀粉、葡萄糖 分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂 分析純，天津博迪化工股份有限公司；乳糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酪蛋白、福林酚 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

80-2B型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；722E型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；無菌操作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SY-2-4型電熱式恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司；電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶液制備 取出于28℃、pH6.0條件下，發(fā)酵60h的毛霉發(fā)酵液于80目的網(wǎng)篩過濾去菌絲，之后將濾液在4000r/min下離心20min；取1.0mL濾液于100.0mL容量瓶中，用磷酸緩沖溶液定容至100.0mL，即制得稀釋酶液[8-9]。

1.2.2 中性蛋白酶酶活測(cè)定方法 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23527-2009），采用Folin-酚法測(cè)定中性蛋白酶活力[10]。

1.2.3 毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.3.1 碳源種類及濃度對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加10%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉五種碳源，以10%大米粉作參照，并加入2%的豆坯、0.5%的NaCl配制培養(yǎng)基。每500mL三角瓶裝液量150mL，調(diào)節(jié)pH6.0，0.1MPa、121℃滅菌30min[11]。冷卻后接入孢子數(shù)為×106、2%的毛霉孢子懸液，于28℃下培養(yǎng)60h，充分發(fā)酵后制成粗酶液，測(cè)定中性蛋白酶酶活力，確定最佳碳源種類。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別添加8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的蔗糖作為碳源，在相同條件下，測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力，確定碳源最適添加比例。

1.2.3.2 氮源種類及濃度對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加濃度為2%酵母膏、黃豆粉、豆坯、硫酸銨四種氮源，以2%蛋白胨為參照，并加入10%的蔗糖（五通橋毛霉為8%）、0.5%的NaCl配制培養(yǎng)基，其他條件與1.2.3.1相同，測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力，確定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶最佳氮源種類。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別添加1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%比例的黃豆粉作為氮源，在相同條件下，充分發(fā)酵后制成粗酶液，測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力，確定氮源最適添加比例。

1.2.3.3 無機(jī)鹽種類及濃度對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響 由于無機(jī)鹽種類及添加量對(duì)毛霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶影響很大，故本實(shí)驗(yàn)以相關(guān)的研究資料及參考文獻(xiàn)[12-14]為依據(jù)，分別在毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基中添加四種無機(jī)鹽成分，MgSO40.04%、NaCl 0.5%、KH2PO40.4%、CaCl20.1%，以空白作參照，并加入10%的蔗糖（五通橋毛霉為8%）、3%的黃豆粉，其他條件與1.2.3.1相同，充分發(fā)酵后制成粗酶液，測(cè)定毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力，確定最佳無機(jī)鹽種類及濃度。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，KH2PO4的添加量分別為0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%；CaCl2的添加量分別為0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%。同時(shí)添加其他輔料配制培養(yǎng)基，同樣根據(jù)蛋白酶活力確定兩種無機(jī)鹽的最適添加濃度。

1.2.3.4 毛霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，以蔗糖添加量、黃豆粉添加量、KH2PO4、CaCl2為四個(gè)影響因素，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）安排實(shí)驗(yàn)，以毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活為指標(biāo)，進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，因素水平表見下表1和表2。

表1 雅致放射毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化因素水平表Table.1 Orthogonal factors level for optimization of fermentation medium of Actinomucor elegans

表2 五通橋毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化因素水平表Table.2 Orthogonal factors level for optimization of fermentation medium of Wutungkiao Mucor

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用單因素及無空列正交實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)做三次平行實(shí)驗(yàn)，研究了幾個(gè)影響因素對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響，并使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最后通過極差分析得出各個(gè)影響因素的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類及濃度對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響

由圖1可知，本實(shí)驗(yàn)所使用的幾種碳源，均可被兩種毛霉利用產(chǎn)生蛋白酶。蔗糖和葡萄糖對(duì)于蛋白酶的合成有較好的促進(jìn)作用，其中蔗糖對(duì)于蛋白酶合成的誘導(dǎo)作用要顯著優(yōu)于其他碳源（p＜0.05），兩種毛霉菌產(chǎn)蛋白酶酶活分別達(dá)1227.68、1196.19U/mL。葡萄糖有利于毛霉菌絲體的生長(zhǎng)，但對(duì)于蛋白酶合成的誘導(dǎo)作用無蔗糖明顯（p＜0.05）。故將蔗糖選為毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

由圖2可知，隨著蔗糖的加入，兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高；在蔗糖濃度在8%～9%之間時(shí)，蛋白酶酶活上升較顯著（p＜0.05）；當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到10%時(shí)，蛋白酶酶活也達(dá)到最大值1242.05U/mL和1208.74U/mL；但此后，隨著蔗糖濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白酶酶活開始下降，可能是由于過多的蔗糖利于菌絲體的大量生長(zhǎng)繁殖而抑制了蛋白酶的生成。故毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度選為10%。

圖1 碳源種類對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響Fig.1 The influence of carbon source species on neutral protease activity of mucor

圖2 碳源濃度對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響Fig.2 The influence of carbon source concentration on neutral protease activity of mucor

2.2 氮源種類及濃度對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響

由圖3可知，本實(shí)驗(yàn)所提供的幾種氮源，均可被兩種毛霉利用產(chǎn)生蛋白酶。其中黃豆粉的促進(jìn)作用較明顯（p＜0.05），雅致放射毛霉和五通橋毛霉蛋白酶酶活分別達(dá)1245.42、1230.28U/mL，而其他幾種氮源雖可被毛霉利用，但對(duì)于蛋白酶合成的誘導(dǎo)作用沒有有利的影響（除酵母膏外），蛋白酶酶活沒有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的酶活高。故將黃豆粉選為毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖3 氮源種類對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響Fig.3 The influence of nitrogen source species on neutral protease activity of mucor

圖4 氮源濃度對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響Fig.4 The influence of nitrogen source concentration on neutral protease activity of mucor

由圖4可知，隨著黃豆粉的加入，兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高；在黃豆粉添加量在1%～2%之間時(shí)，蛋白酶酶活上升較顯著（p＜0.05）；隨后，蛋白酶酶活上升較緩慢，但仍呈上升趨勢(shì)；當(dāng)黃豆粉添加量在3%時(shí)，蛋白酶酶活達(dá)到最大值1260.38、1245.37U/mL，故毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源添加量選為3%。

2.3 無機(jī)鹽種類及濃度對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響

由圖5可知，MgSO4、KH2PO4和CaCl2相對(duì)于NaCl而言，在提高蛋白酶酶活的影響較顯著（p＜0.05）。添加MgSO4、KH2PO4和CaCl2的培養(yǎng)基中，雅致放射毛霉的蛋白酶酶活力分別達(dá)到了1270.46、1287.36、1280.32U/mL；五通橋毛霉蛋白酶酶活力分別達(dá)到了1260.16、1270.15、1272.76U/mL；磷酸鹽在發(fā)酵液中起到了緩沖體系pH的作用，對(duì)保持產(chǎn)酶環(huán)境的穩(wěn)定，同時(shí)也同MgSO4和CaCl2一起起到了誘導(dǎo)毛霉產(chǎn)蛋白酶的作用[15]。綜上所述，在優(yōu)化毛霉蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方案中的無機(jī)鹽選擇為MgSO4、KH2PO4和CaCl2。因?yàn)镸gSO4的添加量0.04%很小，故對(duì)另兩種無機(jī)鹽設(shè)置濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

圖5 無機(jī)鹽種類對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響Fig.5 The influence of inorganic salt species on neutral protease activity of mucor

由圖6可知，隨著KH2PO4的加入，兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高。雅致放射毛霉在KH2PO4添加量在0.3%～0.35%之間時(shí)，蛋白酶酶活上升較顯著（p＜0.05）；當(dāng)KH2PO4添加量超過0.40%時(shí)，蛋白酶酶活出現(xiàn)下降趨勢(shì)，即當(dāng)KH2PO4濃度為0.40%時(shí)，蛋白酶酶活達(dá)到最大值1283.53U/mL；對(duì)于五通橋毛霉，當(dāng)KH2PO4濃度為0.35%時(shí)，五通橋蛋白酶酶活達(dá)到最大值1282.58U/mL，故KH2PO4的最佳濃度分別選為0.40%和0.35%。

圖6 KH2PO4濃度對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響Fig.6 The influence of KH2PO4concentration on neutral protease activity of mucor

由圖7可知，隨著CaCl2的加入，兩種毛霉菌的產(chǎn)蛋白酶酶活均有所升高。對(duì)于雅致放射毛霉，CaCl2添加量在0.06%～0.1%之間時(shí)，蛋白酶酶活上升；當(dāng)CaCl2添加量超過0.1%時(shí)，蛋白酶酶活下降；當(dāng)CaCl2濃度為0.1%時(shí)，雅致放射毛霉蛋白酶酶活達(dá)到最大值1288.05U/mL。而CaCl2濃度為0.08%時(shí)，五通橋毛霉蛋白酶酶活達(dá)到最大值1286.02U/mL。綜上，兩種毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳CaCl2濃度分別選為0.1%和0.08%。

圖7 CaCl2濃度對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響Fig.7 The influence of CaCl2concentration on neutral protease activity of mucor

2.4 培養(yǎng)基正交優(yōu)化

2.4.1 雅致放射毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化的結(jié)果與分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以A：蔗糖、B：黃豆粉、C：KH2PO4、D：CaCl2的添加量為四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。選用L9（34）正交表對(duì)雅致放射毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，采用SPSS17.0進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

由表3中實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差RB＞RC＞RD＞RA可知，四個(gè)因素對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響趨勢(shì)為B＞C＞D＞A，即黃豆粉添加量對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響最顯著，其次為KH2PO4、CaCl2、蔗糖添加量。最佳參數(shù)組合為A2B1C2D3，即當(dāng)蔗糖添加量為10%，黃豆粉添加量為2.5%，KH2PO4添加量為0.4%，CaCl2添加量為0.11%時(shí)，雅致放射毛霉產(chǎn)蛋白酶酶活最高達(dá)1310.56U/mL。

表3 雅致放射毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.3 Orthogonal experiment results for optimization offermentation medium of Actinomucor elegans

2.4.2 五通橋毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以A：蔗糖、B：黃豆粉、C：KH2PO4、D：CaCl2的用量為三個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蛋白酶酶活作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。選用L9（34）正交表對(duì)五通橋毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，采用SPSS17.0進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表4 五通橋毛霉發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.4 Orthogonal experiment results for optimization offermentation medium of Wutungkiao Mucor

由表4中實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差RB＞RD＞RC＞RA可知，四個(gè)因素對(duì)五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的影響趨勢(shì)為B＞D＞C＞A，即黃豆粉添加量對(duì)五通橋毛霉產(chǎn)蛋白酶的影響最顯著，其次為CaCl2、KH2PO4、蔗糖添加量。最佳參數(shù)組合為A2B2C3D1，即當(dāng)蔗糖添加量為10%，黃豆粉添加量為3.0%，KH2PO4添加量為0.37%，CaCl2添加量為0.07%時(shí)，五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)1306.38U/mL。

3 結(jié)論

本研究以雅致放射毛霉和五通橋毛霉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了不同發(fā)酵培養(yǎng)基成分及添加量對(duì)毛霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響，得出雅致放射毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為2.5%、KH2PO4添加量為0.4%、CaCl2添加量為0.11%，在此條件下，中性蛋白酶酶活力達(dá)1310.56U/mL；五通橋毛霉產(chǎn)中性蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖添加量為10%、黃豆粉添加量為3.0%、KH2PO4添加量為0.37%、CaCl2添加量為0.07%，在此條件下，中性蛋白酶酶活力達(dá)1306.38U/mL。

研究結(jié)果表明，利用優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行毛霉發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶，雅致放射毛霉和五通橋毛霉酶活力提高的百分比分別為60.1%和46.7%，此研究成果為縮短腐乳后酵周期及直裝腐乳發(fā)酵工藝的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimum fermentation medium of high-yielding neutral protease of mucor

LIU Ying-ying，LIU Ying，ZHANG Guang，SUN Bing-yu，WANG Jin-feng，SHI Yan-guo*
（College of Food Engineering，Key Laboratory of Food Science and Engineering of Common Colleges and Universities in Heilongjiang Province，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Actinomucor elegans and Wutungkiao Mucor were used as experimental materials，through single factor and orthogonal experiments，the optimization of fermentation medium composition for high-yielding protease of two kinds of hair mould was researched.The results showed that the optimal fermentation medium composition for neutral protease of Actinomucor elegans was：sucrose content 10%，soybean flour 2.5%，KH2PO40.4%，CaCl20.11%，the neutral protease activity was 1310.56U/mL.The optimal fermentation medium composition for neutral protease of Wutungkiao Mucor was：sucrose content 10%，soybean flour 3.0%，KH2PO40.37%，CaCl20.07%，the last neutral protease activity was 1306.38U/mL.The improve percentage of neutral protease activities were 60.1%and 46.7%respectively.This research laid the foundation for follow-up study of shortenning the fermentation cycle of fermented bean curd and production process of direct-loading fermented bean curd.

fermentation medium；mucor；neutral protease activity

TS214.2

A

1002-0306（2014）06-0166-05

2013－08－05 *通訊聯(lián)系人

劉瑩瑩（1988-），女，碩士研究生，研究方向：大豆化學(xué)與深加工技術(shù)。

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B03-4）。