龍 柯，李 響，謝通慧，張永奎，劉文彬

科研與開發(fā)

以油莎豆為原料發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠的研究*

龍 柯，李 響，謝通慧，張永奎，劉文彬

（四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院制藥與生物工程系，四川成都610065）

為降低威蘭膠生產(chǎn)成本，提高其產(chǎn)量，以油莎豆為原料，通過提取油脂、蛋白質(zhì)和水解等處理，制得豆餅粕水解液作為底物，發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠。結(jié)果表明：在不添加其他氮源或營(yíng)養(yǎng)鹽條件下，以水解液為底物生產(chǎn)威蘭膠，產(chǎn)量為24.12g·L-1，較葡萄糖發(fā)酵組提高26.68%，威蘭膠產(chǎn)品的剪切性能值為4.40。使用油莎豆粕水解液發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠，發(fā)酵培養(yǎng)基中不需添加額外碳氮源，產(chǎn)量和剪切性能均優(yōu)于利用葡萄糖發(fā)酵的結(jié)果。由此可見，油莎豆是生產(chǎn)威蘭膠的一種優(yōu)質(zhì)原料。

廉價(jià)底物；油莎豆水解液；威蘭膠；發(fā)酵

威蘭膠（Welan Gum）是由鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.ATCC 31555經(jīng)好氧發(fā)酵生成的一種胞外多糖[1]。威蘭膠具有熱穩(wěn)定性、增粘性、觸變性以及假塑性等理化性質(zhì)，在石油開采及混凝土等諸多方面得到廣泛應(yīng)用，是比黃原膠和結(jié)冷膠更具市場(chǎng)前景的微生物代謝多糖[2，3]。研究表明，蔗糖或葡萄糖是發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠的較優(yōu)碳源，酵母膏或蛋白胨為較優(yōu)氮源[4-6]。然而，這些生化原料價(jià)格不菲，使得威蘭膠生產(chǎn)成本較高，極大地限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，尋找一種廉價(jià)底物代替?zhèn)鹘y(tǒng)碳氮源生產(chǎn)威蘭膠就顯得極為必要和迫切。國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用廉價(jià)原料發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠的報(bào)道較少，僅見姬彬[7]利用甘蔗糖蜜、粗甘油、果葡糖漿及木薯淀粉等廉價(jià)碳源進(jìn)行發(fā)酵威蘭膠研究。結(jié)果表明：前3種碳源發(fā)酵威蘭膠產(chǎn)量不夠理想，以木薯淀粉水解液為底物時(shí)威蘭膠產(chǎn)量為21.2g·L-1，與以葡萄糖為碳源時(shí)的產(chǎn)膠量相當(dāng)，威蘭膠產(chǎn)量并未得到較大提高，且發(fā)酵培養(yǎng)基中需額外添加豆粕作為氮源，這也增加了生產(chǎn)成本。

油莎豆（Cyperus esculentus）是一種莎草科草本植物，其具有含油量較高，抗逆性極強(qiáng)，對(duì)土壤要求不嚴(yán)格，易于栽培管理等特點(diǎn)，且不與大豆、花生、油菜等草本油料作物及水稻、玉米等主糧食作物爭(zhēng)地，可規(guī)模推廣種植，是理想的生物質(zhì)能源原料[8-10]。目前，油莎豆主要用于制備生物柴油，提取油脂后所得豆粕廢棄不用，其富含的淀粉、糖分和蛋白質(zhì)的價(jià)值沒有得以利用，同時(shí)還造成了環(huán)境污染。目前，國(guó)內(nèi)外開展了以油莎豆餅粕為原料生產(chǎn)燃料酒精[11]、微藻生物油脂[12]等的研究，都取得了一定進(jìn)展。本研究以油莎豆餅粕為威蘭膠的生產(chǎn)原料，既可降低威蘭膠生產(chǎn)成本，又可實(shí)現(xiàn)油莎豆餅粕的綜合利用，解決環(huán)境問題。

以油莎豆粕水解液（C.esculentus waste hydrolysate，CEWH）作為底物，不再添加其他氮源發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，并獲得較高產(chǎn)量是本研究的主要任務(wù)。本論文對(duì)油莎豆成分進(jìn)行了分析，研究了不同碳源和營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，對(duì)發(fā)酵過程中菌體、產(chǎn)物、殘?zhí)菨舛冗M(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)生產(chǎn)的威蘭膠進(jìn)行了剪切性能檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.ATCC31555購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，即ATCC）；油莎豆產(chǎn)自新疆克拉瑪依市，樣品曬干后粉碎，粒度控制在85%，通過80目，混勻，烘干待用。

1.2 培養(yǎng)基

Sphingomonas培養(yǎng)基（g·L-1）:葡萄糖15；酵母膏2；蛋白胨5；牛肉浸膏3；pH值為7.0，1×105Pa滅菌20min。

油莎豆水解液發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）:制備的油莎豆粕水解液，pH值為7.0，1×105Pa滅菌20min。

葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）:葡萄糖50；蛋白胨3；K2HPO42；MgSO4·7H2O0.5；CaCO32；pH值為7.0，1×105Pa滅菌20 min。

1.3 方法

水解液的制備：將粉碎研磨好的油莎豆粉末用正己烷溶液浸出提取油脂后，在堿性條件下提取蛋白質(zhì)，最后利用200μ·g-1α-淀粉酶和100μ·g-1糖化酶水解油莎豆餅粕，制得水解液。提取油脂時(shí)的料液比、混合時(shí)間，以及提取蛋白質(zhì)時(shí)的浸泡時(shí)間按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而定。

細(xì)胞培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)：將4℃保存的斜面種子于平板劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于種子培養(yǎng)基上，搖床180r·min-1、30℃培養(yǎng)28h；再以10%接種量接種于種子培養(yǎng)基上，同等條件培養(yǎng)24h，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，搖床180r·min-1、30℃發(fā)酵培養(yǎng)72h。

威蘭膠產(chǎn)量測(cè)定：0.05g KCl添加到20mL發(fā)酵液中，待其完全溶解后，與95%乙醇按1∶3體積比混合，攪拌得膠體沉淀，洗滌，離心，收集威蘭膠沉淀，50℃烘干至恒重，粉碎，稱重得威蘭膠樣品。

膠復(fù)溶液制備：將1.0g威蘭膠產(chǎn)品溶解到350 mL濃度為42g·L-1的NaCl溶液中。

油脂提取：采用溶劑浸出法，按料液比8∶1加入正己烷，在渦旋混合儀上振蕩混合2min，1700 r· min-1離心5 min，取上清液真空旋蒸得到油脂。

蛋白質(zhì)提?。翰捎脡A提酸沉法[13]，按料液比1∶10，使用2mol·L-1NaOH溶液將pH值調(diào)至10的堿性條件下，浸泡1.5h離心提取上清液，調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn)4.8，提取蛋白質(zhì)。

根據(jù)GB/T5009.3，采用直接干燥法對(duì)含水率進(jìn)行測(cè)定[14]。根據(jù)GB/T5009.5，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[14]。根據(jù)GB/T5009.6，采用索氏提取法測(cè)定油脂含量[14]。采用旋光法對(duì)淀粉含量進(jìn)行測(cè)定[15]。采用灼燒法對(duì)灰分含量進(jìn)行測(cè)定[16]?？偺呛蜌?zhí)菨舛鹊臏y(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法。含鞘氨醇單胞菌溶液稀釋10倍后利用紫外分光光度計(jì)在600nm處測(cè)定生物量。用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)（上海恒平科學(xué)儀器有限公司，4號(hào)轉(zhuǎn)子，分別在6和60r·min-1），于室溫條件下測(cè)定黏度。

1.4 計(jì)算公式

2 結(jié)果與討論

2.1 油莎豆成分、預(yù)處理及水解

2.1.1 油莎豆成分油莎豆含有豐富的油脂、淀粉、糖類、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分。根據(jù)上述方法對(duì)實(shí)驗(yàn)所用油莎豆進(jìn)行分析，其主要成分結(jié)果見表1。

表1 油莎豆主要成分分析Tab.1 The principal constituents of the Cyperus esculentus

分析結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本吻合，淀粉含量為31.1%，表明所用油莎豆適宜作為生產(chǎn)威蘭膠的原料，其淀粉成分經(jīng)水解后產(chǎn)生的葡萄糖可作為發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠的碳源，蛋白質(zhì)可作為發(fā)酵的氮源。

2.1.2 原料的預(yù)處理前期以可溶性淀粉作為唯一碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，未檢測(cè)到威蘭膠的生成，表明鞘氨醇單胞菌不能分泌胞外淀粉酶，不能直接利用可溶性淀粉作為碳源進(jìn)行發(fā)酵。因此，油莎豆餅粕需要經(jīng)過進(jìn)一步水解才能被利用。

油莎豆預(yù)處理過程見圖1。

圖1 油莎豆粕水解液制備流程Fig.1 Preparation flow diagram of CEWH

采用溶劑浸出法，油脂提取率可達(dá)到88%。提取油脂后的油莎豆餅粕中殘余油脂量約為3%。有研究結(jié)果表明，大豆油等油脂可作為氧載體，改善發(fā)酵系統(tǒng)供氧情況，提高胞外多糖產(chǎn)率[17]。因此，少量的殘油不僅不會(huì)對(duì)威蘭膠發(fā)酵產(chǎn)生不利影響，反而可以促進(jìn)發(fā)酵過程。

為保證豆粕中總糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比（即C/N）在適合微生物胞外多糖合成的范圍，需提取豆粕中部分蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)提取率達(dá)到37.79%，豆粕中總糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比（即C/N）為13.1。

2.1.3 水解結(jié)果利用雙酶法（α-淀粉酶、糖化酶）水解油莎豆餅粕結(jié)果見表2。

表2 油莎豆水解結(jié)果Tab.2 Results of Cyperus esculentus hydrolysis

通過水解得到10.96g還原糖和1.42g蛋白質(zhì)供后續(xù)發(fā)酵中分別作為碳源和氮源使用。

2.2 發(fā)酵過程優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵的影響實(shí)驗(yàn)分別以水解液、葡萄糖以及水解液葡萄糖混合物為碳源進(jìn)行發(fā)酵，研究不同碳源對(duì)威蘭膠產(chǎn)量的影響，碳源濃度梯度設(shè)計(jì)見圖2。

圖2 不同碳源對(duì)威蘭膠產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on welan gum yield

圖2 表明，以純水解液為碳源時(shí)，威蘭膠產(chǎn)量最高。以純葡萄糖為碳源的威蘭膠產(chǎn)量最低。在混合碳源體系中，隨著水解液混合濃度逐漸降低，威蘭膠產(chǎn)量也不斷降低。具體地對(duì)比分別以純水解液和純葡萄糖為碳源發(fā)酵威蘭膠的結(jié)果，見表3。

表3 威蘭膠發(fā)酵結(jié)果對(duì)比Tab.3 Comparison between the experimental and the control group in welan fermentation

由表3可以看出，水解液組的產(chǎn)物濃度高于葡萄糖組，達(dá)到了24.12g·L-1，與劉汝冰[6]、李莎[4]等人優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基后的結(jié)果（產(chǎn)量分別為21.77和22. 85g·L-1）相當(dāng)。另外，還原糖利用率也明顯高于傳統(tǒng)的葡萄糖培養(yǎng)基。各項(xiàng)對(duì)比數(shù)據(jù)中，只有發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)胞濃度略低于葡萄糖組。

油莎豆粕水解液是一個(gè)較為復(fù)雜的溶液系統(tǒng)，除了油脂、糖類和蛋白質(zhì)等主要成分外，還含有Al、Ca、Fe、K、Mg、Na及P等礦物質(zhì)[18]。葡萄糖在威蘭膠合成過程中具有兩條代謝通路：（1）轉(zhuǎn)化為構(gòu)成威蘭膠的前體核苷酸糖；（2）通過中心代謝途徑合成菌體細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)[19]。這些礦物鹽的金屬離子可以激活葡萄糖磷酸變位酶、UDP葡萄糖焦磷酸化酶、dTDP葡萄糖焦磷酸化酶等威蘭膠合成關(guān)鍵酶[20]，使得更多葡萄糖通過第一條代謝通路合成前體核苷酸糖，相應(yīng)地減少第二條代謝通路的通量，使得威蘭膠產(chǎn)量增加，鞘氨醇單胞菌細(xì)胞量相應(yīng)降低。因此，水解液組中細(xì)胞濃度較低，而還原糖利用率和產(chǎn)物濃度較高。這說明以水解液為底物，單個(gè)鞘氨醇單胞菌細(xì)胞能分泌更多威蘭膠產(chǎn)品。綜上所述，純水解液是比混合碳源體系或純葡萄糖更優(yōu)的威蘭膠發(fā)酵底物。

2.2.2 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)發(fā)酵的影響磷是菌體核酸、輔酶和高能磷酸鍵組成成分，其在能量轉(zhuǎn)變過程中起關(guān)鍵作用。鎂被稱為生命活動(dòng)的激活劑，是細(xì)胞中許多酶的激活劑。在水解液發(fā)酵系統(tǒng)中也考察了K2HPO4·3H2O在0～5g·L-1的濃度范圍內(nèi)和MgSO4· 7H2O在0～1g·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)威蘭膠發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 K2HPO4·3H2O濃度（a）和MgSO4·7H2O（b）濃度對(duì)威蘭膠產(chǎn)量的影響Fig.3 Welan gum yield with the concentration of K2HPO4·3H2O（a）and MgSO4·7H2O（b）

利用origin 8.5軟件對(duì)在水解液發(fā)酵系統(tǒng)中添加K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O對(duì)威蘭膠產(chǎn)量影響進(jìn)行顯著性分析。K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O的P值分別為0.2431和0.129，說明兩者均不是影響威蘭膠產(chǎn)量的顯著因素。

從圖3可以看出，隨著MgSO4·7H2O濃度的增加，威蘭膠產(chǎn)量變化不大；隨K2HPO4·3H2O濃度的增加，威蘭膠產(chǎn)量反而降低。這一現(xiàn)象是因?yàn)樵谒庖哼@一混合系統(tǒng)中所含有的磷、鎂等營(yíng)養(yǎng)元素已經(jīng)能夠滿足威蘭膠發(fā)酵的需要。添加K2HPO4·3H2O后，發(fā)酵液中磷元素含量過高，反而會(huì)抑制鞘氨醇單胞菌細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響威蘭膠產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)證明，油莎豆粕水解液中磷、鎂等營(yíng)養(yǎng)元素可以滿足鞘氨醇單胞菌細(xì)胞生產(chǎn)和分泌威蘭膠的需要，無需額外添加K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O。

2.3 優(yōu)化條件下發(fā)酵結(jié)果

2.3.1 搖瓶發(fā)酵過程曲線以制備的水解液為發(fā)酵液，搖床轉(zhuǎn)速180r·min-1在30℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)72h。發(fā)酵過程曲線見圖4。

圖4 搖瓶發(fā)酵過程曲線Fig.4 The curve of welan fermentation in shake-flask culture

菌體生長(zhǎng)有較短的延滯期（0～4h），之后隨著底物在8～48h內(nèi)快速消耗，菌體快速生長(zhǎng)，威蘭膠隨菌體生長(zhǎng)而大量合成。48h生物量達(dá)到最大，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，基質(zhì)濃度較低，消耗速率下降，威蘭膠合成速度緩慢。54h后，由于基質(zhì)的消耗和環(huán)境因素的影響，細(xì)胞逐漸進(jìn)入衰亡期，部分細(xì)胞出現(xiàn)自溶，菌體濃度開始下降。

菌體的延滯期為0～4h，短于李會(huì)等人[21]的研究結(jié)果（0～8h）。這可能是由于本實(shí)驗(yàn)使用的鞘氨醇單胞菌菌種前期經(jīng)過了兩次活化，使得菌體更快地適應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境，延滯期縮短，這有利于增加菌體分泌威蘭膠的時(shí)間。

2.3.2 威蘭膠剪切性能檢測(cè)威蘭膠在低剪切率時(shí)黏度很高，隨著剪切率升高，其黏度隨之減少。這一優(yōu)越的剪切性能使威蘭膠在石油（作為調(diào)配鉆井泥漿和新型驅(qū)油劑）、混泥土（增強(qiáng)泥漿保水性）等工業(yè)中有廣泛應(yīng)用前景。因此，有必要對(duì)油莎豆粕水解液發(fā)酵生產(chǎn)的威蘭膠與葡萄糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)的威蘭膠在剪切性能方面進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表4。

表4 威蘭膠剪切性能對(duì)比Tab.4 Comparison between the experimental gum and the control gum in shear properties

結(jié)果表明，兩組威蘭膠產(chǎn)品的pH值都在5.0～5.5范圍內(nèi)，這是因?yàn)橥m膠主鏈重復(fù)結(jié)構(gòu)上有一葡萄糖醛酸，因而產(chǎn)品復(fù)溶液呈酸性。兩組威蘭膠溶液的粘度都隨剪切速率增加而降低，具有明顯的剪切變稀特性。水解液發(fā)酵生產(chǎn)的威蘭膠在較低剪切率（6r·min-1）和較高剪切率（60r·min-1）時(shí)黏度均高于葡萄糖組，總體剪切性能值較葡萄糖組更高。這可能是由于威蘭膠與油莎豆水解液中的礦物質(zhì)產(chǎn)生某種交聯(lián)作用[22]，使剪切性能得以提高。說明油莎豆粕水解液發(fā)酵生產(chǎn)的威蘭膠性能良好，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值。

3 結(jié)論

對(duì)本研究所用油莎豆的成分分析表明其含油量為25.66%、淀粉含量為31.10%、蛋白質(zhì)含量為5.49%，淀粉含量較文獻(xiàn)報(bào)道含量略高，是低成本發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠的優(yōu)質(zhì)原料。研究了以水解液、葡萄糖以及水解液葡萄糖混合物為碳源對(duì)威蘭膠產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明以純水解液為碳源時(shí)威蘭膠產(chǎn)量最高，說明其更有利于菌體產(chǎn)膠。向水解液中添加K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)威蘭膠產(chǎn)量影響均不顯著，說明水解液中磷、鎂等營(yíng)養(yǎng)鹽可以滿足鞘氨醇單胞菌細(xì)胞生產(chǎn)和分泌威蘭膠的需要。在優(yōu)化條件下，搖瓶培養(yǎng)鞘氨醇單胞菌生產(chǎn)威蘭膠，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明菌體、殘?zhí)?、威蘭膠濃度變化符合微生物胞外多糖發(fā)酵的一般規(guī)律，威蘭膠產(chǎn)量可到達(dá)24.12g·L-1。對(duì)威蘭膠產(chǎn)品剪切性能進(jìn)行檢測(cè)，表明其剪切性能優(yōu)于葡萄糖發(fā)酵組。本研究證明油莎豆餅粕在無需添加其他碳源或氮源的情況下，通過水解處理可用作發(fā)酵生產(chǎn)威蘭膠的底物，且發(fā)酵產(chǎn)品在產(chǎn)量和剪切性能方面均優(yōu)于常規(guī)底物發(fā)酵產(chǎn)品，是一種優(yōu)質(zhì)的原料。本研究為以油莎豆為原料在更大規(guī)模生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)威蘭膠工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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Welan gum production from cyperus esculentus fermented by sphingomonas sp.ATCC 31555*

LONG Ke，LI Xiang，XIE Tong-hui，ZHANG Yong-kui*，LIUWen-bin
（Department of Pharmaceutical&Biological Engineering,School of Chemical Engineering,Sichuan University, Chengdu 610065,China）

To lower the production cost of welan gum and raise the production，how to utilize the C.esculentus waste hydrolysate（CEWH）,which has been extracted its oil and part of the protein,as the substrate to ferment welan gum was investigated.Under the condition of using CEWH as substrate,and adding neither nitrogen source nor nutritive salt,the production of welan gum reached the maximum of 24.12g·L-1,which was 26.68%more than that of using glucose to ferment.The values of shear properties of welan gum also come to 4.40.When using the C. esculentus waste hydrolysate to ferment the welan gum,there is no need to add other carbon source nor nitrogen source in the fermentation medium and both the production as well as the sheer properties are better than the results of using glucose to ferment.Thus,the C.esculentus is a cheap and high quality raw material to produce the welan gum.

cheap substrates；C.esculentus waste hydrolysate（CEWH）；welan gum；fermentation

1002-1124（2014）08-0001-05

2014-04-24

科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項(xiàng)目（No.10C26215104937）;四川省科技型中小企業(yè)早期科技創(chuàng)新省級(jí)扶持資金無償補(bǔ)助項(xiàng)目;國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No. 201210610036）

龍柯（1987-），男，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵研究。

劉文彬（1981-），男，講師，理學(xué)博士，主要從事應(yīng)用微生物方向研究。

Q93

A