董 穎，張 鶴，周光新，趙大慶*，趙 雨，叢德毓

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

正交試驗(yàn)優(yōu)化哈蟆油蛋白雙酶法水解工藝

董 穎，張 鶴，周光新，趙大慶*，趙 雨，叢德毓

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

目的：考察雙酶法制備哈 蟆油蛋白 的最佳工藝。方法：以哈蟆油為原料，采用檸檬酸浸提和水煎煮的方 法提取哈蟆油蛋白，先后加入胃蛋白酶和堿 性蛋白酶進(jìn)行酶解，根據(jù)酶解后哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布，應(yīng)用單因素和正交試驗(yàn)確定哈蟆油蛋 白酶解的最佳條件。結(jié)果：最佳酶解條件為胃蛋白酶與底物比（m/m）1∶2 000、酶解時(shí)間2 h、堿性蛋白酶與底物 比（m/m）1∶100、酶解時(shí)間6 h，酶解后哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占的比例為94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)含量為49.85%。結(jié)論：胃蛋白酶與堿性蛋白酶結(jié)合使用可以有效地降低哈蟆油蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，利于人體吸收。

哈蟆油蛋白；胃蛋白酶；堿性蛋白酶；雙酶法

哈蟆油（Oviductus Ranae）是中國(guó)林蛙（Rana chensinensis）雌蛙的干燥輸卵管[1]，又稱“林蛙油”，是我國(guó)東北特產(chǎn)的名貴中藥[2]，具有明顯抗疲勞[3]、抗衰老[4]、抗氧化[5]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[6]、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌等多種保健作用[7]。哈蟆油中主要含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、磷脂、激素及微量元素等多種成分[8]，其中蛋白質(zhì)約占總量的一半以上[9]。哈蟆油中黏蛋白屬于高度糖基化的大分子糖蛋白[10-12]，相對(duì)分子質(zhì)量在3×106～40×106之間[13]，遇水易膨脹，膨脹度大于55[1]，且黏稠度較大，既不利于人體消化吸收，也不利于加工生產(chǎn)[14]。目前，市場(chǎng)主要以哈蟆油粗加工產(chǎn)品為主[15]，哈蟆油中多數(shù)成分不易被人體吸收。哈蟆油采用檸檬酸浸提和熱水提取過(guò)程中，黏蛋白經(jīng)酸解和熱解后，其相對(duì)分子質(zhì)量有所降低，但仍在幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)，水溶性較差，需進(jìn)一步采用蛋白酶進(jìn)行酶解。本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法制備哈蟆油蛋白，可以明顯降低哈蟆油蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，使哈蟆油蛋白更易被人體消化和吸收，提高了哈蟆油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哈蟆油：由吉林省白山市北亞藥業(yè)提供，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李宜平教授鑒定為中國(guó)林蛙Rana chensinensis雌蛙的干燥輸卵管；胃蛋白酶、堿性蛋白酶 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；凝膠色譜柱標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量試劑（相對(duì)分子質(zhì)量依次：6 500、13 700、29 000、43 000、75 000、158 000、440 000、669 000） GE Healthcare公司；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、Na2SO4美國(guó)Fluka公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀 美國(guó)Aglient公司；TSKgelG2 000SW（XL）凝膠色譜柱 日本Tosoh公司；Uvmini-1240紫外分光光度計(jì) 島津儀器有限公司；PL230電子天平、PHS-25數(shù)顯酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；WFO烘箱 上海愛(ài)郎儀器有限公司；LL3000凍干機(jī) 瑞典Jouna Nordi c公司。

1.3 方法

1.3.1 哈蟆油原料預(yù)處理

哈蟆油去除筋膜等雜質(zhì)后，置于陰涼處晾干，粉碎成細(xì)粉，-20℃冰箱保存。

1.3.2 哈蟆油總蛋白的提取

稱取1.0 g哈蟆油細(xì)粉，按料液比（g/mL）1∶100加入pH 4.5的檸檬酸溶液100 mL，浸泡36 h，勻漿后加入2 000 mL蒸餾水，煎煮2 h，冷卻至室溫，用10 mmol/L HCl溶液調(diào)pH 2.89，定容至200 mL，哈蟆油蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL，備用。

1.3.3 胃蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解條件

取5 mg/mL的哈蟆油蛋白提取液，首先加入適量的0.1 mg/mL胃蛋白酶溶液，放入烘箱中37 ℃加熱酶解，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，放至室溫，然后用10 mmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 9.0～10.0，再繼續(xù)加入適量的1 mg/mL堿性蛋白酶溶液，烘箱中55 ℃進(jìn)行二次酶解，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，放至室溫，調(diào)節(jié)pH 6.8～7.2，取樣400 ?L，0.22 ?m濾膜過(guò)濾，備用。

1.3.4 哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效液相凝膠色譜法，根據(jù)酶解后哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占的比例/%=相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占的峰面積/總峰面積×100

1.3.5 高效凝膠色譜條件

流動(dòng)相為0.08 mol/L NaH2PO4·2H2O、0.08 mol/L Na2HPO4·2H2O、0.08 mol/L Na2SO4，pH 6.8；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

1.3.6 哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)含量[16]。制作氮含量(x，μg/mL）與吸光度（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，回歸方程為y=0.069 8x-0.002 2，R2=0.999 1，依據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品中的含氮量，根據(jù)含氮量乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)得出哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)質(zhì)量。

哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)含量/%=哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)量/哈蟆油蛋白質(zhì)量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 胃蛋白酶加酶量的確定

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，選取胃蛋白酶與底物比（m/m，下同）分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。然后再選取堿性蛋白酶與底物比（m/m，下同）為1∶250加堿性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h，考察胃蛋白酶不同酶量對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響。

圖1 胃蛋白酶不同加酶量對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of different doses of pepsin on the percentage of peptideswith molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

從圖1可以看出，隨著胃蛋白酶用量的增加，哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占比例逐漸增加，在酶與底物比1∶2 000以后，相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占比例變化較小，因此選擇酶與底物比為1∶2 000。

2.1.2 胃蛋白酶酶解時(shí)間的確定

圖2 胃蛋白酶不同酶解時(shí)間對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different pepsin hydrolysis durations on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶與底物比1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃分別酶解2、2.5、3、3.5、4 h。選取堿性蛋白酶與底物比為1∶250加堿性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h，考察胃蛋白酶不同酶解時(shí)間對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響。

由圖2可以看出，隨著胃蛋白酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占比例的總體變化趨勢(shì)相差較小，均在90%以上，表明胃蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)哈蟆油蛋白酶解影響較小，因此確定胃蛋白酶酶解時(shí)間為2 h。

2.1.3 堿性蛋白酶酶量的確定

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶與底物1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。選取堿性蛋白酶與底物比為1∶100、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000加堿性蛋白酶溶液，55 ℃酶解4 h。考察堿性蛋白酶不 同酶量對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響。

圖3 堿性蛋白酶不同酶量對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的影響Fig.3 E ffect of different doses of alkaline protease on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

如圖3所示，隨著堿性蛋白酶酶量的增加，哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占比例顯著增加，當(dāng)堿性蛋白酶與底物比為1∶100時(shí)達(dá)到最大，為95.22%，表明堿性蛋白酶的用量對(duì)哈蟆油蛋白酶解影響較大，因此確定堿性蛋白酶與底物比為1∶100。

2.1.4 堿性蛋白酶酶解時(shí)間的確定

圖4 堿性蛋白酶不同酶解時(shí)間對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of different alkaline protease hydrolysis durations on the percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in hydrolysate

取10 mL哈蟆油蛋白溶液（5 mg/mL）5 份，按胃蛋白酶與底物1∶2 000加胃蛋白酶溶液，37 ℃酶解3 h。選取堿性蛋白酶與底物比1∶250加堿性蛋白酶溶液，55 ℃分別酶解2、3、4、5、6 h，考察堿性蛋白酶不同酶解時(shí)間對(duì)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響。

如圖4所示，哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占的比例隨著堿性蛋白酶酶解時(shí)間的增加呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到5 h以后，哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占比例的變化較小，因此選用堿性蛋白酶酶解時(shí)間為5 h。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇胃蛋白酶酶量（A）、胃蛋白酶酶解時(shí)間（B），堿性蛋白酶酶量（C）、堿性蛋白酶酶解時(shí)間（D）4 個(gè)因素，每個(gè)因素3 個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，以哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占比例為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)哈蟆油蛋白酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定正交試驗(yàn)的因素和水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表 1 正交試驗(yàn)的因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

表 2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results

表2表明，影響哈蟆油蛋白酶解的各因素主次順序?yàn)镃＞A＞D＞B；表3表明C因素（即堿性蛋白酶酶量）對(duì)哈蟆油蛋白酶解有顯著影響（P＜0.05），而A、B、D因素影響較?。≒＞0.05），因此優(yōu)選出最佳工藝條件為A2B1C3D3，即胃蛋白酶與底物比為1∶2 000，胃蛋白酶酶解時(shí)間為2 h，堿性蛋白酶與底物比為1∶100，堿性蛋白酶酶解時(shí)間為6 h。

表 3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取2.0 g左右哈蟆油3 份，按料液比1∶100加入pH 4.5的檸檬酸200 mL，浸泡36 h，勻漿后加入4 L蒸餾水，煎煮2 h，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH 2.0～3.0，按酶與底物比1∶2 000加入胃蛋白酶1.00 mg，37 ℃酶解2 h，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，調(diào)節(jié)pH值至9.0～10.0，按酶與底物比1∶100加入堿性蛋白酶20.00 mg，55 ℃酶解6 h，酶解后樣品煮沸15 min，使酶失活，調(diào)pH 6.8～7.2，0.22 ?m濾膜過(guò)濾，取樣400 ?L，注入高效液相色譜儀，記錄保留時(shí)間和峰面積百分比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線估測(cè)哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小。余下濾液凍干，取凍干粉按1.3.5節(jié)中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法測(cè)定哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)含量。

表 4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 4 Results of experimental verification

從表4可以看出，酶解條件為胃蛋白酶與底物比1∶2 000、酶解時(shí)間2 h、堿性蛋白酶與底物比1∶100、酶解時(shí)間6 h時(shí)，哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占的比例平均為94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)含量為49.85%。

3 結(jié) 論

胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法酶解哈蟆油蛋白，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，哈蟆油蛋白水解物的黏度呈下降趨勢(shì)[17]，這是由于哈蟆油中的黏蛋白被蛋白酶酶解成了小分子肽和低聚糖，破壞了側(cè)鏈糖基的親水性作用，使黏蛋白不能在分子周圍束縛大量的水，打破了含水微環(huán)境保護(hù)屏障[18-19]，從而降低溶液的黏度，實(shí)驗(yàn)中，哈蟆油水提液只能濃縮到1 g/200 mL，而酶解液則能濃縮至1 g/25 mL，酶解液澄清度好，溶解性好，達(dá)到了良好的酶解效果，哈蟆油這種性質(zhì)的改變，能夠改善哈蟆油的流動(dòng)性，使加工制備哈蟆油蛋白水解物產(chǎn)品更易進(jìn)行。同時(shí)，水解液中90%以上哈蟆油蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000，存在大量分子質(zhì)量大小不等的肽段，并且含有的多肽具有多種生物活性，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，哈蟆油非水溶性蛋白無(wú)耐缺氧作用，通過(guò)酶解法可以讓哈蟆油耐缺氧功效從無(wú)到有[20]，哈蟆油酶解物不僅有效的維持了哈蟆油原藥材具有的抗疲勞，降血脂功效，并且使耐缺氧和抗氧化等藥理作用進(jìn)一步增強(qiáng)，這為哈蟆油酶解工藝的合理性及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法制備哈蟆油蛋白多肽，制備工藝穩(wěn)定，哈蟆油蛋白提取率可達(dá)到80%以上，所得產(chǎn)品蛋白含量約為50%，產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，既能滿足人體對(duì)多肽的需要，又能加快哈蟆油產(chǎn)品深加工的發(fā)展，適合大規(guī)模生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)哈蟆油蛋白的酶解工藝進(jìn)行了研究，優(yōu)選出最佳酶解工藝條件為胃蛋白酶與底物比1∶2 000、胃蛋白酶酶解時(shí)間2 h、堿性蛋白酶與底物比1∶100、堿性蛋白酶酶解時(shí)間6 h，酶解得到哈蟆蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000所占的比例可達(dá)到 94.85%，哈蟆油蛋白中蛋白質(zhì)含量為49.85%。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)哈蟆油蛋白產(chǎn)品提供了參考依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典: 一部[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 239.

[2] 劉郁, 劉連新. 林蛙油的成分及藥理研究進(jìn)展[J]. 海峽藥學(xué), 2007, 19(12): 1-3.

[3] 毛煥新, 尤秀新, 程光惠, 等. 林蛙油軟膠囊抗疲勞作用的試驗(yàn)研究[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué), 2005, 31(6): 40-41.

[4] 曹玲, 李艷梅. 簡(jiǎn)述哈蟆油的藥理研究進(jìn)展[J]. 黑龍江醫(yī)藥, 2002, 15(5): 384.

[5] 吳運(yùn)明, 趙雨, 王思明, 等. 蛤蟆油水溶性總蛋白對(duì)小鼠耐缺氧及抗氧化能力的影響[J]. 食品科技, 2012, 37(4): 47-50.

[6] 衣春光, 李玉云, 張煒煜. 哈蟆油的免疫調(diào)節(jié)作用及其微球的制備工藝[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 37(4): 665-669.

[7] 楊士慧, 趙雨, 張梅, 等. 哈蟆油非水溶性成分酶解物藥理活性研究[J].食品科技, 2012, 37(4): 44-46.

[8] 包玉曉. 林蛙油化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2009, 28(3): 37-38.

[9] 李洪波, 劉玉翠. 名貴藥材哈蟆油化學(xué)成分的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J]. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 23(3): 290-292.

[10] BU Xiaodong, LI Nan, TIAN Xiaoqiang, et al. Altered expression of MUC2 and MUC5AC in progression of colorectal carcinoma[J]. World Journal of Gastroenterology, 2010, 16(32): 4089-4094.

[11] JI Yuan, TAN Yunshan, XU Jianfang, et al. Mucins in the diagnosis and differential diagnosis of pancreatic cystic neoplasms: report of 40 cases[J]. Chinese Medical Journal, 2006, 119(9): 765-768.

[12] ZHANG Mei, LI Yuntong, YAO Baojin, et al. Transcriptome sequencing and de novo analysis for Oviductus Ranae of Rana chensinensis using illumina RNA-Seq technology[J]. Journal of Genetics and Genomics, 2013, 40(3): 137-140.

[13] 張梅. 哈蟆油酶解物制備工藝及藥理活性研究[D]. 長(zhǎng)春: 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué), 2011.

[14] 張梅, 趙雨, 李蕓彤, 等. 影響哈蟆油黏度的主要因素探究[J]. 食品科技, 2010, 35(12): 93-95.

[15] 王萍, 楊春瑜, 殷麗君. 林蛙油的成分及開(kāi)發(fā)利用前景[J]. 國(guó)土與自然資源研究, 1999(2): 69-73.

[16] GB 5009. 5—2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[17] 王冰, 葉懷義. 木瓜蛋白酶作用于林蛙油蛋白質(zhì)水解功能特性的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(5): 62-65.

[18] SINGH P K, HOLLINGSWORTH M A. Cell surface-associated mucins in signal transduction[J]. Trends in Cell Biology, 2006, 16(9): 467-476.

[19] HATTRUP C L, GENDLER S J. Structure and function of the cell surface (tethered) mucins[J]. Annual Review of Physiology, 2008, 70: 431-457.

[20] 張梅, 趙雨, 楊士慧, 等. 哈蟆油酶解前后耐缺氧活性比較研究[J].江蘇中醫(yī)藥, 2011, 43(6): 87-88.

Optimization of Two-Step Enzymatic Hydrolysis of Oviductus Ranae Protein by Orthogonal Array Design

DONG Ying, ZHANG He, ZHOU Guang-xin, ZHAO Da-qing*, ZHAO Yu, CONG De-yu
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Objective: To optimize the two-step enzymatic hydrolysis of Oviductus Ranae protein. Methods: Oviductus Ranae protein was extracted by soaking in citric acid, homogenizing Oviductus Ranae and then decoting the homogenate with water, and sequentially hydrolyzed with pepsin and alkaline protease. Various hydrolysis parameters were optimized by single factor and orthogonal array design methods to obtain maximum perce ntage of peptides with molecular weight less than 5 000. Results: The optimum hydrolysis conditions were obtained as follows: pepsin hydrolysis at an enzyme/substrate ratio of 1:2 000 (m/m) for 2 h followed by alkaline protease hydrolysis at an enzyme/substrate ratio of 1:100 (m/m) for 6 h. The percentage of peptides with molecular weight less than 5 000 in the hydrolysate obtained under these conditions was as high as 94.85%, and the protein content of the hydrolysate was 49.85%. Conclusion: The combined use of pepsin and alkaline protease can effectively decompose Oviductus Ranae protein for better absorption by the body.

Oviductus Ranae protein; pepsin; alkaline protease; double enzyme method

R284.2

A

1002-6630（2014）06-0036-04

10.7506/spkx1002-6630-201406007

2013-06-21

“重大新藥創(chuàng)制”重大科技專項(xiàng)（2011ZX09401-305-09）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 （YYZX201126）

董穎（1988—），女，碩士研究生，主要從事中藥有效成分研究。E-mail：dong571124939@163.com

*通信作者：趙大慶（1963—），男，教授，博士，主要從事中藥有效成分研究。E-mail：13843148162@163.com