董 征, 孫雪冬, 滿秋紅, 姚 波, 李玉芳, 劉鐵強, 黃 珊, 劉廣賢, 艾輝勝, 郭 梅

(解放軍307醫(yī)院, 北京 100071)

nm23-M1基因在小鼠粒單核細胞白血病中的表達

董 征, 孫雪冬, 滿秋紅, 姚 波, 李玉芳, 劉鐵強, 黃 珊, 劉廣賢, 艾輝勝, 郭 梅

(解放軍307醫(yī)院, 北京 100071)

目的 探討nm23-M1基因在小鼠粒單核細胞白血病中的表達。方法 給小鼠經尾靜脈注射粒單核細胞白血病細胞株WEHI-3,同時選取正常小鼠作為對照組，取發(fā)病小鼠以及正常小鼠的骨髓,采取qRT-PCR的方法檢測nm23-M1基因的表達情況，分析其與白血病發(fā)生及發(fā)展的關系。結果 粒單細胞白血病小鼠骨髓細胞中nm23-M1基因的相對表達量是正常對照組中的24倍,兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。結論 nm23-M1基因在小鼠粒單核細胞白血病中高表達,并且與外周血白細胞數、骨髓原始細胞數以及臟器白血病侵襲情況相關，而與白血病小鼠的性別、年齡無關。

nm23-M 1基因; 粒單核細胞白血病

分化抑制因子nm23基因最先由美國國立癌癥研究院Steeg等[1]于1988年將輕度和高度轉移黑色素瘤細胞的cDNA文庫進行差異雜交后發(fā)現。人類nm23基因有nm23-H1和nm23-H2兩種亞型，兩者具有88%的氨基酸序列同源性，兩基因都定位于17號染色體長臂2區(qū)1帶同一區(qū)域，呈串聯排列[2]。而鼠類的nm23-M 1基因定位于11號染色體短臂1區(qū)3帶, 與人類nm23-H1有98%的同源性, 和nm23-H2有88%的同源性。nm23基因在正常細胞和血液系統(tǒng)惡性腫瘤細胞的生長和分化中都起了重要作用[3～5]。nm23基因抑制了多種白血病細胞的分化如:小鼠的髓系白血病M 1、WEHI-3以及人類白血病HEL,KU812,K562[6]。而nm23-M 1基因在白血病小鼠體內的表達研究甚少。本文主要研究nm23-M 1基因在WEHI-3白血病小鼠體內的表達情況，分析其與疾病的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

選用6～8周齡SPF級BALB/c小鼠40只雌雄各半，體質量20±1 g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[SCXK(軍)2007-004]) 。小鼠粒單核細胞白血病細胞株WEHI-3 購自協(xié)和醫(yī)科大學基礎研究所細胞中心。逆轉錄體系及PCR 擴增體系(日本TaKaRa 公司產品), 基因引物及探針均由日本TaKaRa公司合成。實時熒光定量PCR儀MX3005P為美國Stratagene公司產品。

1.2 實驗設計

BALB/c小鼠分為2組，一組正常小鼠作為對照組，另一組為白血病小鼠經由尾靜脈接種1×106個WEHI-3 細胞，在接種后2周，脫臼處死小鼠提取骨髓組織進行檢測。注射后觀察小鼠飲食體質量、毛色、活動度等一般指標，對瀕死小鼠進行血常規(guī)、骨髓涂片、病理組織檢測以驗證白血病小鼠模型的可靠性。

1.3 骨髓單個核細胞總RNA的提取

取白血病小鼠和正常小鼠的骨髓樣品。用紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心洗滌后得單個核細胞，TRIzol法裂解細胞，提取總RNA，DEPC水溶解，分光光度計測OD值在1.8～2.0 ，用TOYOBO逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣本cDNA的制備

取DEPC處理過的PCR管，按逆轉錄試劑盒說明，1μl Oligol隨機引物加5 ng～2 μg的RNA模板，用無RNA酶的水補足到10 μl，70℃溫育5 min后置于冰上，依次加入5μl緩沖液，8μl dNTP，1 μl RNA酶抑制劑，1μl逆轉錄酶，37℃溫育1 h。cDNA標本放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物及探針的序列和長度

1.5 引物和探針的設計

Genbank查閱各個基因序列，在基因跨內含子區(qū)域應用Beacon Designer 7.0設計軟件設立上下游引物和探針，之后在NCBI網絡上用BlastResearch分析其特異性(表1)。

1.6 實時熒光定量PCR擴增

采用美國STRATAGENE公司生產的MX3005P實時熒光定量PCR儀進行PCR的擴增及結果分析。反應體系25 μl，含10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTPs 2.5 μl, 上下游引物2 μl, ddH2O16.5 μl, 探針0.3 μl，HOTSTART TagDNA多聚酶0.125 μl(TAKARA)及模板1 μl。將上述試劑加入0.25 m l的PCR管中，輕彈混勻，短暫離心后進行擴增。運行參數: 95℃ 預變性10 min; 95℃ 變性30s，59℃退火30 s, 72℃延伸30 s，共反應40個循環(huán)，在每一個循環(huán)的退火溫度時搜集熒光信號進行實時檢測。

將PCR 擴增產物進行瓊脂糖電泳驗證目的條帶，并進一步將擴增產物純化后連接到T 載體，然后轉化E．Coli DH5a 感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆，經測序鑒定后進行質粒抽提，測定質粒濃度，計算質?？截悢?，然后進行10倍序列的稀釋，構建質粒標準品并制作標準曲線。通過與標準曲線比對計算出基因拷貝數，根據雙標準曲線法推算出各基因表達率。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。白血病組與對照組的nm23-M 1基因表達差異為定量資料,應用One-Way ANOVA 進行檢驗, 方差齊性檢驗不齊, 選用Dunnett，ST3 法進行比較。nm23-M 1 基因表達水平、外周血白細胞計數、血紅蛋白、血小板量、體質量之間的相關性應用Spearman相關分析; 所有分析均設定P值為雙側分布, 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Real-time PCR可靠性驗證

選取目的基因質粒10倍稀釋后，分別將107，106，105，104，103，102的質粒進行擴增，繪制標準曲線，每條標準曲線的相關系數R2均大于0.99，證明循環(huán)閾值與標準質粒DNA的LOG值呈線性相關。目的基因與管家基因β-actin差值較小，表明擴增效率一致性好(圖1)。

2.2 nm23-M 1在白血病組小鼠和正常對照組小鼠

體內表達的定性檢測

取兩只白血病小鼠和兩只正常小鼠的骨髓, 提取RNA后進行PCR擴增, L1、L2代表白血病小鼠，N1、N2代表正常小鼠。結果顯示白血病小鼠和正常小鼠均表達nm23-M 1基因，但是熒光強度不同，提示nm23-M 1在白血病小鼠中高表達(圖2)。

2.3 nm23-M 1在白血病組小鼠和正常對照小鼠體

內表達的熒光相對定量檢測

圖1 nm23-M 1基因質粒的實時熒光定量PCR擴增曲線

圖2 nm23-M 1在正常和白血病小鼠中的表達情況

擴增效率(E)由等式E=10(-1/斜率)計算得出。△Ct是指參照標本與待測標本的Ct值差異。兩組之間進行非參數檢驗，與正常對照組nm23-M 1相對表達量(2.05±1.26)比較, 白血病組nm23-M 1基因表達(48.73±64.31)顯著升高(P＜0.05)。證明nm23-M 1基因表達的高低與白血病疾病是相關的。

2.4 白血病小鼠中nm23-M 1基因的表達情況與其他因素的相關性

nm23-M 1基因與外周血白細胞數、骨髓原始細胞數以及臟器白血病侵襲情況相關，而與白血病小鼠的性別、年齡無關(表3)。

3 討論

研究表明，nm-23基因與腫瘤細胞的生長、分化密切相關。但nm23基因在人類不同類型的腫瘤中有著不同的功能[7～10]。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，包括AML，ALL，MDS, CML, 淋巴瘤, nm23-H1基因均有表達，并且有研究顯示其可以作為預后的標志[11～13]。在對110個AML患者的nm23基因的表達情況與臨床各項指標的相關性分析中，nm23-H1的表達增加會增加初始化療的耐藥性并使總的存活率降低[14]。所以，在AML患者中nm23-H1是個重要的預后指標。隨著近年來對小鼠白血病模型的建立，研究更加深入，但基因方面的研究較少。

在本實驗中，檢測了20只粒單細胞白血病小鼠骨髓細胞中nm23-M 1基因的相對表達量均值是正常對照組中20只小鼠骨髓中nm23-M 1基因的相對表達量的均值的24倍，兩組之間有顯著差異。結果表明nm23-M 1的表達增高與小鼠粒單細胞白血病相關。因為nm23-M 1基因在一些人類的實體腫瘤以及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達與腫瘤的高轉移性和侵襲性相關，作者考慮nm23-M 1基因的表達可能與腫瘤本身的一些特性有關，所以將nm23-M 1基因的表達與粒單細胞白血病小鼠的性別、年齡、外周血白細胞數、骨髓原始細胞數以及臟器白血病侵襲情況做了相關性分析，結果顯示nm23-M 1基因與外周血白細胞數、骨髓原始細胞數以及臟器白血病侵襲情況相關，而與白血病小鼠的性別、年齡無關。因為白血病本身的特性，骨髓中白血病細胞不斷增殖，抑制其他血細胞增殖，越到疾病晚期外周血中白細胞數目增高越明顯，骨髓中白血病細胞比例越高，并且通過血液系統(tǒng)轉移到其它臟器中。綜上考慮，nm23-M 1在粒單細胞白血病小鼠中的表達與那些能反應白血病惡性程度、白血病侵襲情況相關。而當小鼠體內存在少量白血病細胞不足以發(fā)病的時候，nm23-M 1基因表達不增高，所以不能作為殘留白血病的標志。在小鼠發(fā)病以后，nm23-M 1基因表達增高可以作為一個輔助診斷小鼠粒單白血病的標志和判斷預后的標志。

表3 nm23-M 1表達與臨床各因素相關性統(tǒng)計表

[參考文獻]

[1] Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated w ith low tumor metastatic potential[J]. J Natl Cancer Inst, 1988,80(3):200-204.

[2] Chandrasekharappa SC, Gross LA, King SE, et al.The human NME2 gene lies w ithin 18kb of NME1 in chrosome 17[J]. Gene Chromosomes Cancer, 1993, 6(4):245-248.

[3] Smagghe BJ, Stewart AK, Carter MG, et al. MUC1*Ligand, NM 23-H1, is a novel grow th factor that maintains human stem cells in a more naive state[J]. PLoS One，2013,8(3): e58601.

[4] Okabe-Kado J, Kasukabe T, Kaneko Y. Extracellular NM 23 protein as a therapeutic target for hematologic malignancies [J]. Adv Hematol, 2012:879368.

[5] Joosten M, Blazquez-Dom ingo M, Lindeboom F, et al. Translational control of putative protooncogene Nm23-M 2 by cytokines via phosphoinositide 3-kinase signaling[J]. J Biol Chem, 2004, 279(37):38169-38176.

[6] Okabe-Kado J, Kasukabe T, Honma Y. Differentiation inhibitory factor Nm23 as a prognostic factor for acute myeloid leukem ia[J]. Leuk Lymphoma, 1998, 32(1-2):19-28.

[7] An R, M eng J, Shi Q, et al. Expressions of nucleoside diphosphate kinase (nm23) in tumor tissues are related w ith metastasis and length of survival of patients w ith hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Environ Sci, 2010, 23(4):267-272.

[8] Andolfo I, De Martino D, Liguori L, et al. Correlation of NM 23-H1 cytoplasm ic expression w ith metastatic stage in human prostate cancer tissue[J]. Naunyn Schm iedebergs Arch Pharmacol, 2011, 384(4-5):489-498.

[9] Liu C, Liu J, Wang X, et al. Prognostic impact of nm23-H1 and PCNA expression in pathologic stage I non-small cell lung cancer[J]. J Surg Oncol, 2011, 104(2):181-186.

[10] Boissan M, De Wever O, Lizarraga F, et al. Implication of metastasis suppressor NM 23-H1 in maintaining adherens junctions and lim iting the invasive potential of human cancer cells[J]. Cancer Res, 2010, 70(19):7710-7722.

[11] Lilly AJ, Khanim FL, Hayden RE, et al. Nm23-h1 indirectly promotes the survival of acute myeloid leukem ia blast cells by binding to more mature components of the leukemic clone [J]. Cancer Res, 2011, 71(3):1177-1186.

[12] Niitsu N, Nakam ine H, Okamoto M. Expression of nm23-H1 is associated w ith poor prognosis in peripheral T-cell lym phoma, not otherw ise specified[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(9):2893-2899.

[13] Niitsu N, Tamaru J, Yoshino T, et al. A study on nm23-H1 expression in diffuse large B-cell lymphoma that was treated w ith CyclOBEAP plus rituximab therapy[J]. Ann Hematol, 2011, 90(2):185-192.

[14] Yokoyama A, Okabe-Kado J, Wakimoto N, et al. Evaluation by multivariate analysis of the differentiation inhibitory factor nm23 as a prognostic factor in acute myelogenous leukem ia and application to other hematologic malignancies [J]. Blood, 1998, 91(6):1845-1851.

Expression of nm23-M1 Gene in Mouse Myelomonocytic Leukemia

DONG Zheng, SUN Xue-dong, MAN Qiu-hong,YAO Bo, LI Yu-fang, LIU Tie-qiang, HUANG Shan, LIU Gguang-xian, AiHui-sheng, GUO Mei
(307 Hospital of PLA, Beijing 100071, China)

ObjectiveTo investigate the expression level of nm23-M 1 gene in mouse myelomonocytic leukemia.M ethodsThe mice were inoculated intravenously w ith myelomonocytic leukemia cells of WEHI-3 cells, and selected a control group of normal mice. Bone marrow samples were collected in two groups. The nm23-M 1 mRNA expression were detected by TaqMan quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) and analysis of its relationship w ith the occurrence and development of leukemia. ResultsThe expression of nm23-M 1 gene in bone marrow cells of mice w ith leukemia is 24 times of the normal control group. There was a significant difference between the two groups (P＜0.05).ConclusionThe nm23-M 1 gene overexpressed .in mouse myelomonocytic leukemia, and had close relationship between and peripheral white blood cell count, the number of original cells in bone marrow and organ against the leukemia cases, regardless of the gender, age and leukemia in mice.

nm23-M 1 gene; Myelomonocytic leukemia

Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0042-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.06.008

2013-06-03

董 征(1983-), 男, 醫(yī)師, 解放軍307醫(yī)院血液內科, E-mail: dongz1983@139.com

郭 梅, 副主任醫(yī)師, 解放軍307醫(yī)院血液內科, E-mail: guomei307@163.com