伊娟娟，王振宇，2，*，白海娜，左麗麗，高季瑜

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

大果沙棘黃酮對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖水平的影響

伊娟娟1，王振宇1，2，*，白海娜1，左麗麗1，高季瑜1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

目的：研究大果沙棘黃酮對(duì)四氧嘧啶（ALX）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖水平的影響。方法：用ALX制造糖尿病小鼠模型，大果沙棘總黃酮（BFH）及各流段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均分為對(duì)照組、模型組、低、中、高劑量組，每天一次性灌胃，連續(xù)灌胃4周。結(jié)果：與模型組相比，BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均能顯著地降低ALX誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖水平和尿素氮（BUN）含量，提高胰島素水平、肝（?。┨窃?，同時(shí)也可提高糖尿病小鼠的麥芽糖酶水平。結(jié)論：大果沙棘總黃酮和純化后的三個(gè)流份均能有效的控制糖尿病小鼠血糖水平，有望開(kāi)發(fā)成安全有效的降糖產(chǎn)品。

沙棘黃酮，四氧嘧啶，糖尿病，血糖

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者的胰島素分泌能力及身體對(duì)胰島素的敏感性逐漸降低，血糖升高，是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的主要原因[1]。攝入高熱量及高脂肪、高蛋白等結(jié)構(gòu)不合理飲食會(huì)導(dǎo)致肥胖，隨著體重的增加及缺乏運(yùn)動(dòng)，胰島素抵抗會(huì)進(jìn)行性加重，也會(huì)導(dǎo)致胰島素分泌缺陷和Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[2]。糖尿病并發(fā)癥是一種常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，是由糖尿病病變轉(zhuǎn)變而來(lái)，會(huì)引起一系列常見(jiàn)糖尿病并發(fā)疾病癥狀如：腎功能衰竭、失明、腦血管病變、心臟病等，甚至危及生命[3-4]。但目前降血糖的化學(xué)藥品由于其毒副作用大，不宜長(zhǎng)期服用，并且常伴隨不適癥狀發(fā)生[5]。所以開(kāi)發(fā)自然資源，研究中醫(yī)藥治療和改善血糖變化，預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生有十分重要的臨床意義。

目前，已有研究表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)ALX誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物血糖、血脂具一定的降低作用，對(duì)糖尿病和高血脂并發(fā)癥的治療有一定功效[6]。且現(xiàn)研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)大果沙棘（Hippophae rhamnoides var.sp）果中含有大量的生物活性物質(zhì)，包括黃酮、多酚、類(lèi)胡蘿卜素、有機(jī)酸、脂類(lèi)等，其主要活性成分為沙棘黃酮，此活性因子使其具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝、抑菌、保護(hù)心血管系統(tǒng)等生理功能，且具有很好的預(yù)防治療糖尿病及其并發(fā)癥的功效。為了深入探討黃酮類(lèi)化合物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響情況，本研究選擇大果沙棘為研究對(duì)象，用四氧嘧啶（Alloxan，ALX）誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，研究大果沙棘總黃酮及各流份段黃酮對(duì)ALX糖尿病鼠血糖的對(duì)比影響，通過(guò)灌胃小鼠大果沙棘總黃酮BFH及各流段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ與模型組作比較，研究大果沙棘不同組分黃酮對(duì)機(jī)體血糖影響情況，以期為揭示大果沙棘黃酮的降血糖作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大果沙棘果渣 由黑龍江省孫吳縣林業(yè)局提供；四氧嘧啶（ALX） Sigma公司；麥芽糖酶（CAT）試劑盒、尿素氮（BUN）試劑盒、肝（肌）糖元（glycogen）試劑盒、胰島素（insulin）試劑盒 均由南京建成生物工程研究所提供；昆明小鼠 清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量（25±2.0）g，由黑龍江省腫瘤醫(yī)院提供，小鼠預(yù)先分籠飼養(yǎng)，室溫（22±1.0）℃，相對(duì)濕度60%±5.0%。

722s可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療電子儀器廠(chǎng)；R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝儀器公司；FJ-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器公司；TDL-5臺(tái)式離心機(jī) 上?？婆d儀器有限公司；WI305227血糖儀 北京東儀科技有限公司；Model550酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大果沙棘果渣黃酮提取純化室 將大果沙棘果渣于40℃下烘干，粉碎過(guò)40目篩。稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量的大果沙棘果渣利用超臨界CO2萃取系統(tǒng)將其進(jìn)行脫脂處理，再用70%乙醇進(jìn)行提取。充分?jǐn)嚢韬螅捎贸暪β?20W超聲輔助提取3次，每次超聲時(shí)間1h，每隔30min振蕩一次，將提取得到的黃酮浸提液經(jīng)離心、過(guò)濾、濃縮、冷凍干燥，得到大果沙棘黃酮粗提物即SBPF。將SBPF粗提取物采用型號(hào)為X-5大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附層析，吸附達(dá)到飽和后用70%乙醇溶液洗脫處理，再經(jīng)濃縮、凍干處理后得到實(shí)驗(yàn)所需的大果沙棘總黃酮（BFH）[9-10]。經(jīng)過(guò)上述一系列實(shí)驗(yàn)處理后，再進(jìn)行二次洗脫操作處理收集洗脫液，經(jīng)紫外掃描，將掃描峰形一致的洗脫液合并收集，得到大果沙棘黃酮三段流份，分別為BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ。

1.2.2 ALX誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的建立 將小鼠先放入動(dòng)物室內(nèi)適應(yīng)性喂基礎(chǔ)飼料觀(guān)察7d，禁食12h，自由飲水。用滅菌生理鹽水配制2%ALX溶液，每只小鼠選用100mg/kg·bw劑量一次性腹腔注射ALX制作糖尿病小鼠模型。注射72h后，尾靜脈采血，測(cè)定禁食12h后空腹血糖值，選取空腹血糖值大于11.10mmol/L的小鼠為模型小鼠[11-12]。

1.2.3 動(dòng)物分組與處理 選取體重（25±2）g的小鼠200只，按沙棘黃酮流份不同將小鼠平均分為四大組，每大組平均分為五小組，即基礎(chǔ)對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每小組10只小鼠。低、中、三個(gè)劑量組是按沙棘黃酮人體推薦攝入量、人體推薦攝入量的10、20倍分為低（2.0g/kg·bw）、中（20g/kg·bw）、高（40g/kg·bw）劑量組。

小鼠糖尿病模型成功建立后，開(kāi)始灌胃沙棘總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ組分，灌胃劑量分別為2.0、20、40mg/（kg·bw·d）。給藥組每天灌胃給藥一次，正常小鼠對(duì)照組和模型組每天灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)4周。每天測(cè)體重一次。每周測(cè)血糖一次，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃量，灌胃期間小鼠自由取食和飲水。灌胃4周后，禁食12h，眼球采血、常規(guī)操作分離血清，再分別測(cè)定Insulin、BUN含量及麥芽糖酶活力[13-14]；解剖取肝臟和肌肉制成組織勻漿，分別測(cè)定肝（?。┨窃俊?/p>

1.2.4 指標(biāo)的測(cè)定 以上測(cè)定指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFH及各流份段黃酮對(duì)ALX糖尿病小鼠血糖的對(duì)比分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總黃酮及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對(duì)ALX糖尿病小鼠血糖的影響對(duì)比研究?？傸S酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對(duì)ALX糖尿病小鼠血糖的影響結(jié)果，見(jiàn)圖1。

圖1 BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對(duì)ALX糖尿病小鼠血糖的影響Fig.1 BFH and BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢaffect blood sugal in ALX diabetes mice

圖1結(jié)果顯示，BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組小鼠的血糖測(cè)量值都極顯著（p＜0.01）低于模型組，且各劑量組之間降血糖功能差異顯著，BFH各劑量組降血糖功能要略?xún)?yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組，并呈一定的量效關(guān)系。從圖1中可以看出，BFHⅢ各劑量組與模型組相比，均極顯著降低（p＜0.01）。但BFH、BFHⅠ、及BFHⅡ高劑量組的血糖值比模型組均顯著（p＞0.05）降低，且分別降低了58.35%、54.01%及52.73%。BFHⅢ高劑量組與模型組血糖值比較降低了36.95%，作用效果較BFH、BFHⅠ及BFHⅡ高劑量組略差。以上結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，BFH、BFHⅠ及BFHⅢ各灌胃組隨劑量的增加，血糖值變化呈下降趨勢(shì)，BFHⅡ劑量組變化不顯著（p＞0.05），即對(duì)血糖調(diào)節(jié)作用效果越好，表明大果沙棘黃酮對(duì)糖尿病小鼠具有一定的血糖調(diào)節(jié)功能。

2.2 BFH及各流份段黃酮對(duì)ALX糖尿病小鼠Insulin影響對(duì)比分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對(duì)ALX糖尿病小鼠Insulin的影響對(duì)比研究。總黃酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對(duì)ALX糖尿病小鼠Insulin的影響結(jié)果，見(jiàn)圖2。

圖2 BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對(duì)ALX糖尿病小鼠Insulin的影響Fig.2 BFH and BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢaffect Insulin in ALX diabetes mice

圖2結(jié)果顯示，BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組小鼠的Insulin測(cè)量值都極顯著（p＜0.01）高于模型組，且各劑量組之間對(duì)Insulin的調(diào)節(jié)作用存在差異性。在一定劑量范圍內(nèi)，隨著，BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量灌胃劑量的增加，調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，且增加的幅度不明顯。即BFH各劑量組調(diào)節(jié)Insulin水平的能力要低于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組，并呈一定的量效關(guān)系。從圖2中可以看出，以高劑量組為例，BFH比模型組升高了63.15%，BFHⅠ比模型組升高了50.27%，BFHⅡ比模型組升高了47.78%，BFHⅢ比模型組升高了70.96%。表明大果沙棘黃酮各劑量組對(duì)糖尿病小鼠的Insulin水平具有一定的調(diào)節(jié)功能。

2.3 BFH及各流份段黃酮對(duì)ALX糖尿病小鼠BUN的影響對(duì)比分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對(duì)ALX糖尿病小鼠BUN的影響對(duì)比研究?？傸S酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對(duì)ALX糖尿病小鼠BUN的影響結(jié)果，見(jiàn)圖3。

圖3結(jié)果顯示，BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組小鼠的BUN測(cè)量值都顯著（p＜0.01）低于模型組，除BFHⅢ各劑量組之間調(diào)節(jié)BUN能力的變化趨勢(shì)降不明顯外，其他BFH和BFHⅠ、BFHⅡ各組均隨著灌胃劑量的增加，BUN調(diào)節(jié)能力有所增強(qiáng)。從圖3中可以看出，BFH低劑量組與BFHⅠ、BFHⅢ低劑量組對(duì)BUN調(diào)節(jié)水平的能力幾乎相同，而B(niǎo)FHⅡ中、高劑量組卻優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅢ中、高劑量組，BFHⅡ各劑量組是BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組中作用效果最顯著的，且BFHⅡ中、高劑量組是與模型組比較分別降低了31.97%，42.15%。且BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各組中模型組小鼠的BUN與模型對(duì)照組小鼠的BUN存在顯著（p＜0.05）差異，說(shuō)明小鼠腎臟已經(jīng)有一定的損傷。以上結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，BFH、BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各灌胃組均對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠BUN有一定的調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明大果沙棘黃酮對(duì)腎臟損傷小鼠具有一定的修復(fù)作用。

圖3 BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對(duì)ALX糖尿病小鼠BUN的影響Fig.3 BFH and BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢaffect BUN in ALX diabetes mice

2.4 BFH及各流份段黃酮對(duì)ALX糖尿病小鼠麥芽糖酶的影響對(duì)比分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對(duì)ALX糖尿病小鼠麥芽糖酶的影響對(duì)比研究?？傸S酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對(duì)ALX糖尿病小鼠麥芽糖酶的影響結(jié)果，見(jiàn)圖4。

圖4 BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對(duì)ALX糖尿病小鼠麥芽糖酶的影響Fig.4 BFH and BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢaffect Maltase in ALX diabetes mice

由圖4可見(jiàn)，BFH與BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均可提高糖尿病小鼠的麥芽糖酶的水平，并且隨著各組劑量的增加，調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，且BFH各劑量對(duì)糖尿病小鼠的麥芽糖酶的調(diào)節(jié)能力明顯優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對(duì)應(yīng)的各劑量組。以高劑量組為例，分別比模型組升高了37.69%、69.09%、72.36%、95.96%。

2.5 BFH及各流份段黃酮對(duì)ALX糖尿病小鼠肝糖元的影響對(duì)比分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對(duì)ALX糖尿病小鼠肝糖元的影響對(duì)比研究。總黃酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對(duì)ALX糖尿病小鼠肝糖元及肌糖元的影響結(jié)果，見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，BFH與BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組，對(duì)ALX糖尿病小鼠的肝糖元和肌糖元均具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且隨著劑量的增加，調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，肝（?。┨窃暮砍噬仙厔?shì)。BFH對(duì)增強(qiáng)肝糖元的能力要優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ。以高劑量組為例，分別比模型組提高了89.62%、73.68%、57.89%和35.08%。對(duì)肌糖元的調(diào)節(jié)能力以高劑量組為例，分別比模型組高1.17倍，1倍，73%和60%。BFH對(duì)增強(qiáng)肌糖元的能力要優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ，這與對(duì)肌糖元的影響效果趨勢(shì)是一致的。表明BFH與BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組對(duì)ALX誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有一定的改善作用。

圖5 BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對(duì)ALX糖尿病小鼠肝、肌糖元的影響Fig.5 BFH and BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢaffect Hepatic（muscle）glycogen in ALX diabetes mice

3 結(jié)論與討論

糖尿病主要由胰島素分泌的絕對(duì)或相對(duì)缺乏所引起。ALX是一種特異性的胰島B細(xì)胞毒劑，對(duì)胰島B細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致胰島素分泌不足而誘發(fā)糖尿病[15]。并在體內(nèi)可選擇性被胰腺B細(xì)胞吸收，激活自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生過(guò)量的自由基。過(guò)量自由基能夠直接破壞B細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞的損傷和壞死，胰島素水平降低而出現(xiàn)高血糖等糖尿病癥狀[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)四氧嘧啶誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，ALX誘導(dǎo)的糖尿病模型成功后，研究了大果沙棘總黃酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對(duì)糖尿病小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，模型組小鼠血糖與正常組比較，血糖明顯升高且穩(wěn)定，表明ALX誘導(dǎo)的糖尿病模型具有一定的穩(wěn)定性。綜上，通過(guò)對(duì)相關(guān)測(cè)定指標(biāo)血糖值、Insulin、BUN、麥芽糖酶及肝糖元和肌糖元的相關(guān)分析，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了大果沙棘黃酮對(duì)ALX所致胰島β細(xì)胞的損傷有一定的保護(hù)作用，BFH和各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均可以顯著（p＜0.05）提高ALX糖尿病小鼠的血清胰島素水平，對(duì)腎功能損害也有一定的修復(fù)作用，表明大果沙棘黃酮對(duì)腎臟也具有一定的保護(hù)作用，對(duì)脂質(zhì)代謝異常有一定的糾正修復(fù)功能，本研究結(jié)果與現(xiàn)有同類(lèi)天然植物多酚研究如葛雷[17]的蘋(píng)果渣多酚及賈仁勇等[18]的青刺果黃酮相比，其研究?jī)r(jià)值可觀(guān)，進(jìn)而有預(yù)防糖尿病發(fā)生及發(fā)展的開(kāi)發(fā)潛能。

我國(guó)大果沙棘的開(kāi)發(fā)和利用前景極為廣闊，今后應(yīng)加大大果沙棘產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)研究投入，在制藥、保健食品及化妝品等方面進(jìn)行系列開(kāi)發(fā)和產(chǎn)品研制。但總體來(lái)看，大果沙棘的基礎(chǔ)性研究開(kāi)展的不夠，特別是與大果沙棘醫(yī)藥保健應(yīng)用密切相關(guān)的現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)基礎(chǔ)研究沒(méi)有展開(kāi)，大果沙棘果、籽、葉、莖、皮和根中的活性物質(zhì)還沒(méi)有被完全掌握，大果沙棘中的許多活性物質(zhì)的化學(xué)、藥學(xué)和藥理的研究亟待深入，這些問(wèn)題均有待于我們通過(guò)進(jìn)一步對(duì)大果沙棘進(jìn)行更深入的研究來(lái)得到更可靠的結(jié)論。

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Hpyerglycemic of flavonoids and various components from Hippophae rhamnoides L.in ICR mice with alloxan induced diabetes

YI Juan-juan1，WANG Zhen-yu1，2，*，BAI Hai-na1，ZUO Li-li1，GAO Ji-yu1
（1.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China；2.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

Objective：To examine the potential hpyerglycemic of flavonoids from sea buckthorn（Hippophae rhamnoides L.）BFH and each flow period of flavonoids BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢ different dose groups in ICR mice with diabetes healthy IR mice were used as experiment animals to create an alloxan（ALX）induced diabetic model.Methods：Mice with ALX induced diabetes were randomly divided into 4 groups including model control group administered normal saline by adiministration and BFH and BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢdifferent dose groups all administered control group，model control group，low，medium and high doses groups. All the groups were administered once a day for 4 consecutive weeks.Results：Compared to the control group，the BFH，BFHⅠ，BFHⅡand BFHⅢgroups could lowered the level of serum glucose and BUN significantly，and elevated insulin，glycogen and maltase levels.Conclusion：The BFH and BFHⅠ，BFHⅡ，BFHⅢ different dose groups not only effectively regulates the levels of serum glucose，but also was expected to develop into a safe and effective hypoglycemic products.

flavonoids from sea buckthorn；alloxan（ALX）；diabetes；serum glucose

TS255.1

A

1002-0306（2014）06-0347-05

2013－07－08 *通訊聯(lián)系人

伊娟娟（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取與功能分析。