楊樹(shù)猛，馬登錄，郭淑珍，李保明，馬忠濤，才讓鬧日，牛小瑩，格桂花，趙光平，楊秀蘭，張玉珍，尕旦吉，張海濱

（甘肅省甘南州畜牧科學(xué)研究所，合作 747000）

遺傳育種

藏羊脂聯(lián)素基因多態(tài)性及其與產(chǎn)肉性能的相關(guān)性分析

楊樹(shù)猛，馬登錄，郭淑珍，李保明，馬忠濤，才讓鬧日，牛小瑩，格桂花，趙光平，楊秀蘭，張玉珍，尕旦吉，張海濱

（甘肅省甘南州畜牧科學(xué)研究所，合作 747000）

利用高分辨率熔解曲線技術(shù)對(duì)176頭2周歲的甘肅藏羊（歐拉型、甘加型、喬科型）脂聯(lián)素基因SNPs位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),運(yùn)用GLM模型將檢測(cè)到的SNPs位點(diǎn)與部分胴體及肉質(zhì)性狀的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：在脂聯(lián)素第2外顯子發(fā)現(xiàn)+67G>C突變使編碼氨基酸由谷氨酸突變?yōu)楣劝滨０?；GG、GC基因型個(gè)體的宰前活重、胴體重均顯著高于CC型（P<0.05）。說(shuō)明脂聯(lián)素基因該位點(diǎn)可能是影響藏羊胴體及肉質(zhì)性狀的主效QTL或與之緊密連鎖,可作為藏羊高檔羊肉生產(chǎn)的候選分子標(biāo)記。

脂聯(lián)素基因；SNPs；產(chǎn)肉性能；藏羊

脂聯(lián)素（adiponectin）是脂肪細(xì)胞高效表達(dá)并通過(guò)特殊運(yùn)輸途徑分泌進(jìn)入血液循環(huán)的一種活性物質(zhì)［1］，又被稱(chēng)為ACRP30［2］、ADIPOQ［3］、APM1［4］或GBP28［5］，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子，具有調(diào)控葡萄糖、脂肪酸代謝及生物體能量穩(wěn)態(tài)等重要作用。脂聯(lián)素在生物體內(nèi)的生理作用通過(guò)受體ADIPOR1和ADIPOR2介導(dǎo)［6］。人和哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素基因均包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,而禽類(lèi)脂聯(lián)素基因只包括2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子［3-4,7］。在人類(lèi)，脂聯(lián)素與胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化之間的相關(guān)性已被許多研究者所關(guān)注，但對(duì)動(dòng)物脂聯(lián)素基因的研究相對(duì)較少，且主要集中在豬、牛等家畜［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)該基因可能是控制畜禽脂肪性狀的主效基因或與控制該性狀的主效基因相連鎖，可作為畜禽脂肪性狀的候選基因。目前關(guān)于羊脂聯(lián)素基因的研究很少，僅見(jiàn)羊脂聯(lián)素基因與繁殖性能相關(guān)性的報(bào)道［11］。

隨著全球消費(fèi)者對(duì)綠色食品重要性的認(rèn)識(shí)和需求的日益增加，生活在高海拔無(wú)污染地區(qū)的甘肅藏羊以生產(chǎn)“綠色肉食品”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。藏羊肉中氨基酸豐富，種類(lèi)齊全，接近FAO模式，蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)良，肌間脂肪含量適中，礦物質(zhì)含量較高，肉品質(zhì)量上乘，屬于典型的高蛋白、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)豐富的動(dòng)物性食品，符合現(xiàn)今消費(fèi)者對(duì)肉食品的選擇性需求。為合理開(kāi)發(fā)利用和擴(kuò)大藏羊產(chǎn)品市場(chǎng)，應(yīng)在提高其生產(chǎn)性能的基礎(chǔ)上，加大對(duì)其肉品質(zhì)量的研究。因此，本研究擬采用高分

辨率熔解曲線分析檢測(cè)脂聯(lián)素基因第2、3外顯子在甘肅藏羊中的多態(tài)性，并與肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，以期尋找控制藏羊肉品質(zhì)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，為甘肅藏羊的分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供試羊均為2±0.2周歲母羊，包括歐拉型藏羊53只，來(lái)自甘肅省甘南州瑪曲縣河曲馬場(chǎng)；甘加型藏羊57只，來(lái)自甘南州夏河縣甘加鄉(xiāng)核心育種戶；喬科型藏羊66只，來(lái)自甘南州碌曲縣尕海鄉(xiāng)核心育種戶。血樣采自綿羊頸靜脈（10 mL/只），用肝素鈉抗凝，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-70℃凍存?zhèn)溆?。屠宰前后?duì)每只羊進(jìn)行屠體性狀分析，屠宰后取背最長(zhǎng)肌處肉樣，將其分割為100 g左右的小塊裝入潔凈保鮮袋中，迅速冷置于-18℃冰箱冷凍保存，用于肉質(zhì)品質(zhì)、風(fēng)味等分析。測(cè)定的主要性狀和指標(biāo)包括宰前活重、胴體重、GR值、眼肌面積、失水力、剪切力，所有檢測(cè)均參照《綿羊和山羊生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》（NYT1236—2006）進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器 2×Taq PCR Master Mix、血液基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；LCGreen PLUS飽和熒光染料購(gòu)自美國(guó)Idaho公司；石蠟油購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他常規(guī)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。VeritiTM96-Well Thermal Cycler型PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；Allegra TM21R離心機(jī)為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；Lightscanner TMHR-I為美國(guó)Idaho公司產(chǎn)品；NanoDrop ND-2000核酸定量?jī)x為美國(guó)Nanodrop公司產(chǎn)品。引物合成及測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司完成。

1.1.3 PCR引物 根據(jù)羊ADIPOQ序列（GenBank登錄號(hào)：100294598）［11］，用Oligo 6.0設(shè)計(jì)2對(duì)引物，擴(kuò)增藏羊脂聯(lián)素基因的第2、3外顯子的部分片段。引物序列和擴(kuò)增片段特征見(jiàn)表1。其中HRM內(nèi)參核苷酸片段3’端氨基-C6封閉，PAGE級(jí)別。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及定量 按照血液基因組試劑盒說(shuō)明提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其濃度和純度，PCR前調(diào)整樣本DNA終濃度至30 ng/μL。

1.2.2PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：10 mmol/L dNTP 0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液1 μL，0.01 mmol/L上游引物0.1 μL，0.01 mmol/L下游引物0.1 μL，1×LCGreen PLUS飽和熒光染料1 μL，寡核苷酸內(nèi)參0.2 μL（高溫寡核苷酸內(nèi)參與低溫寡核苷酸內(nèi)參各0.1 μL），模板1 μL（待測(cè)模板0.5 μL和野生型模板0.5 μL），加去離子水至10 μL。PCR時(shí)于每一體系中加入20 μL的石蠟油，防止液體揮發(fā)。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，然后94℃30 s，58℃退火30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 HRM檢測(cè) 將反應(yīng)后的8 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物移至96孔伯樂(lè) PCR平板中，然后加入 10 μL礦物油，1 000 r/min離心。LightScanner儀器從45℃開(kāi)始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，到 98℃結(jié)束，用LightScanner Call IT軟件對(duì)采集后的曲線進(jìn)行分析。

1.2.4 測(cè)序 選擇基因型不同的樣品，送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1）等位基因頻率：按下列公式計(jì)算。

式中，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，i為純合復(fù)等位基因，j1、j2……jn為與i共有的第1到第n個(gè)等位基因。

2）基因型頻率：基因型頻率＝基因型個(gè)體數(shù)/測(cè)定群體總數(shù)。

3）多態(tài)性分析：多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)、觀察雜合度（observed heterozygosiy, Ho）、遺傳雜合度（heterozygosity,He）和有效等位基因數(shù)（efective number ofalleles,Ne）等遺傳參數(shù)用POPGEN32軟件統(tǒng)計(jì)分析（Nei Met al，1979；Nei M，et al，1974）。

4）最小二乘法統(tǒng)計(jì)分析模型：利用SPSS 13.0軟件分析場(chǎng)地和基因型等因素與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。根據(jù)影響藏羊生長(zhǎng)性狀的不同因素，采用以下固定模型，同時(shí)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取舍。固定模型如下：

y=μ+Farm+Genetype+X+e

其中：y為個(gè)體表型記錄；μ為群體平均值；Farm為場(chǎng)際效應(yīng)；Genetype為標(biāo)記基因型效應(yīng)；X為各種二級(jí)和二級(jí)以上互作效應(yīng)，如Farm×Genetype等；e為隨機(jī)誤差。用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對(duì)各基因型間生長(zhǎng)性狀進(jìn)行差異顯著性分析，分析不同基因型與宰前活重、胴體重、GR值、眼肌面積、系水力、嫩度等性狀的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HRM突變掃描檢測(cè)

經(jīng)優(yōu)化PCR條件后，將用于HRM突變掃描檢測(cè)的PCR產(chǎn)物1%凝膠電泳和HRM檢測(cè)。由圖1可見(jiàn)，由引物E2F/E2R、E3F/E3R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分別為183 bp、258 bp的特異性條單帶，無(wú)雜帶，可進(jìn)行HRM檢測(cè)。經(jīng)HRM檢測(cè)，E2F/E2R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物明顯地分為3種類(lèi)型，測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn)這3種類(lèi)型分別為CC野生型、GG純合型和GC雜合型3種基因型（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示，在脂聯(lián)素第2外顯子片段出現(xiàn)一處突變，對(duì)應(yīng)于基因組序列（GenBank登錄號(hào)：NC_007299）+67G>C，此處的突變位于編碼區(qū)，并引起了氨基酸的改變，使第22位氨基酸的第一位密碼子G變?yōu)镃，氨基酸由原來(lái)的谷氨酸改變?yōu)楣劝滨０?。在脂?lián)素第3外顯子中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

圖1 脂聯(lián)素基因第2、3外顯子引物擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖2 脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)基因分型結(jié)果

2.2 群體遺傳分析

2.2.1 藏羊脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)遺傳分析 對(duì)甘肅歐拉型、甘加型、喬科型藏羊脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)遺傳分析，G等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，3個(gè)群體基因頻率分別為0.821、0.860、0.864。GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，3個(gè)群體基因型頻率分別為0.736、0.737和0.773（表2）。進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，僅歐拉型藏羊在 +67G>C位點(diǎn)上處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P<0.05）。進(jìn)行基因雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2所示，可見(jiàn)+67G>C位點(diǎn)在3個(gè)群體中均為中度多態(tài)，多態(tài)信息含量歐拉型藏羊最高，純合度甘加型藏羊最高，雜合度歐拉型藏羊最高。

表2 脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)在甘肅藏羊中的遺傳分析

2.2.2 +67G>C位點(diǎn)不同基因型與甘肅藏羊產(chǎn)肉和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析 應(yīng)用建立的最小二乘法線性模型，對(duì)甘肅歐拉型、甘加型、喬科型藏羊脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)的不同基因型與宰前活重、胴體重、GR值、眼肌面積、系水力、嫩度等性狀進(jìn)行方差分析（表3）。由表3可以看出，GG、GC基因型個(gè)體的宰前活重、胴體重均值均顯著高于CC型個(gè)體（P<0.05），GR值、眼肌面積、失水力、剪切力等性狀在不同基因型個(gè)體之間差異均不顯著（P>0.05）。

表3 脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)不同基因型與藏羊產(chǎn)肉和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

脂聯(lián)素在脂肪代謝中起著重要作用。本研究在脂聯(lián)素第2、3外顯子檢測(cè)的區(qū)域中，僅在第2外顯子中檢測(cè)到一處突變，為錯(cuò)義突變，這與楊彥杰等［10］在秦川牛中的結(jié)果一致。Morsci等［12］在編碼區(qū)也僅檢測(cè)到一處突變，為同義突變（第59位氨基酸的第3位密碼子T>C）。其余突變均在非編碼區(qū)，而且大部分都在啟動(dòng)子區(qū)。Morsci等［12］在安格斯牛的啟動(dòng)子區(qū)也檢測(cè)到了8個(gè)突變，張良志等［13］在秦川牛的啟動(dòng)子區(qū)也檢測(cè)到了11個(gè)突變。因此，在今后的研究中將重點(diǎn)開(kāi)展脂聯(lián)素啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性研究。

Botstein等提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)（PIC）。當(dāng)PIC>0.5時(shí),該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.5>PIC>0.25時(shí),該位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)PIC<0.25時(shí),該位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)。本試驗(yàn)對(duì)脂聯(lián)素基因的第2外顯子+67G>C位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn),歐拉型藏羊雜合度和多態(tài)信息含量最高,說(shuō)明歐拉型藏羊在本研究中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)處選擇的遺傳潛力最大。本研究結(jié)果表明，脂聯(lián)素基因在不同的品種中具有豐富的多態(tài)性,這為進(jìn)一步分析其與脂肪等性狀的關(guān)系,進(jìn)而確定能否用于甘肅藏羊的脂肪沉積的選擇標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。

Dai等［14］在豬的外顯子2中發(fā)現(xiàn)一處錯(cuò)義突變A/G（第59位的纈氨酸被替換為異亮氨酸），在內(nèi)含子2中也發(fā)現(xiàn)了一處突變（第298位A/G），并通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)這兩處突變與豬的部分脂肪沉積性狀和胴體性狀（背膘厚，眼肌面積，瘦肉率，骨的比例，平均脂肪量，肩部背膘厚等）有關(guān)聯(lián)。楊彥杰等［10］在脂聯(lián)素基因第2外顯子64 bp處和第3外顯子50 bp處發(fā)現(xiàn)的兩處突變都發(fā)生在編碼區(qū),并且導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變。在對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)突變與胴體及肉質(zhì)關(guān)聯(lián)性分析的結(jié)果表明：脂聯(lián)素基因與秦川牛胸圍、眼肌面積、背膘厚、胴體腿臀圍方面密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步將脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)不同基因型與甘肅藏羊產(chǎn)肉和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析表明，GG、GC基因型個(gè)體的宰前活重、胴體重均顯著高于CC型個(gè)體（P<0.05），這與楊彥杰等［10］在秦川牛中的研究結(jié)果一致。因此，初步推測(cè)脂聯(lián)素基因第2外顯子+67G>C位點(diǎn)可能是控制甘肅藏羊宰前活重和胴體重的一個(gè)主效基因或是與之存在緊密遺傳連鎖的分子標(biāo)記，但由于本研究的樣本數(shù)量較少，因此有必要進(jìn)行更大樣本量或?qū)ζ渌贩N進(jìn)行分析驗(yàn)證。

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SNPs of Adiponectin Gene and Its Relationship with Meat Traits in Tibetan Sheep

YangShu-meng，Ma Deng-lu，GuoShu-zhen，et al
（Gannan Institute ofAnimal Sciences，Hezuo747000，Gansu，China）

Gansu Tibetan sheep（Euler type，Ganga type，Choco type）（n=176）were used to detect SNPs of adiponectin gene by high-resolution melting（HRM）analysis and toanalyze the correlation ofSNPs with carcass and meat traits usingthe general linear model（GLM）.There was onlyone single nucleotide polymorphism（SNP）identified as SNP+67G>Cin exon2 ofadiponectin，results in a missense mutation from Glu to Gln.Statistical analysis revealed that Tibetan sheep with GG，GC genotype was higher than CC genotype in slaughter weight，carcass weight（P<0.05）.Adiponectin gene was proved to be closely related to carcass and meat traits，which could be used as a candidate molecular marker for production ofhigh-grade meat in Tibetan sheep.

adiponectin gene；SNPs；meat traits；Tibetan sheep

S826.2

A

2095-3887（2014）02-0005-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.001

2013-11-27

楊樹(shù)猛（1976-），男，高級(jí)畜牧師。

馬登錄（1970-），男，高級(jí)畜牧師。