姜紹通，殷嘉憶，王華林，姜蘇薇，鄭 娟

（合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 2300 09）

響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取芋頭淀粉工藝參數(shù)

姜紹通，殷嘉憶，王華林，姜蘇薇，鄭 娟

（合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 2300 09）

采用堿性蛋白酶 作為蛋白質(zhì)酶解劑，對提取芋頭淀粉的工藝進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取芋頭淀粉的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：芋頭淀粉酶法提取的最佳工藝參數(shù)為酶解時(shí)間137 min、酶用量0.9%、酶解溫度41 ℃、pH 10，在 此條件下芋頭淀粉的實(shí)際提取率達(dá)88.92%。堿性蛋白酶法制得的芋頭淀粉主要理化指標(biāo)為蛋白質(zhì)含量0.08%、白度94.45%、平均粒徑1.23 μm。掃描電子顯微鏡圖顯示該提取方法未對淀粉顆粒造成損傷。

芋頭；淀粉；堿性蛋白酶；提取；響應(yīng)面法

芋頭（Colocasia esculenta （L.）Schott）別名芋魁，俗稱芋艿，屬天南星科草本植物[1]。芋頭在我國種植范圍廣，但其深加工開發(fā)程度遠(yuǎn)不及甘薯、馬鈴薯等根莖類農(nóng)作物[2]。芋頭塊莖中含水量高，不易貯藏，據(jù)報(bào)道平均30%的芋頭在儲(chǔ)存過程中腐爛[3]，造成了極大的資源浪費(fèi)。因此對芋頭進(jìn)行深加工十分必要。

芋頭塊莖中含有大量淀粉[4]，這些淀粉顆粒非常細(xì)小，不同品種的芋頭淀粉粒徑分布在1.5～10 ?m之間[5-7]，是理想的化妝品撲粉、脂肪替代品和載體材料[8]，具有良好的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外對芋頭淀粉提取主要有水提過篩法[5]、己二酸鈣法[9]、稀氨水法[10]，但是由于芋頭淀粉被大量的黏蛋白所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊緊包裹[11-12]，導(dǎo)致這些方法的提取率均不高。

Lumdubwong[13]、LI Yue[14]等用蛋白酶法提取與大米蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的大米淀粉，獲得了較高的提取率。鑒于此，考慮到芋頭組織中的多酚氧化酶使其在pH 6.0～8.8范圍內(nèi)極易發(fā)生酶促褐變[15]，本實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶法提取芋頭淀粉，通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)[16]，并分析測定所得芋頭淀粉的理化指標(biāo)，為芋頭淀粉的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芋頭：萊陽孤芋，購于合肥市周谷堆農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場；堿性蛋白酶 南京龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FK-A組織搗碎機(jī)、JJ-1型數(shù)顯電動(dòng)攪拌器 江蘇金壇市金城國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠；JMS-50C膠體磨 廊坊市廊通機(jī)械有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CR22GⅡ超速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；UDK152全自動(dòng)凱氏定氮儀 意大利VELP公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；SU8020場發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 芋頭淀粉提取

新鮮芋頭去皮切絲，取200 g，按照1∶4（g/mL）的料液比加入蒸餾水，用組織搗碎機(jī)打漿后，過膠體磨3 次，置于設(shè)定溫度的恒溫水浴鍋中并不斷攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至設(shè)定值，加入一定量的堿性蛋白酶（本實(shí)驗(yàn)所用堿性蛋白酶酶活為198 000 U/g）進(jìn)行提取一定時(shí)間后，料液依次過80、200、325目篩，收集濾液，過濾后的濾渣加水再次過濾，反復(fù)多次至濾渣加水后上層基本澄清。提取過程中用稀酸和稀堿維持pH值恒定。將收集的濾液離心（3 000 r/min）15 min，棄上清液，用蒸餾水洗滌沉淀物，再次離心（3 000 r/min）15 min，重復(fù)洗滌3 次。將沉淀物于45 ℃熱風(fēng)干燥16 h，即得芋頭淀粉。

1.3.2 酶法提取芋頭淀粉工藝參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)

表 1 單因素試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in single factor design

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

以提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化酶法提取芋頭淀粉工藝參數(shù)的工況和試驗(yàn)參數(shù)如表1、2所示。固定料液比1∶4（g/mL）。

1.3.3 酶活力測定

采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林酚法。

1.3.4 淀粉含量的測定

采用GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》酸水解法[17]。

1.3.5 理化指標(biāo)測定

水分含量的測定：采用GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》常壓烘箱干燥法；灰分含量的測定：采用GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測定》灼燒質(zhì)量法；脂肪含量的測定：采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測 定》索氏抽提法；蛋白質(zhì)含量的測定：采用GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法；白度的測定：采用GB/T 22427.6—2008《淀粉白度測定》。

1.3.6 顆粒形貌分析[18]

采用場發(fā)射掃描電鏡觀察芋頭淀粉的顆粒形貌。取微量樣品，用導(dǎo)電膠布固定于樣品臺(tái)上，按壓均勻后，用洗耳球吹去多余未黏牢的淀粉。將樣品臺(tái)置于離子濺射噴鍍儀中鍍金處理，處理好的樣品用場發(fā)射掃描電鏡觀察并拍照顆粒形貌，放大倍數(shù)20 000倍，加電壓1 000 V。

1.3.7 粒度分布測定

取100mg淀粉樣品分散均勻于100 mL去離子水中，然后轉(zhuǎn)移至Mastersizer 2000型激光粒度分析儀的分散盒中進(jìn)樣分析，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析結(jié)果，得到樣品的粒徑分布數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對芋頭淀粉提取率的影響

圖1 酶解時(shí)間對芋頭淀粉提取率的影響Fig.1 Effect o f enzymatic hydrolysis time on the extraction yield of taro starch

由圖1可以看出，酶解條件為芋頭200 g，料液比1∶4（g/mL）、酶用量0.9%、酶解溫度40 ℃、酶解pH 10，當(dāng)酶解時(shí)間在30～150 min范圍時(shí)，芋頭淀粉提取率隨著酶解時(shí)間的延長而增加，當(dāng)酶解時(shí)間大于150 min時(shí)，芋頭

淀粉提取率基本保持不變。原因可能是隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸被堿性蛋白酶破壞，對淀粉的束縛力變小[19]，有利于芋頭淀粉顆粒的溶出，導(dǎo)致芋頭淀粉提取率升高。但在酶解足夠的時(shí)間以后，蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本被酶解充分，酶解時(shí)間再延長，芋頭淀粉提取率也不再升高。因此，適宜的酶解時(shí)間為150 min。

2.1.2 酶用量對芋頭淀粉提取率的影響

圖2 酶用量對芋頭淀粉提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on th e extraction yield of taro starch

由圖2可以看出，酶解條件為芋頭200 g、料液比1∶4（g/mL）、酶解時(shí)間150 min、酶解溫度40 ℃、酶解pH 10。在一定范圍內(nèi)，芋頭淀粉的提取率隨著酶用量的增加而升高，當(dāng)酶用量為0.9%時(shí)，提取率最高，之后增加堿性蛋白酶的用量，提取率反而開始下降。可能的原因是當(dāng)酶濃度較低時(shí)，隨著酶用量的升高，酶與底物的接觸面積增大，有助于蛋白質(zhì)的酶解，芋頭淀粉提取率提高[20]。但當(dāng)酶濃度達(dá)到過飽和時(shí)，酶與底物產(chǎn)生競爭，對蛋白酶產(chǎn)生一定的抑制作用，一部分酶分子沒有與底物接觸的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)酶解率降低，淀粉提取率下降[21]。因此，選擇加酶量0.9%為宜。

2.1.3 酶解溫度對芋頭淀粉提取率的影響

圖3 酶解溫度對芋頭淀粉提取率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction yield of taro starch

適宜的溫度對酶活性具有重要影響，尋找酶最適反應(yīng)溫度也就成為酶反應(yīng)中非常關(guān)鍵的步驟。由圖3可以看出，酶解條件為芋頭200 g、料液比1∶4（g/mL）、酶解時(shí)間150 min、酶用量0.9%、酶解pH 10。溫度從30 ℃升高到40 ℃，芋頭淀粉提取率呈上升趨勢，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高，淀粉提取率逐漸下降。這可能是因?yàn)?，在低于酶的最適溫度時(shí)，溫度升高，酶反應(yīng)速度加快，而當(dāng)溫度再升高至超過酶的最適溫度時(shí)，蛋白酶逐漸開始變性，部分失去活性，降低了酶反應(yīng)速度[22]，結(jié)果導(dǎo)致了蛋白質(zhì)酶解不完全，淀粉的提取率降低。因此確定最適酶解溫度為40 ℃。

2.1.4 酶解pH值對芋頭淀粉提取率的影響

圖4 酶解pH值對芋頭淀粉提取率的影響Fig.4 Eff ect of enzymatic hydrolysis pH on the extraction yield of taro starch

由圖4可以看出，酶解條件為芋頭200 g，料液比1∶4（g/mL）、酶解時(shí)間150 min、酶用量0.9%、酶解溫度40 ℃。pH值從8增加到10時(shí)，淀粉提取率逐漸提高；當(dāng)pH值為10時(shí)，芋頭淀粉提取率最高；而后隨著pH值的增加，淀粉提取率降低。說明此堿性蛋白酶的最適pH值接近10，在pH 10附近時(shí)，蛋白酶對蛋白質(zhì)的酶解效果最好，淀粉提取率也相應(yīng)最高[23]。因此，適宜的pH值為10。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

表 3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

以淀粉提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件優(yōu)化芋頭淀粉提取工藝參數(shù)。通過29 次試驗(yàn)得到芋頭淀粉提取的最佳工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。固定料液比為1∶4（g/mL）。

2.2.2 回歸模型的有效性及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得pH值、酶解溫度、酶用量、酶解時(shí)間與芋頭淀粉提取率之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

該模型的方差分析結(jié)果見表4。

表 4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression equation

由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬檢驗(yàn)不顯著，說明回歸模型與實(shí)際情況擬合得很好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用此模型對芋頭淀粉的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測。模型中一次項(xiàng)X1、X2極顯著，X3顯著；交互項(xiàng)X1X3、X1X4極顯著；二次項(xiàng)X21、X22、X23、X42均極顯著。

為更直觀地反映pH值與酶用量（X1X3）、pH值與酶解時(shí)間（X1X4）交互作用對芋頭淀粉提取率的影響規(guī)律，分別將模型中其他兩個(gè)因素固定在0水平，繪制出相應(yīng)的三維曲面圖，如圖5、6所示。

圖5表明了固定酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間140 min時(shí)，pH值和加酶量交互作用對淀粉提取率的影響。可以看出pH值在9 ～10范圍內(nèi)，酶用量為芋頭質(zhì)量的0.6%～0.9%范圍內(nèi)時(shí)，兩者存在著增效作用，提取率隨著pH值和酶用量的增大而增加；而pH值在10～11范圍內(nèi)，酶用量在0.9%～1.2%范圍內(nèi)時(shí)，提取率隨著2個(gè)因素的增大反而開始降低。

HX1）與酶用量（X3）交互作用對芋頭淀粉提取率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plot for the effect of pH (X1) and enzyme dosage (X3) on the extraction yield of taro starch

HX1）與酶解時(shí)間（X4）交互作用對芋頭淀粉提取率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plot for the effect of pH (X1) and enzymatic hydrolysis time (X4) on the extraction yield of taro starch

固定溫度40 ℃、加酶量0.9%時(shí)，pH值與酶解時(shí)間交互作用對淀粉提取率的影響如圖6所示。當(dāng)pH值一定時(shí)，芋頭淀粉提取率隨著酶解時(shí)間的延長變化不明顯；酶解時(shí)間一定時(shí)，提取率隨著pH值的增加先升高后降低。

由Design-Expert 8.0軟件分析可知，最大響應(yīng)值對應(yīng)的因素條件為：酶解時(shí)間137.33 min、酶用量0.89%、酶解溫度40.58 ℃、pH 10.04，芋頭淀粉提取率預(yù)測值為88.77%。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證回歸模型預(yù)測值的準(zhǔn)確性，對響應(yīng)面分析得到的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性，將最佳工藝條件修正為：酶解時(shí)間137 min、酶用量0.9%、酶解溫度41 ℃、pH 10，經(jīng)過3 次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到芋頭淀粉提取率平均值為88.92%，該值落在預(yù)測值的95%預(yù)測區(qū)間[86.18, 91.35]內(nèi)，說明優(yōu)化得到的淀粉提取工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，該回歸模型具有較好的預(yù)測效果。

2.3 芋頭淀粉的主要理化指標(biāo)由表5可知，堿性蛋白酶法制得的芋頭淀粉純度很高，其中蛋白質(zhì)含量僅為0.08%，明顯低于稀氨水法（蛋白質(zhì)含量0.29%）[10]、水提過篩法（蛋白質(zhì)含量0.53%）[5]

表 5 芋頭淀粉的主要理化指標(biāo)Table 5 Major physical and chemical indices of taro starch

等制得的芋頭淀粉的蛋白質(zhì)含量，有助于芋頭淀粉的保藏運(yùn)輸。且酶法提取的芋頭淀粉無需2 次除蛋白，可以直接用作要求蛋白含量在0.5%以下的變性淀粉或淀粉糖的原料[24]。堿性蛋白酶法制得的芋頭淀粉白度優(yōu)于稀氨水法（白度91.8%）[10]，色澤潔白有光澤，具有開發(fā)成為化妝品撲粉的潛質(zhì)。

2.4 芋頭淀粉的顆粒性質(zhì)

2.4.1 顆粒形貌分析

圖7 芋頭淀粉的掃描電鏡圖（×20 000）Fig.7 SEM images of taro starch (× 20 000)

由圖7可以看出，芋頭淀粉表面結(jié)構(gòu)光滑、完整、無裂痕，證明用堿性蛋白酶法提取芋頭淀粉，未對淀粉顆粒本身造成不良影響。而早期采用微波協(xié)同提取的方法，使得淀粉發(fā)生降解，淀粉顆粒表面出現(xiàn)凹坑，淀粉明顯受到損傷[18,25]。芋頭淀粉顆粒多為多面體形或近球形，多面體形比例較高且顆粒較大，近球形比例較小且顆粒相對較小。

2.4.2 粒度分布測定

表 6 芋頭淀粉粒度分析數(shù)據(jù)Table 6 Distribution analysis of taro starch

由圖8可以看出，芋頭淀粉的粒度體積表現(xiàn)為雙峰分布，第1個(gè)峰集中出現(xiàn)的峰值粒徑為0.1 μm，第2個(gè)峰高于第1個(gè)峰，峰值粒徑為1.5 ?m。淀粉的體積平均粒徑、表面積平均粒徑、d（0.5）、d（0.9）值見表6。由表6可以看出，與其他市售淀粉如平均粒徑20 ?m的木薯淀粉[26]和平均粒徑15 ?m的玉米淀粉[26]相比，芋頭淀粉平均粒徑非常小，可進(jìn)一步開發(fā)作為吸附載體、脂肪替代品。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)獲得了酶法提取芋頭淀粉的最佳工藝參數(shù)：酶解時(shí)間137 min、酶用量0.9%、酶解溫度41 ℃、pH 10，該條件下芋頭淀粉提取率達(dá)88.92%，建立的回歸模型具有較好的預(yù)測效果。

采用最佳工藝條件制得的芋頭淀粉主要理化指標(biāo)為：水分含量9.85%、蛋白質(zhì)含量0.08%、灰分含量0.15%、淀粉含量89.14%。制得的芋頭淀粉潔白有光澤，顆粒細(xì)小，掃描電鏡圖顯示該方法對淀粉顆粒未造成不良影響。

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Optimization of Enzymatic Extraction Parameters for Taro Starch

JIANG Shao-tong, YIN Jia-yi, WANG Hua-lin, JIANG Su-wei, ZHENG Juan
(Key Laboratory for Agriculture Processing Product of Anhui Province, Institute of Agricultural Products Proc e ssing Technology, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Taro starch is wrapped around taro protein, thus leading to low extraction yield of taro starch. In the present study, the extraction of taro starch was investigated by using alkaline protease to hydrolyze taro protein. Based on single factor experiments, various process parameters were opt imized by response surface methodology. The results revealed that the optimum hydrolysis parameters for enzymatic extra ction of taro starch were determined as pH 10, 41 ℃, 137 min and an enzyme dose of 0.9%. The experimentally observed maximum yield of ta ro starch under these con ditions was 88.92%. Physicochemical analyses showed that the taro starch obt ained exhibited a protein content of 0.08%, a whiteness of 94.45% and an average particle size of 1.23 μm. Scanning electron microscopy observation indicated that the extraction process did not damage starch granules.

taro; starch; alkaline protease; extraction; response surface methodology

TS235.9

A

1002-6630（2014）06-0024-06

10.7506/spkx1002-6630-201406005

2013-08-04

安徽省科技專項(xiàng)（13Z03042）

姜紹通（1954—），男，教授，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品生物化工。E-mail：jiangshaotong@163.com