張春香，秦 雪，鄭亞琳，張彩霞，岳文斌，任有蛇，靳 黎

（山西農業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801）

谷氨酰胺和IGF-I對晉嵐絨山羊卵母細胞體外成熟的影響

張春香，秦 雪，鄭亞琳，張彩霞，岳文斌，任有蛇，靳 黎

（山西農業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801）

為了探討在成熟培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和IGF-I對晉嵐絨山羊母羔卵母細胞體外成熟的影響。隨機選擇12只6～8周齡晉嵐絨山羊母羔為試驗動物，用FSH進行超數排卵，活體采集卵母細胞，并對未成熟的卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng)。在培養(yǎng)液中添加0、50、100和150 μg/mL的谷氨酰胺及0、25、50和100 ng/mL的IGF-I。結果表明：培養(yǎng)液中谷氨酰胺添加量為100 μg/mL時，能顯著提高卵母細胞成熟率（P<0.05）；在培養(yǎng)液中添加100 μg/mL谷氨酰胺的基礎上，再添加50 ng/mL的IGF-I可以進一步顯著提高卵母細胞的成熟率（P<0.01）。

晉嵐絨山羊母羔；卵母細胞；體外成熟；谷氨酰胺；IGF-I

類胰島素樣生長因子（IGF-I）是一種常用的生長因子，通過自分泌或旁分泌的途徑，刺激各類細胞的增殖和生長［1］。IGF-I對卵母細胞的成熟是有雙向作用的，在一定濃度范圍內對卵母細胞的成熟有促進作用，但濃度過高對卵母細胞成熟就有一定的抑制作用。在牛卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加100 ng/mL的IGF-I顯著提高了卵母細胞的成熟率［2］。然而在水牛的成熟培養(yǎng)液中添加30 ng/mL的IGF-I可顯著提高卵母細胞的成熟率，當添加濃度增加到100 ng/mL時，卵母細胞成熟率與對照組無顯著差異［3］。IGF-I可使山羊無腔卵泡細胞的直徑增加，存活力提高［4］。體外成熟培養(yǎng)液添加谷氨酰胺可增強卵母細胞抗氧化作用，提高卵母細胞成熟率和受精后的胚胎發(fā)育率［5-6］。然而關于谷氨酰胺和IGF-I對山羊卵母細胞成熟影響的研究還較少。本研究利用6～8周齡晉嵐絨山羊羔羊超數排卵獲得的未成熟卵母細胞為研究對象，在成熟培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和IGF-I，以探尋山羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液中最佳的谷氨酰胺和IGF-I添加濃度，為改善羔羊超數排卵體外生產胚胎的效率提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗羔羊及超排方案 本試驗選用6～8周齡、體重相近、營養(yǎng)狀況及健康狀況良好的12只晉嵐絨山羊母羔作為超數排卵對象，于早晨9：00和下午5：00分2次注射FSH 4 mg（BIONICHE Animal Health Canada INC），連續(xù)注射2 d，最后1次注射FSH時同時注射PMSG400 IU

（寧波三生藥業(yè)有限公司）。每次處理2只。試驗動物由山西農業(yè)大學動物科技學院生態(tài)畜牧站提供。

1.1.2 卵母細胞的采集 采用手術活體取卵法。試驗羔羊空腹12 h后進行卵母細胞采集。試驗前用0.02 mg/kg的靜松靈進行麻醉，頭部朝下倒置仰臥保定于專用手術架上，局部消毒后，腹部切口打開腹腔，用食指和中指拉出子宮和卵巢，用帶有采卵液2 mL一次性注射器從直徑大于2 mm卵泡中抽吸，在體視鏡下?lián)斐鲂螒B(tài)正常、胞質均勻的卵丘卵母細胞復合體，記錄每只羔羊所獲得的可用卵母細胞數。

1.2 卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)

在體視鏡下將A級卵丘細胞—卵母細胞復合體（COCs）撿出，統(tǒng)計卵母細胞數量。用預熱的采卵液（TCM199 9.5 mg/mL，NaHCO32.2 mg/mL，hepes 5.958 mg/mL，BSA 3 mg/mL，heparin 10 μg/mL，2%（v/v）P-S）洗3次，再隨機分配到卵母細胞的成熟培養(yǎng)液，用基礎成熟液（TCM199 9.5 mg/mL，NaHCO32.2 mg/mL，hepes 5.958 mg/mL，sodium pyruvate 0.3 mmol/L，10%FBS，2%（v/v）P-S）沖洗2次，備用。

試驗1：將每次收獲的卵母細胞平均分為4份，放入預平衡好的四孔板（成熟培養(yǎng)液600 μL，覆蓋石蠟油280 μL），在基礎培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺，使4個孔中成熟培養(yǎng)液中谷氨酰胺的終濃度分別達到 0、50、100和 150 μg/mL。每孔卵母細胞的數量 25～40個。于38.6℃、5%CO2和100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。該試驗重復3次。

試驗2：培養(yǎng)過程和重復次數同試驗1。在含試驗1篩選最佳添加濃度谷氨酰胺成熟培養(yǎng)液的基礎上，其中3孔分別添加25、50和100 ng/mL的IGF-I，1孔為對照組，不添加谷氨酰胺和IGF-I。

1.3 卵母細胞的成熟鑒定

通過觀察卵母細胞形態(tài)來判斷成熟情況，成熟卵母細胞周圍的顆粒細胞擴散，呈放射狀。放入0.1%的透明質酸酶中，用玻璃細管反復吹打卵母細胞，至完全除去卵丘細胞為止。撥動卵母細胞進行觀察，以排出第一極體（PBI）作為卵母細胞成熟的標志。

1.4 細胞計數及統(tǒng)計分析

試驗結束后在體視顯微鏡下觀察記錄排出第一極體的成熟卵母細胞的數量，計算成熟卵母細胞所占百分比。數據用SAS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 卵母細胞的形態(tài)學觀察

未成熟卵母細胞和成熟卵母細胞形態(tài)學分別見圖1和圖2。圖1為未成熟卵母細胞，胞質均勻，外層包裹著3層以上的卵丘顆粒細胞；圖2為成熟卵母細胞，在400倍下可以清晰地觀察到排出的第一極體。

2.2 培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺對卵母細胞成熟的影響

該試驗組6只晉嵐絨山羊母羔超排共收獲可用的COCs 404個，平均每只收獲可用67.3個±13.6個。圖3結果顯示，與對照組相比，成熟液中添加50、100和150 μg/mL谷氨酰胺卵母細胞成熟率分別增加了6.74%、27.74%和11.12%，添加100 μg/mL谷氨酰胺組的成熟率顯著高于 50 μg/mL組和 150 μg/mL組（P<0.05），極顯著高于對照組（P<0.01）。添加150 μg/mL組顯著高于對照組（P<0.05）。由此可知，體外成熟液中谷氨酰胺的最佳添加濃度為100 μg/mL。

圖3 培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺對卵母細胞成熟的影響

2.3 培養(yǎng)液中添加IGF-I對卵母細胞成熟的影響

該試驗組6只晉嵐絨山羊母羔超排共收獲可用COCs 416個，平均每只收獲可用69.3個±7.8個。在含有100 μg/mL谷氨酰胺的體外成熟液中添加不同濃度

的IGF-I對卵母細胞成熟率影響的結果見圖4。與對照組相比，成熟液中添加25、50和100 ng/mL的IGF-I卵母細胞成熟率分別增加了8.68%、32.55%和19.71%，添加50 ng/mL和100 ng/mL的IGF-1組的成熟率顯著高于25 ng/mL（P<0.05），極顯著高于對照組（P<0.01）。添加25 ng/mL組又顯著高于對照組（P<0.05）。

圖4 培養(yǎng)液中添加IGF-I對卵母細胞成熟的影響

3 討論

3.1 谷氨酰胺對卵母細胞成熟的影響

氨基酸在卵母細胞體外成熟過程中作用顯著，尤其谷氨酰胺是體液中最豐富的氨基酸之一，一直是研究者們研究的熱點。谷氨酰胺是L-谷氨酸的羧基酰胺化物，對維持細胞體積，增加細胞內蛋白質合成有一定作用。另外，成熟卵母細胞細胞質中的GSH（谷胱甘肽）濃度可反映卵母細胞細胞質的成熟程度［7］。而卵母細胞GSH合成是以半胱氨酸以及谷氨酰胺作為底物。加入這兩種氨基酸不論是對哺乳動物的卵母細胞細胞質的成熟，還是細胞核的成熟都有著很大的益處［8］。本試驗結果表明，在一定范圍內，隨著谷氨酰胺濃度的增加，卵母細胞體外成熟率呈現上升趨勢，這一研究結果與目前關于谷氨酰胺的報道相一致［6，9］，并確定了山羊卵母細胞體外成熟液中谷氨酰胺的最佳添加劑量為100 μg/mL。

3.2 IGF-I對卵母細胞成熟的影響

IGF-I在調節(jié)卵泡的生長發(fā)育方面起著重要作用，在未成熟的卵母細胞和成熟卵母細胞中均有IGF-I和IGF-IR表達［10］。IGF-I的主要功能在于促進由FSH介導的顆粒細胞的分化和增殖，使得卵母細胞的體外活力和生長能力得以提高。但IGF-I對卵母細胞的成熟是有雙向作用的，在一定濃度范圍內對卵母細胞的成熟有促進作用。本試驗結果表明，添加IGF-I濃度在50ng/mL范圍內卵母細胞的成熟率呈現上升趨勢，與魯進等在山羊體外成熟培養(yǎng)液中添加20 ng/mL和30 ng/mL的IGF顯著提高了成熟率的研究結果一致［11］。然而當IGF-I添加量增加到100 ng/mL時，卵母細胞成熟率低于50 ng/mL組，表明高濃度的IGF-I對卵母細胞成熟有明顯的抑制作用。

4 結論

培養(yǎng)液中同時添加100 μg/mL谷氨酰胺和50 ng/mL的IGF-I可以顯著提高晉嵐絨山羊卵母細胞的體外成熟率。

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doi:10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.008

Effect of Glutamine and IGF-I on the Oocyte maturation of Jinlan Cashmere Goats

ZhangChun-xiang，Qin Xue，Ren You-she，et al
（Animal Science College，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The objective ofthe study was to investigate the effect of glutamine and IGF-I on oocyte maturation in Jinlan Cashmere goats.Twelve 6-8 week-old Jinlan cashmere female kids were selected to superovulate by FSH injection.The immature oocytes were collected by ovum pick-up,and culture in vitro maturation with supplementation of different concentration of glutamine（0，50，100 and 150 μg/mL）and IGF-I（0，25，50 and 100 ng/mL）in maturation media.The results showed that the maturation rate of oocytes could be significantly improved by adding 100 μg/mL glutamine to the maturation media（P<0.05).After addition 100 μg/mLglutamine，adding50 ng/mLIGF-I could markedlyincrease the rate ofoccytes maturation（P<0.01）.

Jinlan cashmere female kids；oocyte；in vitro maturation；glutamine；IGF-I

S827.3

A

2095-3887（2014）05-0026-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.007

2014-08-14

山西省科技攻關計劃項目（20110311029）

張春香（1972-），女，副教授，博士，主要從事動物營養(yǎng)與繁殖生理學方面的研究。

任有蛇（1970-），男，副教授，碩士生導師，主要從事動物繁殖方面的研究。