郭啟雷，潘紅艷，史海良，楊紅梅，王 浩（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

加壓毛細(xì)管電色譜測(cè)定糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯

郭啟雷，潘紅艷，史海良，楊紅梅，王 浩
（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

建立了利用加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）測(cè)定糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯（DMF）的分析方法。樣品采用甲醇超聲提取，提取液經(jīng)反相毛細(xì)管電色譜柱分離，流動(dòng)相乙腈-水（3∶7，v/v），泵流速0.05mL/min，分離電壓-5kV，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。該方法在2.0～100mg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.9998），定量限為20mg/kg，加標(biāo)回收率為85.5%～93.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，準(zhǔn)確可靠，為糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯的檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。

加壓毛細(xì)管電色譜，糕點(diǎn)，富馬酸二甲酯

富馬酸二甲酯（Dimethyl Fumarate，DMF）為白色晶體，易溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙腈和醇類[1]。DMF是二十世紀(jì)八十年代開發(fā)的廣譜高效防腐劑，對(duì)近40種真菌和細(xì)菌有較高的抑殺活性[2-3]，與苯甲酸、山梨酸和丙酸鈣不同，其抑菌活性受pH影響小，在pH3.0～8.0范圍內(nèi)對(duì)各種霉菌均有良好的抑制作用，曾用于食品、飼料、日用工業(yè)品的防霉防腐及水果保鮮[1，4]。但近年來(lái)的研究表明，DMF被人體皮膚吸收，會(huì)引起發(fā)癢、發(fā)紅和灼傷等癥狀，DMF經(jīng)消化道進(jìn)入人體，會(huì)引起咽喉腫痛、腹痛等癥狀，此外，DMF進(jìn)入人體會(huì)分解為富馬酸和有毒物質(zhì)甲醇，長(zhǎng)期食用對(duì)肝、腎有很大的副作用，尤其是對(duì)兒童的成長(zhǎng)發(fā)育危害很大[1-2]。因此，2009年2月，衛(wèi)生部將DMF列入第二批食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單中，明確DMF不得作為食品添加劑使用。但是，由于其防霉效果好且抑菌活性受pH影響小，一些不法經(jīng)營(yíng)者受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)，仍違法將DMF用于食品的防腐。因此建立食品中DMF的簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法非常必要。目前，文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于食品中DMF的檢測(cè)方法主要有液相色譜法（HPLC）[5-7]、氣相色譜法（GC）[8]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[9]。

毛細(xì)管電色譜（Capillary Electro-Chromatography，CEC）是將毛細(xì)管柱內(nèi)填充或鍵合固定相，以電滲流為驅(qū)動(dòng)力，結(jié)合了微徑高效液相色譜與毛細(xì)管電泳兩者的特點(diǎn)，具有高柱效、快速分離、高選擇性、高精度以及試劑和樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，但單純的CEC模式易產(chǎn)生氣泡、干柱等問(wèn)題[10]。而加壓毛細(xì)管電色譜（Pressurized Capillary Electro-Chromatography，pCEC）通過(guò)微型液相色譜泵在毛細(xì)管電色譜柱一端施加壓力，壓力的引入使CEC分離過(guò)程受pH和緩沖液的限制相對(duì)減少，可有效地解決CEC的氣泡問(wèn)題，且能實(shí)現(xiàn)梯度洗脫；用電滲流和泵壓同時(shí)驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，溶質(zhì)依據(jù)它們?cè)诹鲃?dòng)相與固定相中分配系數(shù)的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，對(duì)復(fù)雜樣品顯示出極大的分離能力[11]。pCEC技術(shù)近年來(lái)開始應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域[11-14]，本研究建立了應(yīng)用pCEC分析糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯的新方法，操作簡(jiǎn)單、快速，準(zhǔn)確可靠，為食品中非食用物質(zhì)檢測(cè)提供了新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈 美國(guó)Fisher公司，色譜純；富馬酸二甲酯（99.0%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

加壓毛細(xì)管電色譜儀 TriSepTM-2100（Unimicro Technologies，Inc.，Pleasanton，CA，USA），包括2臺(tái)高壓輸液泵、±30kV高壓電源、微流控制系統(tǒng)、紫外檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli-Q純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；電子天平（感量0.0001g、0.01g） 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HY-5回旋振蕩器 國(guó)華電器有限公司；超聲波清洗器KQ5200 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pCEC條件 毛細(xì)管電色譜柱EP-100-20/45-3-C18（蘇州環(huán)球色譜有限公司），內(nèi)徑100μm，有效柱長(zhǎng)20cm，總長(zhǎng)45cm，填料為粒徑3μm ODS，流動(dòng)相：乙腈∶水=30∶70，流速：0.05mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，電壓-5kV。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取0.1g（精確至0.0001g）富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，配制成1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后用甲醇逐級(jí)稀釋成2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)0.22μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后進(jìn)加壓毛細(xì)管電色譜儀測(cè)定，峰面積對(duì)濃度作圖。

1.2.3 樣品處理 稱取粉碎樣品5g（精確至0.01g）于50mL具塞三角燒瓶中，加入30mL甲醇，超聲提取10min，上清液收集到50mL容量瓶中，殘?jiān)尤爰状?5mL，振蕩提取15min，合并提取液于50mL容量瓶中，甲醇清洗殘?jiān)⒍ㄈ葜量潭?，混勻后取提取液過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜，供pCEC測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相中有機(jī)相條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相中有機(jī)相的組成和比例對(duì)DMF色譜分離的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)均能得到很好的分離效果，其中后者的柱壓較低，故采用乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相。如圖1所示，隨著流動(dòng)相中乙腈比例增加，DMF的保留時(shí)間越來(lái)越短，分析速度加快，同時(shí)色譜峰的峰寬越來(lái)越小，綜合考慮色譜分離的周期和實(shí)際樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，最后選擇流動(dòng)相為乙腈∶水（3∶7，v/v）的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行色譜分離。

圖1 流動(dòng)相中有機(jī)相比例對(duì)pCEC分離DMF的影響Fig.1 Effect of the concentration of acetonitrile in mobile phase on the pCEC separation of DMF

2.2 施加電壓的研究

實(shí)驗(yàn)考察了施加不同的電壓對(duì)DMF色譜行為的影響。從圖2中可以看出，施加正電壓可以使DMF的保留時(shí)間延長(zhǎng)，正電壓越高，保留時(shí)間越長(zhǎng)，但同時(shí)峰形變差，色譜峰展寬同時(shí)開始拖尾。而施加負(fù)電壓則正好相反，負(fù)電壓越大，保留時(shí)間越短，峰寬越小，同時(shí)色譜死時(shí)間也在縮短。綜合考慮分離度和分析時(shí)間，選擇-5kV為分析條件。

文獻(xiàn)多采用含有四丁基溴化銨的緩沖溶液作為流動(dòng)相中的水相，系統(tǒng)配制復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)建立的以pCEC為分析平臺(tái)，在-5kV的電壓下，以乙腈∶水（3∶7，v/v）為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)了樣品中DMF的良好分離。同時(shí)，對(duì)于陽(yáng)性樣品，可以通過(guò)在-20～+10kV范圍內(nèi)改變電壓，觀察樣品峰與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間符合程度來(lái)進(jìn)一步判斷樣品中是否含有DMF，相較普通液相色譜來(lái)說(shuō)，增加了定性的準(zhǔn)確性。

圖2 DMF在不同電壓下的pCEC色譜圖Fig.2 Effect of applied voltage on the pCEC separation of DMF

2.3 提取條件的選擇

DMF易溶于乙酸乙酯和醇類溶劑，所以文獻(xiàn)中常用乙酸乙酯和甲醇作為提取溶劑，其中氣質(zhì)聯(lián)用法常用乙酸乙酯[8-9，15]，液相色譜法常采用甲醇[1，5，16]。本文基于液相色譜的基本原理，選用甲醇作為提取溶劑，取得了良好的結(jié)果，空白樣品和樣品加標(biāo)色譜圖見圖3。對(duì)于pCEC來(lái)說(shuō)，被分析組分的遷移速度取決于三個(gè)方面，一是電滲流速率，由于-5kV的電壓是加載在出口端，帶正電的電滲流方向是從色譜柱的入口端到出口端；二是電泳速率，在外加電場(chǎng)作用下，各分析組分根據(jù)各自所帶電荷的不同、自身分子的大小等因素而具有不同的電泳方向和速率；三是微型液相色譜泵提供的流動(dòng)相流速。在三個(gè)驅(qū)動(dòng)力的綜合作用下，DMF與食品的基質(zhì)成分得到了很好分離，從圖3可以看出，本實(shí)驗(yàn)建立的儀器條件和前處理方法對(duì)DMF的測(cè)定沒(méi)有干擾，確保了定性、定量的準(zhǔn)確性。

圖3 不同樣品的空白基質(zhì)和基質(zhì)加標(biāo)pCEC色譜圖Fig.3 pCEC chromatograms of blank sample and spiked sample with DMF

2.4 檢出限、線性范圍和回收率

在空白樣品中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，用pCEC測(cè)定，以10倍信噪比計(jì)算本方法的定量限為20mg/kg。按照1.2.2制備系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按濃度由低到高依次經(jīng)加壓毛細(xì)管電色譜儀測(cè)定，峰面積對(duì)濃度作圖，得到DMF的線性方程A=126.83C+3.90，r2=0.9998，線性范圍2～100mg/kg。采用經(jīng)測(cè)定不含有DMF的3種樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度為20、50、100mg/kg，按本文實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，用pCEC進(jìn)樣測(cè)定。平均添加回收率（每個(gè)添加濃度平行測(cè)定5次）為85.5%～93.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，結(jié)果見表1。采用本方法對(duì)市場(chǎng)上的30例糕點(diǎn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品，表明目前對(duì)富馬酸二甲酯的濫用得到了有效控制。

表1 3種樣品中DMF的回收率和精密度Table 1 Recovery and repeatability of DMF

3 結(jié)論

以非食用物質(zhì)富馬酸二甲酯（DMF）為研究對(duì)象，選取糕點(diǎn)食品基質(zhì)，樣品采用甲醇超聲提取，提取液采用反相毛細(xì)管電色譜柱分離，泵流速0.05mL/min，分離電壓-5kV，流動(dòng)相乙腈∶水（3∶7，v/v）等度洗脫。該方法在2～100mg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r2=0.9998），定量限為20mg/kg，加標(biāo)回收率為85.5%～93.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。目前文獻(xiàn)中液相色譜法的流動(dòng)相配制較為復(fù)雜[6-7]，水相采用乙酸鈉、四丁基溴化銨緩沖液配制，冰乙酸調(diào)節(jié)pH，有機(jī)相選用甲醇或乙腈。本文采用簡(jiǎn)單的流動(dòng)相組成（乙腈-水系統(tǒng)），就實(shí)現(xiàn)了DMF與基質(zhì)成分的良好分離，同時(shí)與高效液相色譜和超高效液相色譜相比，pCEC采用0.05mL/min的流速極大地減少了有機(jī)溶劑的使用，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。另外，相較普通高效液相色譜來(lái)說(shuō)，pCEC可以通過(guò)施加不同的電壓進(jìn)一步判斷樣品中是否含有DMF，在不采用GC-MS等昂貴儀器設(shè)備的情況下，同樣可以增加定性的準(zhǔn)確性。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，準(zhǔn)確可靠，為糕點(diǎn)中富馬酸二甲酯的檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。

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Determination of dimethyl fumarate in pastry by pressurized capillary electro-chromatography

GUO Qi-lei，PAN Hong-yan，SHI Hai-liang，YANG Hong-mei，WANG Hao
（National Food Quality＆Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

An effective and convenient method for determination of dimethyl fumarate（DMF）in pastry by pressurized capillary electro-chromatography（pCEC）with ultra-violet detection was developed.The samples were extracted with methanol.The separation was performed on a reversed phase C18column in an isocratic mode with 220nm as the UV detection wavelength.The effects of ratio of organic phase and separation voltage on separation efficiency were optimized.The mobile phase was composed of acetonitrile and water（3∶7，v/v），at a pump flow rate of 0.05mL/min.Under the optimal conditions，the linear range of DMF was 2.0～100mg/kg with correlation coefficient higher than 0.9998.The mean recoveries were 85.5%～93.6%and the relative standard deviations（RSD）were less than 5%.

pressurized capillary electro-chromatography；pastry；dimethyl fumarate

TS207.3

A

1002-0306（2014）14-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.006

2013-11-11

郭啟雷（1979-），男，博士，研究員，研究方向：食品安全。

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Z111100056811006）。