王鳳軍，張祥林，譚志文，馬海波，馮俊麗，王鵬舉（.庫爾勒出入境檢驗檢疫局，新疆庫爾勒8000；.新疆出入境檢驗檢疫局，新疆烏魯木齊80000；.浙江萬里學(xué)院，浙江寧波00；.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊80000；.浙江理工大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州008）

棗褐斑病菌實時熒光PCR快速檢測方法研究

王鳳軍1，張祥林2，譚志文3，馬海波4，馮俊麗5，王鵬舉1
（1.庫爾勒出入境檢驗檢疫局，新疆庫爾勒841000；2.新疆出入境檢驗檢疫局，新疆烏魯木齊830000；3.浙江萬里學(xué)院，浙江寧波315100；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊830000；5.浙江理工大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310018）

根據(jù)棗褐斑病原菌鏈格孢子基因組保守序列，設(shè)計特異性引物和雙熒光標(biāo)記探針，建立了棗褐斑病菌的TaqMan實時熒光PCR檢測方法。此外，還對其他2種紅棗植物病害病原菌和6種鏈格孢菌種進(jìn)行了熒光PCR檢測。結(jié)果表明，只有棗褐斑病菌產(chǎn)生熒光信號，其他病原菌均沒有熒光信號產(chǎn)生。與常規(guī)PCR相比，TaqMan實時熒光PCR檢測特異性強(qiáng)，靈敏度高，能檢測到濃度為1.4pg/μL的DNA樣本。該方法全程不必通過病原菌的分離與純化培養(yǎng)，可直接用于病變樣品的檢測以及棗褐斑病的篩查與動態(tài)監(jiān)測，適合棗褐斑病的快速診斷和分子監(jiān)測。

棗，鏈格孢菌，實時熒光PCR，快速檢測

棗褐斑病主要侵害果實，引起果實腐爛和提早脫落，是棗區(qū)一種嚴(yán)重的果實病害。近十幾年來，該病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，流行年份病果率高達(dá)50%左右，嚴(yán)重者可達(dá)70%以上，甚至絕收，給紅棗的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了很大影響[1]。2012年新疆巴州地區(qū)降雨量明顯增加，相對濕度較高，棗園通風(fēng)不暢，部分棗區(qū)褐斑病大量蔓延。最近有報道指出這是由鏈格孢菌（Alternaria alternate）引起的儲藏期病害[2]。

鏈格孢菌為半知菌亞門絲孢綱絲孢目鏈格孢屬真菌，寄主范圍廣，在蘋果、梨、甘薯、柑橘、番茄、鴨梨、非洲菊、苜蓿等蔬果上均有報道[3-8]。目前，對鏈格孢菌等植物病原真菌的分類鑒定主要通過分離培養(yǎng)與顯微觀察等，受到培養(yǎng)條件等因素的影響，且耗時長，對鑒定工作帶來很大困難[6]。

隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展，PCR技術(shù)已廣泛用于植物病害檢測。該方法主要對在科、屬、種水平上高度特異的rDNA的ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序分析后設(shè)計特異性引物來檢測植物病原菌。在此方法基礎(chǔ)上，又逐漸發(fā)展了RT-PCR、巢式RT-PCR、免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR等[9-12]，有效遏制了國外有害生物入侵，保證生物入境安全。但這些方法需進(jìn)一步分子雜交或克隆測序鑒定，仍需要較長的檢測時間，難以滿足快速診斷的需要。

實時熒光PCR把熒光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光標(biāo)記探針相結(jié)合，將核酸擴(kuò)增和光譜分析融合在一起，使用熒光監(jiān)測系統(tǒng)對整個擴(kuò)增過程進(jìn)行實時監(jiān)控，具有操作簡單，檢測迅速，準(zhǔn)確靈敏等特點，已廣泛應(yīng)用于植物病原菌的檢測與鑒定[13-14]。本研究通過設(shè)計特異性引物和探針建立的基于TaqMan探針的實時熒光PCR檢測技術(shù)可對棗褐斑病的診斷和快速檢測提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用的菌株 本實驗室分離保存，感病紅棗果實或疑似褐斑病的紅棗樣本以及陰性對照樣本采自新疆巴州若羌縣棗園；供試菌株 主要購自中國微生物菌種中心，部分菌種由河北出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心惠贈（表1）；基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；熒光定量PCR檢測試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；探針與引物 委托美國Invitrogen公司合成。

ABI7500型實時熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ND2000C型核酸蛋白分析儀 美國熱電公司；1-14ED小型離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離培養(yǎng)與純化 對感病紅棗樣本先用75%酒精脫脂棉擦拭果實表面，用滅菌的解剖刀切取萼端、胴部和梗端，0.25%次氯酸鈉表面消毒1min，用無菌水清洗2～3次，移至PCA平板（馬鈴薯20g，胡蘿卜10g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL）上，25℃黑暗培養(yǎng)5～ 7d，待長出菌落后進(jìn)行純化鑒定。

1.2.2 基因組DNA的提取 稱取紅棗病變部位樣品100mg，按照基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入50滋L滅菌ddH2O洗脫兩次。用核酸蛋白分析儀檢測DNA提取的純度和濃度。

1.2.3 引物和探針設(shè)計 根據(jù)NCBI的Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中真菌核糖體18S rDNA基因序列中表達(dá)鏈格孢菌基因片段（JN392101.1），使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物和探針，確定引物Tm值在55～57℃之間，在DNAstar軟件上評價引物的特異性，在BLAST網(wǎng)頁上比對擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.2.4 實時熒光定量反應(yīng) 反應(yīng)體系（25滋L）含10× PCR Buffer 2.5滋L，dNTP（400滋mol/L）2滋L，引物（10滋mol/L）0.5滋L，探針（10滋mol/L）0.5滋L，500U Taq DNA聚合酶0.25滋L，DNA模板3滋L，ddH2O 15.75滋L。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火/延伸1min，共計40個循環(huán)。

1.2.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 將測定好濃度的棗褐斑病基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋，共設(shè)置5個梯度，分別為14.0000、1.4000、0.1400、0.0140和0.0014ng/滋L，稀釋介質(zhì)為滅菌ddH2O。對5個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光定量反應(yīng)，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗褐斑病菌的形態(tài)學(xué)鑒定

對采集的感病棗果樣本進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)與純化鑒定，共分離28個棗，140個組織塊，其中25個病果，70個組織塊中經(jīng)純化培養(yǎng)（圖1A）和顯微觀察（圖1B）確認(rèn)為棗褐斑病鏈格孢屬[15]。

表1 供試菌株及其來源Table 1 Sources of Alternaria isolates tested

2.2 引物和探針特異性檢測

本實驗根據(jù)于占晶等[2]使用的鏈格孢菌專有化引物Aalt-F/Aalt-R序列，在BLAST網(wǎng)頁上進(jìn)行Primer-Blast比對，尋找到鏈格孢菌在真菌核糖體18S rDNA基因序列特異性片段并在此片段上設(shè)計上游和下游引物及Taqman探針，探針5’端以FAM作熒光標(biāo)記，3’端以TAMRA作標(biāo)記。引物和探針序列見表2。

表2 紅棗褐斑病病原菌基因引物和探針序列Table 2 The primers and probe of the gene of pathogen causing brown spot on jujube

以紅棗裂果病和紅棗縮果病病變組織樣品及表1中的6種菌種提取的DNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，驗證紅棗褐斑病病原菌基因引物和探針的特異性。結(jié)果顯示，只有以紅棗褐斑病DNA為模板的反應(yīng)管中顯示了指數(shù)型擴(kuò)增曲線，其他紅棗病害樣本均無信號（圖1），證明紅棗褐斑病病原菌基因引物和探針在紅棗病害的鑒定中具有特異性。

圖2 紅棗褐斑病病原菌基因引物和探針特異性檢測Fig.2 Detection results of the gene of pathogen causing brown spot on jujube

2.3 重復(fù)性和靈敏性檢測

分別以5個濃度梯度的棗褐斑病菌標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實時熒光定量反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），其R2為0.992。對Ct值統(tǒng)計分析（表3），同一參照樣品重復(fù)間Ct值變異較小，鏈格孢菌基因Ct值變化范圍在24.60～37.04之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.033～0.146之間，表明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

如表3所示，在最高稀釋度的樣品中，棗褐斑病鏈格孢菌基因得到擴(kuò)增，Ct值為36.94，大于檢測臨界限（Ct=35），結(jié)果表明，棗褐斑病鏈格孢菌基因在模板濃度為0.0140ng/滋L時為有效擴(kuò)增，即確定該濃度為最低定量限，最低檢測限為0.0014ng/滋L，即1.4pg/滋L。

表3 紅棗褐斑病DNA標(biāo)準(zhǔn)品Ct值分析表Table 3 Ct value analysis of DNA samples of pathogen causing brown spot on jujube

圖3 棗褐斑病鏈格孢菌基因擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The amplification plot and standard curve of the pathogen gene causing brown spot on jujube

3 結(jié)論

棗樹易感黑斑病、棗銹病、棗縮果病、棗裂果病和炭疽病等嚴(yán)重植物病害，其中大多為真菌病害[2，16]，嚴(yán)重影響棗的品質(zhì)和產(chǎn)量。本研究對采集的28個病果的140個組織塊進(jìn)行分離培養(yǎng)，在70個組織塊中分離出菌落形態(tài)較為一致的菌株。通過病菌形態(tài)特征觀察和鑒定及實時熒光PCR擴(kuò)增，將感病棗果的病原菌確定為A.alternata。孫恩等對廣東省觀賞性植物銀海棗褐斑病進(jìn)行分離培養(yǎng)，病原鑒定為鏈格孢A.alternata[17]。王軍等用常規(guī)方法分離冬棗黑斑病病原，獲得3種真菌，通過回接健康果實，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定致病菌為A.alternata[18]。于占晶等對壺瓶棗褐斑病進(jìn)行分離培養(yǎng)，形態(tài)觀察，rDNA ITS序列分析以及特異性引物擴(kuò)增，確定病原菌為A.alternata[2]。本文的研究結(jié)果與已報告的結(jié)果一致，明確了若羌紅棗褐斑病病原菌為A.alternata。

本研究基于TaqMan實時熒光定量PCR技術(shù)建立快速檢測棗褐斑病菌方法。通過對梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2為0.992，確定最低檢測限為1.4pg/滋L，結(jié)果表明該方法特異性好，熒光信號強(qiáng)，靈敏度高，減少了交叉污染，可實現(xiàn)棗褐斑病的分子鑒定、早期診斷和快速檢測，為更好的控制棗褐斑病病害蔓延和提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益提供技術(shù)保障。

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Real-time fluorescence PCR method for detection of the pathogen causing brown spot on jujube

WANG Feng-jun1，ZHANG Xiang-lin2，TAN Zhi-wen3，MA Hai-bo4，F(xiàn)ENG Jun-li5，WANG Peng-ju1
（1.Korla Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Korla 841000，China；2.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Urumqi 830000，China；3.Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China；4.Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830000，China；5.Institute of Bioengineering，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

A real-time fluorescence PCR method was established by using a pair of specific primers and doublefluorescence labeling probe according to the conserved sequence of the total nucleic acid extracted from the diseased jujubes causing brown spot.The real-time fluorescence PCR was used to detect other two kinds of plant disease pathogens on jujubes and six standard strains of Alternaria alternaria purchased by general microbiological culture collection center.The results showed that fluorescence signal could be collected with the combination of the specific primers and probe only in the pathogen causing brown spot on jujubes.The assay for specific detection was more sensitive than conventional PCR，which could detect the limit concentration of diseased samples as low as 1.4pg/μL analyzed by the standard curve in this method and have no need of culture，conventional identification and microscopic examination of the pathogens with the traditional method of biology.This reliable，sensitive，quick and easy-handling method could reach the species level and suitable for screening，dynamic monitoring and identification of plant diseases.

jujubes；Alternaria alternate；real-time fluorescence PCR；rapid detection

TS207.3

A

1002-0306（2014）14-0056-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.002

2013－09－28

王鳳軍（1984-），女，碩士研究生，工程師，主要從事植物病害和轉(zhuǎn)基因檢測方面的研究。

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局資助項目（201110022-3）；國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局資助項目（2012IK290）；庫爾勒市重點科技項目。