安外爾·熱合曼，吐來力江·哈木太，馬曉燕，依明·蘇來曼，決肯·阿尼瓦什（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

吐魯番黑羊MSTN/Smad信號通路基因表達(dá)的發(fā)育性變化

安外爾·熱合曼，吐來力江·哈木太，馬曉燕，依明·蘇來曼，決肯·阿尼瓦什（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

為探討MSTN/Smad信號通路基因?qū)ν卖敺谘蚣∪馍L發(fā)育的影響，采用實(shí)時(shí)定量PCR法，分別對1～6月齡吐魯番黑羊的腿肌和尾脂MSTN/Smad信號通路基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：MSTN/Smad信號通路基因在腿肌和尾脂組織中均有表達(dá)，MSTN/Smad信號通路基因在吐魯番黑羊不同生長階段的腿肌和尾脂中的表達(dá)沒有出現(xiàn)隨月齡的增加而一直增加或下降的趨勢。

吐魯番黑羊；MSTN/Smad信號通路基因；基因表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

吐魯番黑羊主要生長在新疆吐魯番地區(qū)的托克遜縣，故又叫“托克遜黑羊”。吐魯番黑羊頭中等大，耳大下垂。公羊鼻梁隆起，具有較大的螺旋形角。母羊鼻梁稍有隆起，無角。頸中等長，額部有長毛，臉部有短毛。吐魯番黑羊適應(yīng)夏季40℃以上高溫天氣和冬季嚴(yán)寒、多風(fēng)沙的吐魯番盆地氣候，能耐受粗纖維多、木質(zhì)化強(qiáng)、多刺的耐鹽堿、抗旱的牧草植物。吐魯番黑羊在嚴(yán)酷的自然氣候條件和粗放的飼管條件下，均能表現(xiàn)出生長發(fā)育快、四肢粗壯、早熟、肉味鮮美等特點(diǎn)，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民重要的生產(chǎn)和生活資料，在當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)中占有相當(dāng)重要的地位。

肌肉是動(dòng)物胴體最重要的組成部分，是畜牧生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。因此，增加肌肉產(chǎn)量和提高肌肉品質(zhì)一直是畜牧學(xué)家的主要研究目標(biāo)之一。1997年英國霍普金斯大學(xué)Mcpherron等利用簡并引物在小鼠身上偶然發(fā)現(xiàn)了肌肉生長抑制素（myostain，MSTN）基因。經(jīng)蛋白質(zhì)同源分析和核酸序列比對，證實(shí)其屬于TGF-β超家族成員，故又稱GDF-8［1］。MSTN基因編碼一個(gè)25 kD的

二聚體的糖蛋白［2］。該糖蛋白在骨骼肌中廣泛表達(dá)，其功能和表達(dá)量的變化可能會(huì)通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)而改變肌肉的纖維組成及造成肌肉重量的變化［3-4］。TGF-β家族成員主要是通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合,將信號傳遞到下游分子Smad，磷酸化的Smda分子入核，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［5］。

關(guān)于新疆地方綿羊品種mRNA水平基因表達(dá)的研究較少，已有的研究主要集中在對肌內(nèi)脂肪相關(guān)基因的熒光定量方面。目前關(guān)于吐魯番黑羊肉質(zhì)性狀形成的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，尤其是基因表達(dá)方面的研究還未見報(bào)道。因此，本文以吐魯番黑羊?yàn)檠芯繉ο?，利用相對定量RT-PCR技術(shù)，對1～6月齡吐魯番黑羊的腿肌和尾脂組織中MSTN/Smad信號通路基因mRNA水平的發(fā)育性變化進(jìn)行系統(tǒng)研究和比較分析，旨在為該羊的分子生物學(xué)研究及其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 動(dòng)物 試驗(yàn)羊均購自托克遜縣地方國營牧場。選擇飼養(yǎng)條件相同、生長發(fā)育良好、體重相近的1、2、3、4、5、6月齡吐魯番黑羊各5只。屠宰后，取腿肌和尾脂等組織樣品，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器設(shè)備 TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)為美國Thermo公司產(chǎn)品；SW-CJ-IF型超凈工作臺購自上海博訊公司；LightCycler2.0熒光定量PCR儀為Roche公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑盒及普通試劑 Trizol RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I熒光染料試劑盒、Taq酶、dNTP、DL2000、Marker等均購自TaKaRa公司，瓊脂糖（AgroseH）、無水乙醇、DEPC等試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

1．2 方法

1.2.1 吐魯番黑羊組織總RNA提取及cDNA合成 取液氮保存的各樣本組織約100 mg。用Trizol法提取總RNA。分別吸取2 μL總RNA溶液，采用分光光度計(jì)測定濃度；采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA質(zhì)量。檢測完成后將總RNA溶液迅速置于超低溫冰箱中（-80℃）保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank公布的綿羊基因序列，采用Primer 5.0軟件分別對MSTN、Smad2、Smad3、Smad4、TGFBR1、TGFBR2設(shè)計(jì)一對引物，由生工生物（上海）有限公司合成。6個(gè)基因的引物序列見表l。

1.2.3 cDNA的合成 提取的總RNA按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。后-20℃保存。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

1.2.4 目的基因的定量 將合成的cDNA產(chǎn)物按熒光定量的要求做濃度稀釋,使用ABI79（X）型熒光定量PCR儀對各組織中的MSTN/Smad信號通路基因和β-actin基因進(jìn)行定量分析。具體反應(yīng)體系：RNase Free ddH2O 9.4 μL，10 μmol/L上、下引物各1.0 μL。2×SYBR Premix EX Taq 10 μL，cDNA模板2.0 μL。MSTN反應(yīng)條件：95℃10 s（預(yù)變性）；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃10 s；65～95℃升溫0.5℃/s（Plate Read）。以β-actin為對照，對MSTN/Smad基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行校正。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 Roche公司Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀所得的循環(huán)閾值（Ct）數(shù)據(jù)應(yīng)用Delta-Delta Ct方法進(jìn)行相對定量分析,內(nèi)參及目的基因的相對表達(dá)水平應(yīng)用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)分析對象均取3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值,每次試驗(yàn)用ddH2O為陰性對照。利用2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2．1 RNA純度和完整性分析

提取的總RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后可見較

清晰的28S、18S和5SRNA帶。其中5S帶較淺，表明RNA無明顯降解（圖1）。經(jīng)分光光度計(jì)檢測，A260/A280比值在1.8～2.0，表明RNA的純度高，適宜進(jìn)行定量分析。

圖1 總RNA2%凝膠瓊脂糖鑒定結(jié)果

2．2 MSTN/Smad信號通路基因mRNA相對表達(dá)量比較

從表2可見，1～6月齡吐魯番黑羊的腿肌和尾脂在不同生長階段之間MSTN/Smad表達(dá)存在顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）差異，每個(gè)月齡肌肉中的表達(dá)量明顯高于對應(yīng)月齡尾脂的表達(dá)量。MSTN基因在4月齡肌肉中的表達(dá)量最高；Smad4在5月齡肌肉中表達(dá)量最高，在6月齡尾脂中的表達(dá)量最低；Smad3的表達(dá)量無論是在腿肌還是尾脂中均比Smad2低。TGFBR2在1月齡腿肌中的表達(dá)量最高，在2月齡尾脂中的表達(dá)量最低。表明生長階段對于MSTN/Smad信號通路基因在綿羊腿肌和尾脂組織中的表達(dá)具有重要影響。

表2 MSTN/Smad信號通路基因在吐魯番黑羊不同月齡和組織中的表達(dá)

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)MSTN與肌肉生長發(fā)育特別是雙肌臀形成有關(guān)后，關(guān)于MSTN的作用機(jī)制便成為研究的熱點(diǎn)問題［6］。越來越多的研究結(jié)果顯示，MSTN可能通過 TGFBR/Smad通路發(fā)揮作用。具體作用途徑：MSTN首先在成肌細(xì)胞中合成前體蛋白，前體蛋白經(jīng)過一次酶切后去除24個(gè)氨基酸的信號肽部分，接著在RSRR位點(diǎn)經(jīng)過第2次酶切，產(chǎn)生了N-端和C-端片段［5］。C-端被切割后，片段之間通過二硫鍵相連形成二聚體，折疊成胱氨酸的結(jié)構(gòu)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，將不同濃度的外源性表達(dá)的MSTN蛋白質(zhì)加入到C2C12成肌細(xì)胞的培養(yǎng)物中，隨著MSTN濃度的增加，成肌細(xì)胞的繁殖速度相應(yīng)減慢［8-9］。這表明，MSTN表達(dá)量的升高會(huì)造成肌肉生長速度的下降。在本研究中MSTN基因在4月齡吐魯番黑羊腿肌中表達(dá)量最高，在6月齡尾脂中的表達(dá)量最低。Smad2基因在腿肌與尾脂中的表達(dá)量明顯高于Smad3相應(yīng)月齡的表達(dá)量。TGFBR2基因的表達(dá)量高于TGFBR1的表達(dá)量。結(jié)果表明：MSTN/Smad信號通路基因在吐魯番黑羊中沒有出現(xiàn)隨月齡增加而一直升高或降低的趨勢。

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Developmental Changes of Expression of MSTN/Smad Signaling Pathway Genes in Turpan Black Sheep

Anwaier·Rehemam，Tulailijiang·Hamutai，Jueken·Aniwash，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

In order to explore the developmental changes of expression of MSTN/Smad signaling pathway genes on the muscle growth and development in Turpan black sheep duringthe age of1～6 months，the expression level of MSTN/Smad signaling pathway genes in the leg muscle and tail fat tissues were detected with Real time quantitative PCR.The results showed that the MSTN/Smad signaling pathway genes were expressed both in the leg muscle and tail fat tissues，but no continuous change trends were found.

Turpan black sheep；MSTN/Smad signalingpathwaygene；gene expression；Real-time PCR

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0012-03

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．003

2014-02-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260530）

安外爾·熱合曼（1986-），男，維吾爾族，碩士研究生。

決肯·阿尼瓦什（1962-），男，哈薩克族，教授，博士。研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。