李曉玲，朱旅云，宋光耀，邢邯英，劉素蕊，王 超

腺病毒介導血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細胞的實驗研究

李曉玲，朱旅云，宋光耀，邢邯英，劉素蕊，王 超

目的探討腺病毒載體介導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細胞(UCMSCs)的可行性，以及VEGF轉(zhuǎn)染對UCMSCs功能的影響。方法 構(gòu)建VEGF165-EGFP基因重組腺病毒載體，分離和培養(yǎng)UCMSCs，攜增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒載體轉(zhuǎn)染UCMSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效果，流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染率，確定最佳病毒感染復數(shù)(MOI)。將細胞分為VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP空載組及對照組3組，依據(jù)最佳MOI值轉(zhuǎn)染并收集細胞，采用蛋白印跡法(Western blotting)檢測VEGF及Akt表達變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測VEGF蛋白表達情況。采用CCK-8法評價轉(zhuǎn)染對UCMSCs增殖的影響。結(jié)果 腺病毒介導的VEGF165-EGFP基因能夠成功轉(zhuǎn)染UCMSCs，且VEGF基因在細胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄和表達，并能分泌到細胞外。轉(zhuǎn)染后48 h VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組VEGF、Akt水平顯著高于EGFP空載組和對照組(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后48 h采用ELISA法在VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清中即檢測到VEGF的表達和分泌，在轉(zhuǎn)染后第4天達到高峰，且VEGF表達顯著高于EGFP空載組及對照組(P＜0.01)，以后逐漸下降，并穩(wěn)定表達一定時間。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，介導VEGF基因轉(zhuǎn)染的腺病毒對UCMSCs增殖無明顯影響。結(jié)論 腺病毒介導VEGF基因能夠成功轉(zhuǎn)染UCMSCs，保持其原有生物學特性，并能持續(xù)高效表達VEGF，為通過VEGF基因聯(lián)合UCMSCs治療獲得糖尿病下肢血液循環(huán)重建的可行性提供理論依據(jù)。

血管內(nèi)皮生長因子類;臍帶間質(zhì)干細胞;腺病毒載體;轉(zhuǎn)染

研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能加速側(cè)支循環(huán)的建立，在血管新生中起關(guān)鍵作用，但由于VEGF屬多肽類生長因子，在體內(nèi)半衰期短，提純較為困難，不適合作為藥物直接用于臨床。高增殖潛能和定向歸巢特性使臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSCs)成為促進血管新生和基因治療缺血性疾病的理想靶細胞和種子細胞，在體細胞轉(zhuǎn)染目的基因治療中的作用越來越受到關(guān)注。本研究利用基因工程擬選擇分泌型hVEGF-165作為轉(zhuǎn)入基因，攜增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluores centprotein，EGFP)構(gòu)建質(zhì)粒，通過腺病毒轉(zhuǎn)染到UCMSCs細胞中，觀察轉(zhuǎn)染后UCMSCs理化特性、VEGF基因表達及對生長增殖的影響，為下一步研究UCMSCs聯(lián)合VEGF基因治療下肢缺血性病變的可行性及作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 EGFP及VEGF165基因重組腺病毒(病毒滴度1．57×1010pfu/ml)由廣州賽生生物公司提供;DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國HYClone公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;胰蛋白酶/EDTA消化液購自美國HYClone公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，DMSO購自德國WAK-CHEMIE公司;ELISA VEGF試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司，批號:ZDZIBZAB01)，蛋白激酶B(Akt)多克隆抗體購自Abcam公司。酶標儀(Rayto RT-6100);Epics XL流式細胞儀購自美國BECKMAN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離和培養(yǎng)UCMSCs:無菌條件下取足月妊娠分娩胎兒的臍帶(家屬簽署知情同意書)，用生理鹽水洗滌去除血液。將臍帶剪切成1～2 cm大小的片段，剔除血管(1條臍靜脈、2條臍動脈)避免內(nèi)皮細胞污染。取出其中的華通膠剪碎，大小約1 mm3，將組織塊置于培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100 U/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周后首次換液，此后3～4 d換液1次。待細胞長至80%～90%融合時用胰蛋白酶/EDTA消化液消化傳代，顯微鏡下控制消化時間。

1.2.2 EGFP轉(zhuǎn)染UCMSCs轉(zhuǎn)染率測定:選取第3代UCMSCs接種于6孔培養(yǎng)板，單層培養(yǎng)達80%融合時，將培養(yǎng)液更換為α-MEM無血清培養(yǎng)基，按病毒感染復數(shù)(multiplicities of infection，MOI)分別為0、100、200、300、400、500，每個MOI值條件設(shè)3 個復孔，轉(zhuǎn)染6 h后，將培養(yǎng)液更換為DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)，置入5%CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24、48 h在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞EGFP的表達情況。以0．25%胰蛋白酶－乙二胺四乙酸(EDTA)消化收集細胞，用DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞1次(PBS離心洗滌3次)，重懸于20 g/L多聚甲醛中，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染細胞比例，確定最佳MOI值。

1.2.3 UCMSCs轉(zhuǎn)染后VEGF基因及其下游基因表達情況的檢測:將細胞分為VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP空載組和對照組3組。單層培養(yǎng)達80%融合時，依次加入純化的VEGF-EGFP和EGFP基因重組腺病毒液，對照組以不含血清的DMEM培養(yǎng)基代替腺病毒液。①蛋白印跡法(Western blotting)鑒定VEGF、Akt的表達:最佳MOI值及過表達效果最好的時間點確定后，按條件轉(zhuǎn)染并收集細胞。分別提取細胞的RNA和總蛋白，用實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和Western blotting檢測VEGF的表達量及下游靶基因AktmRNA水平變化。②ELISA法測定培養(yǎng)上清中VEGF的含量:分別在VEGF-EGFP基因轉(zhuǎn)染 UCMSCs后第2、4、7、10、13 天提取細胞培養(yǎng)上清液進行VEGF的ELISA檢測(按照試劑盒說明書操作)，在檢測波長為450 nm、校正波長570 nm酶聯(lián)儀上讀取吸光度值，根據(jù)標準品測定結(jié)果，計算被檢測細胞培養(yǎng)上清液內(nèi)VEGF含量。

1.3 采用CCK-8法檢測VEGF轉(zhuǎn)染后對UCMSCs細胞增殖的影響 按上述最佳MOI轉(zhuǎn)染細胞后24、48、96 h消化并收集細胞。接種于96孔板中，每組均設(shè)6個復孔。孵育過夜，按照CCK-8試劑盒流程處理細胞。選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 18．0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s)表示，采用方差分析，α=0．05為檢驗水準。

2 結(jié)果

圖1 腺病毒介導增強型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細胞后24、48 h倒置熒光顯微鏡下細胞形態(tài)(×100)

2.1 EGFP轉(zhuǎn)染UCMSCs轉(zhuǎn)染率測定 細胞在轉(zhuǎn)染后24 h，熒光顯微鏡下不能很明顯地看到綠色熒光，轉(zhuǎn)染48 h后則可在熒光顯微鏡下觀察到強烈的綠色熒光，見圖1。

流式細胞儀檢測結(jié)果:在MOI為100、200、400、500 條件下，轉(zhuǎn)染率分別為 48．2%、69．0%、76．1%、91．7%、94．0%，在 MOI為 400時，轉(zhuǎn)染率趨于穩(wěn)定，并保持在90%以上，當MOI＞400時，轉(zhuǎn)染率不再增加，細胞出現(xiàn)變圓、脫落，熒光碎片數(shù)量增多。故確定最佳MOI值為400。見圖2。

圖2 不同病毒感染復數(shù)條件下腺病毒介導增強型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細胞后轉(zhuǎn)染率

2.2 轉(zhuǎn)染UCMSCs后VEGF基因及其下游基因表達情況

2.2.1 Western blotting檢測 VEGF、Akt的表達:腺病毒介導VEGF轉(zhuǎn)染UCMSCs 48 h，VEGF、Akt在各組中均有表達，但表達量不同。VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組VEGF表達(1．71±0．13)顯著高于 EGFP 空載組(1．02 ±0．11)及對照組(0．96 ±0．08)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組Akt表達(1．64 ±0．12)顯著高于 EGFP 空載組(1．07 ±0.09)及對照組(0．89±0．07)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而EGFP空載組與對照組VEGF、Akt表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖3。

2.2.2 ELISA法檢測VEGF的表達:在轉(zhuǎn)染后第2、4、7、10、13天采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中VEGF含量，隨著時間延長VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組的含量均顯著高于對照組和 EGFP空載組(P＜0.01)。VEGF轉(zhuǎn)染2 d后UCMSCs培養(yǎng)上清液中VEGF水平顯著增加，并在轉(zhuǎn)染后第4天達到頂峰，持續(xù)到第13天仍有較高水平表達。見表1。

圖3 蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細胞后3組VEGF、Akt表達

表1 ELISA檢測3組轉(zhuǎn)染UCMSCs后VEGF表達(±s)

表1 ELISA檢測3組轉(zhuǎn)染UCMSCs后VEGF表達(±s)

注:ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗，VEGF:血管內(nèi)皮生長因子，EGFP:增強型綠色熒光蛋白;VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP空載組加入VEGFEGFP和EGFP基因重組腺病毒液，對照組加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基;與 EGFP空載組比較，b P＜0.01;與對照組比較，a P＜0.05，d P ＜0.01

培養(yǎng)時間(d)VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組EGFP空載組 對照組2 2．03 ±0．06bd 0．24 ±0．02 0．29 ±0．02 0．26 ±0．03 0．25 ±0．04 4 2．46 ±0．02bd 1．05 ±0．04a 0．27 ±0．03 7 2．44 ±0．02bd 0．99 ±0．03a 0．32 ±0．08 10 2．42 ±0．03bd 0．47 ±0．02 0．41 ±0．12 13 2．23 ±0．03bd

2.3 CCK-8比色法檢測轉(zhuǎn)染對UCMSCs增殖的影響 在轉(zhuǎn)染VEGF 24、48、96 h后CCK-8法檢測結(jié)果顯示，3組 UCMSCs比較差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表2。

3 討論

對血液循環(huán)的重建而言，目前已知多種生長因子和細胞因子具有促進血管生成即血管化作用，其中VEGF被認為是機體內(nèi)最強的促血管生長因子，研究證實VEGF可特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，顯著促進新生血管的形成，在動物實驗及臨床應(yīng)用中顯示了良好的效果［1］。但單純VEGF作用下形成的血管僅由血管內(nèi)皮細胞組成，其結(jié)構(gòu)不夠完整，通透性高，在局部形成不同程度的水腫，而新生血管的不穩(wěn)定性也可能影響到該方法的遠期療效，因此，有必要對VEGF治療血管生成進行更深入的研究。骨髓干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)具有多向分化潛能、容易在體外擴增和可自體移植的特性，移植BMSCs重建肢體血管的可行性和有效性近年來已得到大量實驗及臨床證實［2-5］，但采集BMSCs風險較大，對患者年齡、身體條件、心理接受程度要求較高。糖尿病患者干細胞移植后向血管內(nèi)皮祖細胞分化能力下降，其增殖、黏附和參與血管形成能力都降低，機體不能為移植的細胞提供滿意的增殖分化環(huán)境等問題，導致臨床療效降低，UCMSCs與BMSCs在生物學特性方面極為相似，而且來源更廣泛，采集方便，擴增能力更強，免疫原性弱，具有更加有效的干細胞潛能，是治療缺血性疾病更為良好的種子細胞和轉(zhuǎn)基因載體細胞［6-8］。UCMSCs具有多向分化潛能，需要在適宜誘導因子作用下才能向血管內(nèi)皮細胞分化，可作為基因治療的受體細胞。為使誘導因子能持續(xù)高效發(fā)揮作用，利用分子組織工程學技術(shù)，將具有多重生物學效應(yīng)及促血管新生最強因子VEGF基因轉(zhuǎn)入UCMSCs，通過轉(zhuǎn)基因干細胞在缺血局部持續(xù)表達高生物學活性的內(nèi)源性VEGF以促進其向血管內(nèi)皮分化，從而減少外源性誘導因子大劑量使用導致的不良反應(yīng)，提高促血管新生及修復效果。

表2 CCK-8比色法檢測轉(zhuǎn)染對UCMSCs增殖的影響(±s)

表2 CCK-8比色法檢測轉(zhuǎn)染對UCMSCs增殖的影響(±s)

注:UCMSCs:臍帶間充質(zhì)干細胞，VEGF:血管內(nèi)皮生長因子，EGFP:增強型綠色熒光蛋白;VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP空載組分別加入VEGF-EGFP和EGFP基因重組腺病毒液，對照組加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基

培養(yǎng)時間(h)VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染組 EGFP 空載組 對照組24 0．47 ±0．02 0．42 ±0．02 0．45 ±0．04 48 0．66 ±0．03 0．70 ±0．03 0．64 ±0．12 96 1．37 ±0．06 1．13 ±0．08 1．46 ±0．05

基因治療需要合適的載體，目前被研究應(yīng)用最多的是腺病毒載體，有實驗證實重組腺病毒Ad-VEGF165滴度高、毒性低、轉(zhuǎn)染效率高、體外轉(zhuǎn)染安全［9-10］。

本實驗選擇分泌型VEGF作為轉(zhuǎn)入基因，攜EGFP構(gòu)建質(zhì)粒，通過腺病毒感染UCMSCs后能夠同時穩(wěn)定表達EGFP和VEGF兩種外源性基因，仍保持其原有分化特征，同時利用EGFP基因示蹤可以充分了解融合基因的特征、理化特性及移植細胞在體內(nèi)的功能和分泌，方便目的基因的表達鑒定及定位追蹤［11］。本研究觀察到用EGFP轉(zhuǎn)染UCMSCs后在熒光顯微鏡下觀察細胞在轉(zhuǎn)染后的24 h即有EGFP的表達，48 h達到高峰，以后逐漸減弱，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化。流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)MOI為400是較為合適的轉(zhuǎn)染倍數(shù)，可以獲得比較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染率，對細胞的形態(tài)和增殖沒有影響，而且也不影響UCMSCs的血管分化能力［12］。CCK-8比色法檢測VEGF-EGFP轉(zhuǎn)染對UCMSCs增殖無影響。研究結(jié)果表明UCMSCs對于腺病毒是易感細胞［13］，VEGF165基因表達載體可有效轉(zhuǎn)染UCMSCs，并在體外高效表達而不影響細胞生長，通過 Western blotting和ELISA檢測顯示，轉(zhuǎn)染了VEGF基因的UCMSCs可以穩(wěn)定表達外源性VEGF，轉(zhuǎn)染2 d后培養(yǎng)上清液中已經(jīng)開始有VEGF的產(chǎn)生，且顯著高于對照組，到第4天時達到高峰，且能維持在一定水平的VEGF表達，至轉(zhuǎn)染后第13天分泌的VEGF能夠促進UCMSCs的增殖［14］。Akt在調(diào)節(jié)細胞存活和凋亡過程中起重要作用，激活Akt可以上調(diào)Bcl2和VEGF表達及促進細胞Akt磷酸化來抑制間質(zhì)干細胞(MSCs)的凋亡作用，提高 MSCs的存活率［15-16］。本實驗觀察到過表達VEGF的UCMSCs中Akt呈現(xiàn)出更高的水平，而Akt作為抗凋亡蛋白之一，其高水平可明顯提高UCMSCs的存活能力。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGF基因的UCMSCs能使細胞獲得局部持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達VEGF蛋白的能力，同時轉(zhuǎn)染EGFP基因?qū)崿F(xiàn)目的基因VEGF在體內(nèi)外表達的示蹤定位，了解轉(zhuǎn)染后UCMSCs功能及分化、移植定位等;通過上調(diào)Akt信號通路等提高MSCs的抗凋亡能力，促進MSCs移植后的“歸巢”及內(nèi)皮修復。

總之，采用UCMSCs作為VEGF基因治療的平臺，通過有效目的基因轉(zhuǎn)染入靶細胞，可持續(xù)高效表達高生物學活性的內(nèi)源性VEGF以促進其向血管內(nèi)皮分化，減少UCMSCs的凋亡，為VEGF基因聯(lián)合UCMSCs治療獲得糖尿病下肢血液循環(huán)重建的可行性提供有力理論依據(jù)［17-21］。

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Transfection of Adenovirus-mediated Vascular Endothelial Grow th Factor into Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Vitro

LIXiao-ling1a，ZHU Lyu-yun1a，SONGGuang-yao2，XINGHan-ying2，LIU Su-rui1b，WANG Chao2(1．Bethune International Peace Hospital of PLA，a，Department of Endocrinology，b．Department of Blood Bank，Shijiazhuang 050082，China;2．Department of Endocrinology，People＇s Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China)

ObjectiveTo investigate the feasibility of transfection of adenovirus-mediated vector vascular endothelial growth factor(VEGF)into umbilical cordmesenchymal stem cells(UCMSCs)and the effectof VEGF transfection on UCMSCs function．MethodsVEGF165-EGFP genetic recombination of adenovirus vectors were constructed，and UCMSCs were isolated and cultured，and then adenovirus vector-enhanced green fluorescent protein(EGFP)transfected UCMSCs．The transfection effectwas observed under inverted fluorescencemicroscope，and transfection effectivenesswas detected by flow cytometer so to confirm the bestmultiplicity of infection(MOI)．Cells were divided into VEGF-EGFP transfection group，EGFP group and control group，and the cellswere transfected and collected based on the best MOI．Expressions of VEGF and protein kinase B(PKB also named Akt)signaling protein were detected by Western blotting;the expression of VEGF proteinwas detected by enzyme linked immunosorbentassay(ELISA)．The proliferation effectof transfected UCMSCswas evaluated with CCK 8 method．ResultsAdenovirus-mediated VEGF165-EGFP gene successfully transfected UCMSCs，and VEGF gene was transcribed and expressed in cells，and then was secreted out of cells．Levels of VEGF and Akt transfection secretion in VEGF-EGFP group 48 hours after transfection were significantly higher than those in EGFP group and control group;the expression and secretion of VEGF could be detected in VEGF-EGFP transfection group by ELISA 48 hours after transfection，and the peak appeared 4thd after transfection，at the same time the expressions in VEGF group were significantly higher than those in EGFP group and control group(P＜0.01)，and then the levels gradually decreased，butcanmaintain stable expression for severaldays．ResultsofCCK 8method showed that VEGF gene transfection had no significant effect on the UCMSCs proliferation．ConclusionAdenovirus-mediated VEGF-EGFP genemay successfully transfect UCMSCs，maintain UCMSCs original biological characteristics，and significantly and efficiently express VEGF，which can provide theoretical basis for the feasibility of VEGF gene combined with UCMSCs in treatment of diabetic lower limb blood circulation reconstruction．

Vascular endothelial growth factor;Umbilical cord mesenchymal stem cell;Adenovirus vector;Transfection

R349．8

A

2095-140X(2014)05-0005-05

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．002

河北省自然科學基金課題(H2013505067)

050082石家莊，解放軍白求恩國際和平醫(yī)院內(nèi)分泌科(李曉玲、朱旅云)，輸血科(劉素蕊);050000石家莊，河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科(宋光耀、邢邯英、王超)

2014-02-20 修回時間:2014-03-16)

·論著·