劉 津，陳源樹，凌 莉，李志勇，張 璜，高東微，*（.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州5063；.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東廣州50663）

食品過敏原巴西堅果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立與應(yīng)用

劉 津1，陳源樹1，凌 莉1，李志勇1，張 璜2，高東微1，*
（1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州510623；2.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東廣州510663）

根據(jù)巴西堅果2S白蛋白基因序列，利用設(shè)計軟件Primer Explorer Version 4設(shè)計并篩選了食品過敏原巴西堅果的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物，對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了巴西堅果的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法，結(jié)果判斷可采用實時熒光法和熒光染料終點顯色法。以澳洲堅果、開心果、碧根果等17種常見堅果來驗證方法的特異性；將巴西堅果DNA進(jìn)行梯度稀釋后驗證方法的靈敏度；將0.5%、1%和1.5%3個濃度梯度的巴西堅果DNA重復(fù)檢測20次來驗證方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，本方法能夠特異、靈敏、穩(wěn)定地檢測食品中的巴西堅果成分，檢測低限為0.5%。此外，對7種市售食品樣品的檢測結(jié)果表明，該方法與食品標(biāo)簽標(biāo)示的過敏原成分結(jié)果吻合率為100%，假陽性率和假陰性率均為0%。

食品過敏原，巴西堅果，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增，檢測方法

巴西堅果（Bertholletia excelsa）又名巴西栗，是玉蕊科巴西栗屬的植物。巴西堅果外形特別像鮑魚，所以商品名叫鮑魚果。巴西堅果營養(yǎng)豐富，是常見的、廣泛食用的樹生堅果[1-2]。巴西堅果引起的過敏癥狀包括咽癢、唇腫、發(fā)聲困難、呼吸困難、哮喘、黃斑疹等[3]，因此巴西堅果屬于食品過敏原標(biāo)識管理的重要種類。國際食品法典委員會制定的國際標(biāo)準(zhǔn)CODEX STAN 1-1985《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》明確規(guī)定了包括巴西堅果在內(nèi)的多種樹生堅果及其產(chǎn)品必須在預(yù)包裝食品標(biāo)簽上予以聲明[4]。在國際標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，世界各國紛紛頒布了各自的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，對巴西堅果這種過敏原成分的標(biāo)識管理進(jìn)行了詳細(xì)的規(guī)定。歐盟委員會指令2007/68/EC和美國《食品過敏原標(biāo)識和消費者保護(hù)法案》（The Food Allergen Labeling and Consumer Protection Act，F(xiàn)ALCPA）均明確規(guī)定巴西堅果屬于必須明確標(biāo)識的食品過敏原[5-6]。我國在各級食品標(biāo)準(zhǔn)中也做出了類似的規(guī)定，例如《GB 7718-2011預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》、《GB/T 23779-2009預(yù)包裝食品中的致敏原成分》等均對此有明確的規(guī)定[7-8]。

食品過敏原標(biāo)識管理法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的有效實施依賴于食品過敏原檢測技術(shù)。但是，目前為止國內(nèi)外都沒有發(fā)布巴西堅果過敏原成分的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，國外對巴西堅果的檢測通常采用一種商業(yè)化過敏原蛋白質(zhì)免疫層析快速檢測技術(shù)，國內(nèi)對巴西堅果尚未建立任何達(dá)到行業(yè)應(yīng)用水平的通用方法。這種現(xiàn)狀已經(jīng)嚴(yán)重影響了過敏原標(biāo)識管理相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)有效實施。因此，在預(yù)包裝食品過敏原檢驗技術(shù)領(lǐng)域，目前急需制定更加普適、簡便、準(zhǔn)確、成本低廉的巴西堅果過敏原檢測方法，使之適用于食品企業(yè)品質(zhì)安全檢驗和進(jìn)出口食品實驗室檢驗。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年由Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，具有操作簡便、對儀器設(shè)備需求低、高特異性和高靈敏度、擴(kuò)增高效快速、結(jié)果判讀簡便等特點[9]。目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)在食品安全、公共衛(wèi)生安全監(jiān)測和應(yīng)急檢測、臨床醫(yī)學(xué)診斷、生物安全、生物識別等專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[10-12]。本文以巴西堅果的2S蛋白基因序列為檢測目標(biāo)基因，建立可采用終點顯色法和實時熒光法監(jiān)測食品中巴西堅果過敏原成分的LAMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴西堅果（Brazil nut，Bertholletia excelsa）、澳洲堅果（Macadamia nut，Macadamia ternifolia）、開心果（Pistachio，Pistacia vera）、核桃（Walnut，Juglans regia）、碧根果（Pecan，Carya illinoensis（Wangh.）koch）、腰果（Cashew，Anacardium occidentalie）、松籽（Korean Pine nut，Pinus koraiensis）、榛子（Hazelnut，Corylus avellana）、美國大杏仁（Almond，Amygdalus communis）、葵花籽（Sunflower seed，Helianthus annuus）、板栗（Chestnut，Castanea mollissima）、苦杏仁（Bitter apricot seed，Semen Armeniacae Amarum）、南瓜籽（Pumpkin seed，Cucurbita moschata）、蓮 子（Lotus seed，Semen Nelumbinis）、大米（Rice，Oryza sativa） 均購于廣州市各大超市；Promega Wizard?基因組DNA純化試劑盒 北京盈田卓越科技有限公司；Ex Taq、dNTPs寶生物工程（大連）有限公司；甜菜堿、Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol緩沖液 Sigma公司；1000×SYBR GreenⅠ 廈門致善生物科技有限公司；SYTO-9 Invitrogen公司；LAMP引物 上海生工生物工程有限公司；r-biopharm?巴西堅果快速檢測試紙條（BL 602） 拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售（北京）有限公司。

NANODROP 1000型核酸蛋白分析儀 美國NANODROP科技有限公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；恒溫金屬浴 杭州奧盛儀器有限公司；GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA模板的提取和純化 根據(jù)GB/T 19495.3-2004規(guī)定[13]，采用標(biāo)準(zhǔn)方法從供試材料中提取植物基因組DNA，用核酸蛋白分析儀測定DNA的濃度和純度，將DNA溶液稀釋至100ng/滋L，-20℃保存?zhèn)溆?。對提取出的植物基因組DNA用植物通用引物Plant 159進(jìn)行檢測[14]，檢測結(jié)果陽性表明提取出適宜進(jìn)行擴(kuò)增的DNA，否則應(yīng)重新進(jìn)行DNA提取和純化。

1.2.2 引物的設(shè)計與篩選 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中巴西堅果2S白蛋白（Bertholletia excelsa 2S albumin），Accession no.AB044391.1）基因序列，通過Blast在線比對軟件進(jìn)行分析，在巴西堅果序列的種特異性區(qū)域，利用LAMP引物在線設(shè)計軟件Primer Explorer Version 4分別設(shè)計包括兩條外引物F3、B3、兩條內(nèi)引物FIP、BIP的LAMP引物各3套，由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)引物的擴(kuò)增效果選取較佳的引物，隨后使用Primer Explorer Version 4設(shè)計環(huán)引物。所選引物見表1和圖1。

表1 巴西堅果LAMP擴(kuò)增引物序列Table 1 The primers for brazil nut LAMP assay

圖1 六條LAMP檢測引物在巴西堅果2S白蛋白基因上所對應(yīng)的區(qū)域Fig.1 The location of primers for LAMP assay in the Bertholletia excels 2S albumin gene

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立 根據(jù)已有的文獻(xiàn)[8]，初步確定25滋L的LAMP反應(yīng)體系：內(nèi)引物FIP和BIP各1.6滋mol/L，外引物F3和B3各0.2滋mol/L，環(huán)引物L(fēng)F和LB各0.8滋mol/L，1×ThermoPol緩沖液，1mol/L甜菜堿，6mmol/L MgSO4，1.6mmol/L dNTP，0.32U/μL Bst DNA聚合酶，DNA模板200ng。將LAMP反應(yīng)體系配制完成后置于0.2mL離心管中，在離心管中加入1滴石蠟油以避免反應(yīng)體系揮發(fā)和污染。

LAMP反應(yīng)可采用兩種結(jié)果判讀方法，一是熒光染料顯色法（Fluorescent Dyes），二是實時熒光法。

熒光染料顯色法是在上述管蓋內(nèi)壁加入1μL 1000×SYBR GreenⅠ。蓋管蓋時應(yīng)小心，防止顯色液混合進(jìn)入反應(yīng)液中。然后將其置于金屬浴在63℃恒溫反應(yīng)90min，最后80℃滅活5min結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管上下顛倒混勻或離心，使蓋內(nèi)壁的SYBR GreenⅠ與反應(yīng)液混合，觀察離心管中反應(yīng)液顏色。如發(fā)生特異性擴(kuò)增，溶液變?yōu)榫G色，否則保持SYBR GreenⅠ橙色不變。

實時熒光法是在反應(yīng)體系中加入0.2μmol/L SYTO-9，通過實時熒光PCR儀設(shè)定Holding Stage為63℃30s，1個循環(huán)；Cycling Stage為63℃15s，63℃45s，90個循環(huán)，于63℃45s處收集熒光信號，熒光通道為FAM。

1.2.4 LAMP引物的篩選 用巴西堅果DNA作為模板，用大米DNA作為陰性對照，每組對照分別設(shè)置2個平行，通過實時熒光法實時監(jiān)測LAMP反應(yīng)。通過觀察實時熒光的擴(kuò)增曲線，根據(jù)起始擴(kuò)增時間、擴(kuò)增曲線的重復(fù)性等指標(biāo)對引物進(jìn)行篩選。

1.2.5 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)報道，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、鎂離子濃度、甜菜堿濃度和dNTPs濃度是影響LAMP擴(kuò)增效果的重要因素。由于Bst DNA聚合酶最適溫度在60～65℃，本文選取60、61、62、63、64、65℃6個溫度條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)，通過實時熒光法監(jiān)測LAMP反應(yīng)，選取適宜的溫度。在適宜的溫度下，依次對Mg2+、甜菜堿和dNTPs濃度和反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化，其中Mg2+選取了4、6、8、10mmol/L 4個濃度梯度，甜菜堿選取了0.6、0.8、1.0、1.2mol/L 4個濃度梯度，dNTPs選取了1.2、1.4、1.6、1.8mmol/L 4個濃度梯度。通過實時熒光法監(jiān)測LAMP反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.6 特異性實驗 高度特異性是過敏原檢測方法必須具備的基本特性，為此利用建立的LAMP方法對巴西堅果、腰果、花生、澳洲堅果、碧根果、杏仁、開心果、葵瓜子、板栗、榛子、核桃、南杏、北杏、松子、南瓜子、西瓜子、蓮子共17種常見的堅果進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，同時采用顯色法和實時熒光法進(jìn)行檢測。

1.2.7 靈敏度實驗 為確定本方法的相對靈敏度，用100ng/μL的大米DNA為基質(zhì)，用100ng/μL的巴西堅果DNA按照體積比制成不同梯度濃度（0%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%）的巴西堅果模擬樣品DNA，用不同濃度梯度的模擬樣品DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，每個濃度設(shè)置2個平行，用實時熒光法和顯色法同時進(jìn)行靈敏度測試。

1.2.8 穩(wěn)定性實驗 為評估本方法的穩(wěn)定性，對0.5%、1%、5%的巴西堅果模擬樣品DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，每個濃度分別采用實時熒光法和顯色法重復(fù)20次，同時以0%的巴西堅果模擬樣品DNA作為陰性對照，用以測試本方法的穩(wěn)定性。

1.2.9 適用性實驗 對進(jìn)口商品和市售商品共計7份預(yù)包裝食品進(jìn)行檢測，通過驗證本方法的檢測結(jié)果與商品標(biāo)簽上的過敏原信息是否相符來評價本方法檢測實際食品樣品中巴西堅果過敏原成分的能力。同時采用商業(yè)化快速檢測試紙條進(jìn)行檢測，將兩種方法進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP引物篩選

本文針對巴西堅果2S白蛋白基因序列設(shè)計了3套LAMP檢測引物，通過LAMP反應(yīng)實時熒光法結(jié)果顯示，第1套引物未出現(xiàn)對數(shù)擴(kuò)增，第2套引物出現(xiàn)對數(shù)擴(kuò)增時間約為25min，兩個平行重復(fù)性較好，第3套引物出現(xiàn)對數(shù)擴(kuò)增時間約為55min。因此，選取第2套引物進(jìn)行下一步的實驗，為了增加擴(kuò)增效率，引入環(huán)引物一對，見表1和圖1。

2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)實時熒光法監(jiān)測結(jié)果顯示，在25μL反應(yīng)體系中，當(dāng)Mg2+濃度為6mmol/L、甜菜堿濃度為1mol/L、dNTPs濃度為1.6mmol/L，在63℃反應(yīng)45min，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果最好。最佳反應(yīng)體系和條件下第2套引物的LAMP實時熒光法檢測結(jié)果見圖2。

圖2 巴西堅果LAMP檢測方法最佳反應(yīng)體系結(jié)果圖（實時熒光法）Fig.2 The results of optimum reaction system for Brazil nut LAMP detection method（RT-LAMP）

2.3 特異性實驗

利用建立的LAMP方法對巴西堅果及其他16種堅果進(jìn)行特異性擴(kuò)增。實時熒光法和顯色法的實驗結(jié)果分別見圖3和圖4，可知僅巴西堅果出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，且SYBR Green I顯色為綠色。在其他堅果中均未得到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，表明建立的LAMP方法對巴西堅果具有高度的特異性。

2.4 靈敏度實驗

實時熒光法和顯色法的實驗結(jié)果分別見圖5和圖6。

結(jié)果表明：LAMP顯色法和實時熒光法均可檢出100%、10%、5%、1%、0.5%的巴西堅果陽性樣品，不能檢出0.1%和0.05%的陽性樣品。LAMP實時熒光法的檢測結(jié)果顯示巴西堅果濃度越高，開始出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的時間越短，Ct值越小。靈敏度實驗結(jié)果表明，本標(biāo)準(zhǔn)檢測方法對巴西堅果的最低檢測限可達(dá)0.5%。

圖3 巴西堅果LAMP檢測方法特異性實驗結(jié)果（實時熒光法）Fig.3 The results of specificity evaluation on Brazil nut LAMP detection method（RT-LAMP）

圖4 巴西堅果LAMP檢測方法特異性實驗結(jié)果（熒光染料顯色法）Fig.4 The results of specificity evaluation on Brazil nut LAMP detection method（Fluorescent Dyes）

圖5 巴西堅果LAMP檢測方法靈敏度實驗結(jié)果（實時熒光法）Fig.5 The results of sensitivity evaluation on Brazil nut LAMP detection method（RT-LAMP）

圖6 巴西堅果LAMP檢測方法靈敏度實驗結(jié)果（顯色法）Fig.6 The results of sensitivity evaluation on Brazil nut LAMP detection method（Fluorescent Dyes）

2.5 穩(wěn)定性實驗

穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示所有樣品和各次重復(fù)中均能得到準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測結(jié)果，假陽性率和假陰性率均為0%，表明本方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.6 適用性實驗

實際樣品檢測結(jié)果見表2。LAMP檢測顯色法、實時熒光法和商業(yè)化快速檢測試紙條的檢測結(jié)果與配料表中所標(biāo)識的巴西堅果是否存在的實際情況完全一致，假陽性率和假陰性率均為0%，表明本文建立的巴西堅果LAMP檢測方法可用于預(yù)包裝食品中巴西堅果的檢測。

3 結(jié)論

建立了食品中巴西堅果過敏原成分的LAMP檢測方法，該方法適用于預(yù)包裝食品中巴西堅果的特異性檢測，靈敏度達(dá)到0.5%，具有良好的穩(wěn)定性和特異性，在檢測市售實際樣品時檢測結(jié)果與標(biāo)簽中的過敏原信息完全相符。

建立的巴西堅果LAMP檢測方法是基于巴西堅果DNA片段的檢測方法，與基于蛋白質(zhì)的檢測方法相比，優(yōu)點在于DNA的穩(wěn)定程度比蛋白質(zhì)高，在食品加工過程中不易被破壞，因此本方法可以更加穩(wěn)定的檢測出食品中微量的過敏原成分，并且與商業(yè)化蛋白質(zhì)快速檢測試紙條的性能相當(dāng)。與其他基于基因檢測的方法相比，例如傳統(tǒng)的PCR方法和實時熒光PCR方法，本方法的優(yōu)點在于恒溫擴(kuò)增，省略了溫度循環(huán)所需時間和能量，能達(dá)到快速檢測的目的，但是性能完全能夠達(dá)到傳統(tǒng)PCR方法或?qū)崟r熒光PCR方法的技術(shù)水平。本方法可以采用終點顯色法進(jìn)行結(jié)果判斷，無需昂貴的儀器設(shè)備，只需金屬加熱塊或水浴鍋即可進(jìn)行檢測，適合基層實驗室推廣應(yīng)用；也可以采用實時熒光法進(jìn)行實時監(jiān)控，更加精確的判斷結(jié)果，適合于中、大型的實驗室推廣應(yīng)用。

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Construction and application of loop-mediated isothermal amplification method for detection of brazil nut as a food allergen

LIU Jin1，CHEN Yuan-shu1，LING Li1，LI Zhi-yong1，ZHANG Huang2，GAO Dong-wei1，*
（1.Guangdong Inspection&Quarantine Technology Center，Guangzhou 510623，China；2.Guangzhou Diao Bio-Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China）

According to the Bertholletia excels 2S albumin gene sequences，this article designed and screened sets of loop-mediated isothermal amplification（LAMP）primers using a design software named Primer Explorer Version 4，then established the relevant LAMP method for detection of Brazil nut as a food allergen，whose results could be measured by real-time fluorescence or using a fluorescent dyes in the end reaction.The specificity of this method was evaluated by detection of 17 nut samples include macadamia nut，pistachio，pecan，and so on.The sensitivity was tested using DNA gradient dilutions，and the stability was assessed with detection of 0.5%，1%，1.5%gradient dilutions of Brazil nut DNA for 20 times.It was indicated that this method had satisfied specificity，sensitivity and stability in the identification of Brazil nut in foods with a LOD of 0.5%.In addition，the detection of 7 market food samples using this method showed the 100%consistency to the labeled information of allergen ingredients with 0%false positive and negative rates.

food allergen；brazil nut；loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；detection method

TS255.6

A

1002-0306（2014）14-0076-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.007

2013－11－19 *通訊聯(lián)系人

劉津（1983-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品分子生物學(xué)檢測（包括轉(zhuǎn)基因、過敏原、動物源性成分檢測等）。

出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定計劃項目（2012B141）。