馮 敏，譚利強，代曼曼，郝建勇，秦建如，黃小容，廖 明，曹偉勝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室，廣東廣州 510642)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的以造血細胞惡性增生為主的一類腫瘤性疾?。?］.依據(jù)病毒的宿主范圍和交叉中和反應(yīng)等將禽白血病病毒分為A～J 10個亞群，其中ALV-A、B、J為常見的外源性病毒;ALV-E為內(nèi)源性病毒，無致病能力.最近，有報道稱從我國蘆花雞中發(fā)現(xiàn)一個疑似新的亞群，初步命名為K亞群［2］.目前，禽白血病在我國已經(jīng)呈流行趨勢，幾乎蔓延到了每個省份［3］.雞群中禽白血病病毒感染情況復(fù)雜，A/B亞群、J亞群禽白血病病毒均有存在，并先后感染肉雞、蛋雞以及各種地方品系雞［4］.上世紀(jì)七八十年代，ALV-A在世界上普遍流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，各大種禽公司花費數(shù)年時間才得以凈化.雖然從近年的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國的禽白血病病原主要為J亞群，少量存在 A、B、C 亞群［4-5］，但 ALV-A 的存在，必須引起我們足夠重視.ALV-A以引發(fā)淋巴細胞瘤為主，但也能像ALV-J一樣引發(fā)血管瘤［6-7］.國內(nèi)多位研究者分別在不同時間段，不同地區(qū)，不同品種雞群中分離到ALV-A，并且測定其全基因序列［3，7-10］，最近有從我國東北地區(qū)野生鳥類分離到ALV-A的報道［11］.廣東地區(qū)5年前從肉種雞場分離到1株ALV-A［12］.本研究擬針對廣東地區(qū)部分種禽場，通過采取病毒分離的方式，了解A亞群禽白血病病毒在該地區(qū)種禽場的感染情況，以及毒株的變異情況，以期為廣東地區(qū)禽白血病的綜合防控以及凈化工作提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料的來源與處理 被檢樣品來自2012年9月—2013年9月廣東4個種禽場(A、B、C、D)的核心種雞群，無菌采集翅靜脈抗凝血1 561份.2 000 r/min 4℃條件離心12 min，無菌分離血漿，-80℃條件保存?zhèn)溆?

1.1.2 主要試劑 禽白血病病毒抗原檢測試劑盒(ALV Ag Test Kit)為美國IDEXX公司產(chǎn)品;pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;DNA提取試劑盒，DNA Gel Extraction Kit，Plasmid Miniprep Kit為OMEGA公司產(chǎn)品.ALV-A單抗由美國ADOL實驗室惠贈;ALV-J單抗JE9由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院秦愛建教授惠贈.FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司.FBS和Trypsin均為Gibico公司產(chǎn)品.DF-1細胞，感受態(tài)細胞DH5ɑ為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室保存.

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離培養(yǎng) 將“1.1.1”中制備的血漿接種于24孔板的 DF-1細胞懸液中(1.7×105mL-1)，每孔接種50μL血漿，同時設(shè)DMEM陰性對照和接種已知病毒陽性對照各2孔.37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至單層，換為體積分數(shù)1%的FBS細胞維持液連續(xù)培養(yǎng)7 d后收獲，凍融3次，5 000 r/min離心5 min，離心后的細胞上清液進行p27抗原ELISA檢測，細胞沉淀用于提取禽白血病前病毒基因組DNA.

1.2.2 細胞培養(yǎng)物抗原ELISA檢測 p27抗原ELISA檢測按照禽白血病病毒抗原檢測試劑盒(IDEXX)使用說明書進行.

1.2.3 前病毒DNA的制備和病毒核酸PCR的檢測

根據(jù)p27抗原檢測的結(jié)果，對應(yīng)收集“1.2.1”中樣品細胞上清液為陽性的細胞沉淀，按照SQ Tissue組織DNA試劑盒說明書制備禽白血病前病毒基因組DNA，-20℃條件保存?zhèn)溆?分別參照Fenton等［13］，Silva 等［14］，Smith 等［15］的方法，合成 A-F/A-R;B-F/BR;H5/H7引物用于檢測 ALV-A，ALV-B，ALV-J，其擴增產(chǎn)物預(yù)計大小分別為690、1 100、545 bp.

1.2.4 間接免疫熒光試驗(IFA) 將p27抗原ELISA檢測為陽性、PCR檢測為ALV-A陽性的樣品細胞上清液接種于鋪滿單層DF-1細胞的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)7 d后，底層細胞用PBS洗3次，用體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定20 min.再用PBS洗滌3次，加入1∶200稀釋的ALV-A單抗，4℃條件下孵育過夜.然后PBS洗滌3次，加上1∶200稀釋的羊抗鼠IgGFITC熒光抗體，37℃作用1 h，再用PBS洗滌3次后，加1滴體積分數(shù)50%甘油覆蓋細胞，在熒光顯微鏡下觀察試驗結(jié)果.設(shè)立一個DMEM陰性對照.按照同樣方法用 ALV-J單抗 JE9對 PCR同時擴增出ALV-A/J目的片段的樣品進行間接免疫熒光試驗.1.2.5 ALV-A分離株前病毒全基因擴增和測序參考張小桃等［12］GD08全基因核苷酸序列擴增引物，采用分段擴增的方法，分別擴增分離株基因組核苷酸序列A、B、C段.陽性菌液送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序.

1.2.6 基因組核苷酸序列分析比較 利用DNAStar7.1基因分析軟件對測序結(jié)果進行核苷酸序列的剪輯和拼接.將分離株的LTR、gp85基因核苷酸序列與國內(nèi)外各參考毒株相同區(qū)域核苷酸序列進行相似性分析，并用MEGA5.0繪制分離株與各參考毒株的gp85基因序列的系統(tǒng)進化圖譜.各亞群參考毒株分別為: ALV-A: ＲSA ( M37980 ) ，ＲAV-1 ( M19113 ) ，MAV-1( L10922. 1) ，GD08 ( HM775328) ，SDAU09E1( HM452341 ) ，SDAU09E2 ( HM452342 ) ，SDAU09C1( HM452339 ) ，SDAU09C3 ( HM452340 ) ，MQNCSU( DQ365814) ; ALV-B: ＲAV-2 ( M14902) ，SDAU09C2( HM446005 ) ; ALV-C: PragueC ( J02342 ) ; ALV-J:HPＲS103 ( Z46390 ) ，NX0101 ( DQ115805 ) ，HN06( HQ900844 ) ; ALV-E: ＲAV-0 ( M12172 ) ，SD0501( EF467236) . 以上參考株序列均來自GenBank 數(shù)據(jù)庫，括號內(nèi)為登錄號.

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞培養(yǎng)物抗原ELISA檢測

依據(jù)IDEXX公司禽白血病病毒抗原檢測試劑盒說明書，對凍融后的接種血漿試驗組和對照組細胞上清液進行禽白血病病毒p27抗原檢測，結(jié)果顯示，總計1 561份血漿樣品中，有71份樣品呈陽性反應(yīng)(表1)，其中A、B、C種禽場的外源性ALV陽性率均超過種雞群健康標(biāo)準(zhǔn)1%.

2.2 病毒基因PCR檢測

以“1.2.3”制備的陽性樣品前病毒DNA作為模板進行分型PCR檢測.凝膠電泳結(jié)果顯示，其中來自C種禽場2份樣品擴增出約690 bp的片段，與ALV-A預(yù)計的目的片段大小相符(圖1).這2份樣品其中1份還擴增出J亞群ALV 545 bp目的片段，顯示為ALV-A/J共感染.陰性對照組DF-1細胞DNA中未擴出相應(yīng)大小的目的片段.其余p27抗原檢測陽性樣品PCR檢測均顯示為ALV-J感染.

表1 4個種禽場外源性禽白血病病毒檢出情況Tab.1 Exogenous avian leucosis virus detection of four breeder farms

圖1 ALV-A PCR檢測Fig.1 ALV-A PCR detection

2.3 間接免疫熒光檢測

用ALV-A單抗做間接免疫熒光試驗呈陽性反應(yīng)(圖2a、圖2b)，細胞表面及胞漿呈現(xiàn)明顯綠色熒光，對照組細胞(圖2c)沒有綠色熒光.間接免疫熒光試驗結(jié)果進一步證明了分離到的2株病毒為ALV-A，分別命名為GD13-1、GD13-2.其中GD13-2 PCR能擴增出ALV-J的目的片段，用ALV-J單抗JE9做間接免疫熒光試驗呈陽性反應(yīng)(圖2d)，對照成立(圖2e)，結(jié)果提示GD13-2為ALV-A和ALV-J共感染.

圖2 間接免疫熒光試驗結(jié)果(100×)Fig.2 The result of IFA detection(100×)

2.4 分離株前病毒全基因組PCR擴增結(jié)果

按照“1.2.3”方法制備前病毒DNA，采用分段擴增的方法，分別擴增出大小為3.7、2.5、2.9 kb的3個目的片段，與預(yù)計片段大小相符(圖3).

圖3 分離株前病毒基因組PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results ofwhole proviral genome

2.5 分離株前病毒核苷酸序列分析

據(jù)報道ALV-A前病毒DNA全長約7.8 kb［16］，利用DNA-Star軟件分別對ALV-A分離株GD13-1和GD13-2的3個擴增片段的基因序列進行剪輯和拼接分析后，發(fā)現(xiàn)GD13-1和GD13-2均具有典型的復(fù)制完全型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)［17］;前病毒DNA全長分別為7 721、7 715 bp;gp85核苷酸序列長度均為1 017 bp;長末端重復(fù)序列(LTR)長度均為324 bp，相似性達到99.1%.

GD13-1、GD13-2與不同ALV-A分離株間LTR相似性比較發(fā)現(xiàn)，與SDAU09E2的LTR相似性最高，分別為96.9%和97.2%;與SDAU09E1的LTR相似性最低，分別為51.6%和52.3%，主要在U3區(qū)存在多處變異;與ALV-A美國株MQNCSU的LTR相似性分別為87.6%和87.2%;與廣東分離株GD08的LTR相似性分別為88.9%和89.5%.

GD13-1、GD13-2與國內(nèi)外不同禽白血病分離株gp85核苷酸序列進行相似性比較發(fā)現(xiàn)，這2個分離株的gp85與ALV-A的gp85相似性達81.6%～98.8%，而與 ALV-B、C、D、E、J亞群的 gp85 相似性只有47.5% ～85.4%.其中，這2個分離株與國外ALV-A分離株MAV-1相似性達89.3%;與國內(nèi)分離株GD08的相似性分別達到了98.5%和98.8%，與SDAU09E2的相似性分別達到了98.4%和98.7%.各亞群的gp85系統(tǒng)進化樹顯示，這2個分離株與GD08、SDAU09E2位于同一個進化分支上，而與其他A亞群毒株位于同一個大的進化分支上(圖4).

圖4 GD13-1和GD13-2與不同亞群禽白血病病毒參考株間gp85基因遺傳進化樹關(guān)系Fig.4 Phylogenetic tree based on gp85 gene for GD13-1，GD13-2 and other avian leucosis virus reference strains of different subgroups

3 討論

外源性禽白血病病毒不僅能引發(fā)腫瘤和死亡，還會引起雞群免疫抑制和生長抑制等亞臨床癥狀，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失.直到現(xiàn)在，依然沒有有效的藥物和疫苗來應(yīng)對禽白血病的發(fā)生.西方國家防控該病的策略主要是通過不斷剔除雞群中的陽性雞，達到凈化種群的目的［18］.我國對禽白血病的研究起步較晚，有些養(yǎng)禽公司對該種病的重視不夠，防控意識不強，一直沒對種雞群采取有力的凈化措施.最近幾年，主管部門和養(yǎng)禽行業(yè)開始意識到控制禽白血病的重要性，尤其是《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》［19］和《全國蛋雞遺傳改良計劃(2012—2020年)》出臺之后［20］，對禽白血病的防控起到推動作用.雖然現(xiàn)在我國J亞群禽白血病普遍流行，但依然存在ALV-A/B，且造成的影響不容忽視，并且有研究表明，禽白血病病毒不同亞群混合感染的現(xiàn)象也時有發(fā)生［5，21］.西方國家在上世紀(jì)80年代已經(jīng)基本消除了經(jīng)典的外源性ALV-A/B，但從我國進口的肉雞祖代雞中依然分離到了禽白血病病毒［22］.美國曾經(jīng)報道過從馬立克氏病疫苗中分離到了ALV-A［23］，我國生產(chǎn)的活疫苗不能保證沒有存在類似的問題.鑒于以上情況，在積極推進種禽場白血病凈化工作的進程中，開展不同亞群禽白血病病毒流行情況的調(diào)查，以及監(jiān)測毒株的變異情況是非常有必要的.

本研究從廣東4個種禽場共采集1 561份血漿樣品，接種DF-1細胞，培養(yǎng)7 d后取上清液進行禽白血病病毒p27抗原檢測，發(fā)現(xiàn)p27抗原陽性率為4.6%(71/1 561)，結(jié)果提示所調(diào)查的4個種禽場均有外源性禽白血病病毒感染.病毒基因檢測引物PCR擴增和間接免疫熒光試驗結(jié)果表明，只有來自C場的2份陽性樣品擴增出ALV-A約690 bp目的片段，用ALV-A單抗做間接免疫熒光試驗均呈陽性反應(yīng);其中有1份陽性樣品前病毒DNA中還能檢出ALV-J的特異性片段，用ALV-J單抗做間接免疫熒光試驗也呈陽性反應(yīng);其余69份陽性樣品均擴增出ALV-J 545 bp目的片段.調(diào)查結(jié)果表明廣東地區(qū)種禽場內(nèi)仍然存在A亞群禽白血病病毒感染，但ALV-A已經(jīng)不是流行毒株.

分離株前病毒核苷酸序列分析結(jié)果表明，2株分離株GD13-1、GD13-2 gp85基因編碼的氨基酸殘基中有3個氨基酸的差異，GD13-2的gag基因在1 040～1 049位點連續(xù)有9個堿基缺失;LTR變異區(qū)主要集中在其中U3區(qū)，64位缺失1個堿基，多個位點存在點突變，但典型反轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)控元件Y box、TATA box、CAAT box、CArG box、PRE box 未見任何變化.與A亞群原型株RAV-1 gp85核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，2株分離株GD13-1、GD13-2存在多個地方的堿基缺失、插入突變和點突變;與早期廣東分離株GD08 gp85基因編碼的氨基酸序列進行比較，在58、119、125、134、222、243、332 位 氨 基 酸 有 差 異;與SDAU09E2 gp85基因編碼的氨基酸序列比較，119、125、164、222位氨基酸有差異.遺傳演化分析表明GD13-1、GD13-2 與 SDAU09E2、GD08 均有很高的相似性，提示這些毒株可能有共同的祖先.這些分離株不同位置出現(xiàn)的堿基突變、缺失和插入對分離株的生物學(xué)特性的影響有待進一步研究.同時，GD13-2與ALV-J混合感染的現(xiàn)象，說明部分種禽場禽白血病病毒感染情況相對復(fù)雜，為不同亞群禽白血病病毒重組創(chuàng)造了有利條件.本研究對廣東地區(qū)部分種禽場進行了1次ALV-A感染的摸底調(diào)查，為下一步種雞群白血病凈化及有效防控提供了科學(xué)依據(jù).

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【責(zé)任編輯柴 焰】