高瑞芳，張騰飛，張建國(guó)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院／農(nóng)業(yè)部能源植物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

用于乙醇生產(chǎn)的‘熱研4號(hào)’王草石灰預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化研究

高瑞芳，張騰飛，張建國(guó)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院／農(nóng)業(yè)部能源植物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

【目的】提高‘熱研4號(hào)’王草Pennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4生產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)化率.【方法】采用石灰進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)時(shí)間、溫度、石灰用量、固液比4個(gè)因素進(jìn)行單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)分析.【結(jié)果和結(jié)論】最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件為：時(shí)間3 h，溫度125℃，原料的石灰用量0.15 g·g-1，固液比（m∶V）1∶12（g·mL-1）.此時(shí)‘熱研4號(hào)’王草的干基失質(zhì)量率、木質(zhì)素移除率、半纖維素移除率和纖維素移除率分別為28.1%、65.4%、37.5%和6.1%.預(yù)處理的‘熱研4號(hào)’王草經(jīng)酶解后，半纖維素、纖維素和總酶解得率分別為43.5%、85.7%和55.2%，比未經(jīng)處理的酶解得率分別提高了18.1、4.5和4.4倍.此外，影響酶解得率的主要因素是預(yù)處理時(shí)間和溫度，其次是石灰用量和固液比.

‘熱研4號(hào)’王草；石灰；預(yù)處理；乙醇生產(chǎn)

隨著能源危機(jī)、糧食短缺和環(huán)境污染等問題的日益突顯，各國(guó)紛紛開始研究可替代石油等石化資源且適合本國(guó)國(guó)情的生物質(zhì)能源，其中，將生物乙醇作為可再生液體燃料資源逐漸引起各國(guó)的關(guān)注［1-3］.因此，為了使燃料乙醇得到大規(guī)模的推廣應(yīng)用，應(yīng)尋求不與糧食爭(zhēng)地的乙醇生產(chǎn)原料［4-5］.木質(zhì)纖維原料富含纖維素和半纖維素，如王草Pennisetumpurpureum×P.americanum、柳枝稷Panicumvirgatum、蘆竹Arundodonax、芒草Miscanthusspp.等，因其豐富、廉價(jià)，將其作為生產(chǎn)燃料乙醇可再生原料具有廣闊的發(fā)展前景［6］.

木質(zhì)纖維原料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中木質(zhì)素作為黏合劑包裹在纖維素和半纖維素周圍，使得纖維素的可及度極低.因此，纖維素酶對(duì)纖維素的水解率極低，一般為10%～20%［7］，因而需對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，除去木質(zhì)素或破壞木質(zhì)素層，使結(jié)晶纖維素成為無(wú)定型纖維素，以提高纖維素酶對(duì)纖維素的水解糖化效率［8-9］.石灰預(yù)處理可除去生物質(zhì)中所有的乙酰基和部分木質(zhì)素，促進(jìn)纖維素和半纖維素的水解［10］，有利于后續(xù)的糖化和發(fā)酵［11］.石灰預(yù)處理的溫度范圍較寬（25～130℃），處理時(shí)間從幾小時(shí)到幾周，適當(dāng)提高處理溫度可縮短處理時(shí)間［12］.其優(yōu)點(diǎn)還在于成本低、使用安全，且石灰溶液與二氧化碳反應(yīng)生成的碳酸鈣可利用石灰窯技術(shù)重新獲得石灰［13］.Liang等［14］和Sierra等［15］研究表明，采用石灰代替氫氧化鈉，可減弱預(yù)處理過程對(duì)設(shè)備的腐蝕作用，明顯提高預(yù)處理后物料的酶解轉(zhuǎn)化效率.Karr等［13］使用石灰對(duì)玉米秸稈進(jìn)行了預(yù)處理，在固液比（m∶V）1∶5（g·mL-1）、每克原料的石灰用量0.075 g、120℃條件下處理4 h，其酶解率提高了9倍.Chang等［16］在150℃條件下用石灰處理薄白楊木板5 h，木質(zhì)素去除率達(dá)77.5%，葡萄糖的酶解得率從7%提高到了77%.

‘熱研4號(hào)’王草Pennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4是禾本科狼尾草屬高稈多年生草本，原產(chǎn)于熱帶非洲，是象草P.purpureum和美洲狼尾草P.americanum的雜交種，以優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)而著稱，被譽(yù)為“草中之王”［17］.1984年中國(guó)熱帶牧草研究中心從哥倫比亞引種到海南島，試種成功

后逐步在全國(guó)各地推廣.現(xiàn)已在海南、廣東、廣西、福建、四川、江西等地廣泛栽培［18］.‘熱研4號(hào)’王草形似甘蔗，根系發(fā)達(dá)，植株高1.5～4.5 m.具有光合作用能力和生物量較高，利用年限長(zhǎng)，再生能力、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)［3，19-20］.李高楊等［21］探討了優(yōu)質(zhì)能源植物的篩選及評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明‘熱研4號(hào)’王草是最適宜生產(chǎn)清潔生物質(zhì)能源的能源草之一.本研究采用石灰對(duì)‘熱研4號(hào)’王草進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)溫度、時(shí)間、石灰用量、固液比4個(gè)因素進(jìn)行了單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)分析，以期為‘熱研4號(hào)’王草作為能源草生產(chǎn)燃料乙醇提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

‘熱研4號(hào)’王草來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所.于2012年2月29日種植，試驗(yàn)小區(qū)面積為14 m2（3.5 m×4.0 m），3次重復(fù)，小區(qū)間距100 cm.采用粗壯、無(wú)病害的莖芽作種莖，株行距60 cm.種植后于3月14日施肥、澆水，施肥量每小區(qū)均為622 g（N-P2O5-K2O有效養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%）.

1.2 樣品處理

將株高3 m的‘熱研4號(hào)’王草收獲后帶回實(shí)驗(yàn)室，機(jī)械切段1～2 cm，70℃烘干、粉碎、過40目篩，保存?zhèn)溆?

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn) 在高壓滅菌鍋（YXQ-LS-50SⅡ，博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，上海）中，選取時(shí)間、溫度、固液比、石灰用量4個(gè)因素在不同水平條件下進(jìn)行預(yù)處理（表1）.反應(yīng)結(jié)束后，冷卻、中和、抽濾，收集濾液，用于測(cè)定干基失質(zhì)量率，木質(zhì)素、纖維素及半纖維素移除率.

表1 單因素試驗(yàn)選取的水平Tab.1 Levels of single-factor tests

1.3.2 正交試驗(yàn) 在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選取時(shí)間、溫度、固液比和石灰用量4個(gè)因素作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)（表2），研究其對(duì)‘熱研4號(hào)’王草各組分的影響.

表2 石灰預(yù)處理的正交試驗(yàn)因素及水平Tab.2 The factors and levels of lime pretreatment orthogonal test

1.3.3 酶解試驗(yàn) 將預(yù)處理的烘干樣1.0 g放入50 mL錐形瓶中，加入pH 4.8（0.05 mol／L檸檬酸緩沖液）含有纖維素酶20 U／g的酶液，固液比（m∶V）1∶20（g·mL-1），在溫度45℃、轉(zhuǎn)速150 r／min的條件下酶解48 h，每試驗(yàn)重復(fù)3次.酶解結(jié)束后過濾酶解液，使用高效液相色譜儀（島津-GL，化興科學(xué)儀器有限公司，廣州）測(cè)定酶解液中的還原糖含量.

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 化學(xué)組分分析 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量在Van Soest法的基礎(chǔ)上使用改進(jìn)的濾袋分析法測(cè)定［22］；灰分含量采用灼燒法測(cè)定［23］.

1.4.2 還原糖含量測(cè)定 還原糖含量采用高效液相色譜儀測(cè)定，色譜條件：島津色譜柱（3.5μm×4.6 mm×250 mm氨基柱）；RID-10A示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相為超純水；流速1.0 mL／min；柱溫45℃；進(jìn)樣量20μL.

1.4.3 計(jì)算 纖維素（半纖維素）酶解得率（%）＝（V×ρ×0.9）／（m×w×1 000）；總酶解得率（%）＝［（w1+w2）×0.9］／（m×w3）.其中，V為酶解液體積，mL；ρ為酶解液葡萄糖（木糖）質(zhì)量濃度，g／L；m為預(yù)處理后殘?jiān)|(zhì)量，g；w為殘?jiān)欣w維素（半纖維素）質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；w1、w2分別為纖維素、半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；w3為殘?jiān)欣w維素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和，%.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘熱研4號(hào)’王草原料的化學(xué)組分

‘熱研4號(hào)’王草原料（干物質(zhì)）的纖維素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可達(dá)39.9%和28.2%；木質(zhì)素和灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，分別為11.6%和5.4%，所以比較適宜作為生產(chǎn)生物乙醇的原料.

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 預(yù)處理時(shí)間對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，干基失質(zhì)量率逐漸下降，其原因可能是石灰轉(zhuǎn)化為不可溶性鹽后，以鹽的形式與草粉結(jié)合［24］.木質(zhì)素的移除主要是在前4 h，0～2 h移除率為28.1%，2～4 h移除率增加17.5%，且4 h移除率顯著高于2 h（P＜0.05），4～10 h間無(wú)顯著差異（P＞0.05）.半纖維素的移除主要是在前2 h，移除率為30.1%；纖維素的移除量較少，主要是在前4 h，移除率僅為4.3%，各時(shí)間段均無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖1）.綜合3種組分的去除效果，并考慮縮短時(shí)間和節(jié)約成本，采用4 h進(jìn)行其他單因素試驗(yàn).

圖1 預(yù)處理時(shí)間對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響Fig.1 Effects of pretreatment time on the chemical composition of‘Reyan No.4’

2.2.2 預(yù)處理溫度對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響 隨著溫度的升高，干基失質(zhì)量率維持在17%～23%的水平.木質(zhì)素移除率在90～120℃條件下由20.5%迅速上升到60.1%，120～130℃條件下無(wú)顯著差異（P＞0.05）.半纖維素移除率在90～130℃條件下由29.7%增至43.7%，其中90～120℃條件下移除率迅速增大，120～130℃無(wú)顯著差異（P＞0.05），說明溫度對(duì)木質(zhì)素和半纖維素的移除影響較大.纖維素的移除率在90～130℃間均無(wú)顯著差異（P＞0.05），130℃移除率最高，僅為6.9%（圖2）.所以，綜合以上結(jié)果，采用120℃進(jìn)行其他單因素試驗(yàn).

2.2.3 預(yù)處理固液比對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響 隨著固液比（m∶V）在1∶5～1∶15（g·mL-1）間干基失質(zhì)量率從17.9%增至27.7%，差異顯著（P＜0.05），而在固液比1∶15～1∶25（g·mL-1）間無(wú)顯著差異（P＞0.05）.固液比在1∶5～1∶15（g·mL-1）間木質(zhì)素移除率由20.9%上升至57.7%，半纖維素移除率由34.4%增高到47.8%，處理效果較好；而在固液比1∶15～1∶25（g·mL-1）間木質(zhì)素和半纖維素的移除率僅分別增加2.4%和1.9%，處理效果無(wú)顯著差異（P＞0.05）.纖維素移除率在固液比1∶5～1∶25（g·mL-1）間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖3）.綜合以上結(jié)果和從節(jié)約成本角度出發(fā)，采用固液比1∶15（g·mL-1）進(jìn)行其他單因素試驗(yàn).

圖2 預(yù)處理溫度對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響Fig.2 Effects of pretreatment temperature on the chemical composition of‘Reyan No.4’

圖3 預(yù)處理固液比對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響Fig.3 Effects of solid-to-liquid ratio on the chemical composition of‘Reyan No.4’

2.2.4 預(yù)處理石灰用量對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響 隨著石灰用量的增加，干基失質(zhì)量率基本維持在25%左右，對(duì)木質(zhì)素、半纖維素和纖維素的影響均較大.當(dāng)原料的石灰用量為0.05～0.15 g·g-1時(shí)，木質(zhì)素移除率由7.9%增至51.2%，去除效果良好，木質(zhì)素移除率在石灰用量為0.15～0.25 g·g-1間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)石灰用量為0.05～0.10 g·g-1時(shí)，半纖維素移除率由18.1%增至37.8%，半纖維素移除率在石灰用量為0.10～0.25 g·g-1間無(wú)顯著差異（P＞0.05）.纖維素移除率在石灰用量為0.05～0.10 g·g-1時(shí)顯著提高，但隨后變化不大，最高僅為6.3%（圖4）.綜合以上結(jié)果和從節(jié)約成本角度出發(fā)，采用石灰用量為0.15 g·g-1進(jìn)行其他單因素試驗(yàn).

圖4 預(yù)處理原料的石灰用量對(duì)‘熱研4號(hào)’王草化學(xué)組分的影響Fig.4 Effects of the lime dosage of material on the chemical composition of‘Reyan No.4’

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)木質(zhì)素去除影響較明顯的時(shí)間、溫度、固液比和石灰用量作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，并對(duì)總酶解得率進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表3所示.4個(gè)因素對(duì)總酶解率影響的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即時(shí)間＞溫度＞石灰用量＞固液比，其中：時(shí)間和溫度是主要因素，其次是石灰用量和固液比；且最優(yōu)預(yù)處理組合為A1B3C1D2，即時(shí)間3 h、溫度125℃、固液比（m∶V）1∶12（g·mL-1）、原料的石灰用量為0.15 g·g-1.試驗(yàn)4的木質(zhì)素移除率較高，但半纖維素移除率較低，所以總酶解得率較低.試驗(yàn)3、5、8的木質(zhì)素移除率和總酶解得率均較高，可見，木質(zhì)素的位阻效應(yīng)及木質(zhì)素與纖維素競(jìng)爭(zhēng)吸附酶會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的水解效率降低.所以，木質(zhì)素的移除對(duì)酶解有較大的促進(jìn)作用，木質(zhì)素移除越多，酶與底物越容易發(fā)生接觸，使之酶解，纖維素和半纖維素更易轉(zhuǎn)化為葡萄糖和木糖.

2.4 預(yù)處理最終效果比較

對(duì)最優(yōu)條件下預(yù)處理和未經(jīng)處理的‘熱研4號(hào)’王草進(jìn)行酶解，結(jié)果顯示其預(yù)處理前后的化學(xué)組分和酶解得率均存在極顯著差異（P＜0.01）（表4）.預(yù)處理后，‘熱研4號(hào)’王草干質(zhì)量降低了近30%；木質(zhì)素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著降低，纖維素移除較少，其移除率分別為65.4%、37.5%、6.1%.預(yù)處理后，半纖維素、纖維素和總的酶解得率分別提高了18.1、4.5和4.4倍.可見，‘熱研4號(hào)’王草經(jīng)石灰預(yù)處理可顯著提高酶解效率，其中半纖維素的酶解效果最為明顯.

表3 ‘熱研4號(hào)’王草石灰預(yù)處理正交試驗(yàn)及酶解結(jié)果1）Tab.3 The results of lime pretreatment orthogonal test and the follow ing enzymatic hydrolysis of‘Reyan No.4’

表4 ‘熱研4號(hào)’王草預(yù)處理前后組分和酶解效果比較1）Tab.4 The com position and enzymatic hydrolysis of pretreated and untreated‘Reyan No.4’

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)研究了石灰預(yù)處理中4個(gè)因素對(duì)‘熱研4號(hào)’王草總酶解得率的影響，其影響大小為：時(shí)間 ＞溫度＞石灰用量＞固液比.該結(jié)果與Chang等［16］研究石灰預(yù)處理影響楊樹酶解得率因素的結(jié)果一致，且時(shí)間和溫度是主要因素，其次是石灰用量和固液比.

Karr等［13］使用石灰對(duì)玉米秸稈進(jìn)行了預(yù)處理，在固液比（m∶V）1∶5（g·mL-1）、原料的石灰用量0.075 g·g-1、120℃條件下處理4 h，其酶解得率提高了9倍.陳明［25］使用與Karr等［13］相同的石灰預(yù)處理?xiàng)l件處理玉米秸稈，結(jié)果其木質(zhì)素、半纖維素的脫除率分別為38.4%、14.8%，纖維殘?jiān)?8 h后的酶解得率為52.9%.Kim等［26］使用超臨界CO2預(yù)處理白楊和南方松，以提高纖維素酶水解效率，結(jié)果顯示：在165℃、21 MPa條件下預(yù)處理30 min后，白楊和南方松還原糖產(chǎn)量可分別達(dá)理論值的84.7%和27.3%.本試驗(yàn)中，‘熱研4號(hào)’王草經(jīng)石灰預(yù)處理后，木質(zhì)素、半纖維素和纖維素移除率分別為65.4%、37.5%和6.1%，半纖維素、纖維素和總酶解得率分別提高了18.1、4.5和4.4倍.這與陳明［25］、Karr等［13］的研究結(jié)果較相似，石灰預(yù)處理均可脫除木質(zhì)素和半纖維素，提高酶解得率.所以，‘熱研4號(hào)’王草經(jīng)石灰預(yù)處理可顯著提高酶解效率，其中半纖維素酶解效果最為明顯.

‘熱研4號(hào)’王草是生產(chǎn)燃料乙醇的優(yōu)良能源植物，其纖維含量較高，利用石灰預(yù)處理可有效去除木質(zhì)素，提高纖維素酶對(duì)原料組分的可及度.最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件為：時(shí)間3 h，溫度125℃，固液比（m∶V）1∶12（g·mL-1），原料的石灰用量0.15 g·g-1.此條件下‘熱研4號(hào)’王草的木質(zhì)素、半纖維素和纖維素移除率分別為65.4%、37.5%和6.1%；半纖維素、纖維素和總纖維原料的酶解得率分別為43.5%、85.7%和55.2%，比未處理的‘熱研4號(hào)’王草酶解得率分別提高了18.1、4.5和4.4倍.此外，影響酶解得率的主要因素是預(yù)處理時(shí)間和溫度，其次是石灰用量和固液比.

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【責(zé)任編輯李曉卉】

Lime pretreatment optim ization of Pennisetum purpureum× P.americanum cv.Reyan No.4 for ethanol production

GAO Ruifang，ZHANG Tengfei，ZHANG Jianguo
（College of Agriculture，South China Agricultural University／Key Laboratory of Energy Plant Resources and Utilization，Ministry of Agriculture，P.R.China，Guangzhou 510642，China）

【Objective】The pretreatment ofPennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4 was studied with lime to improve the conversion rate for ethanol production.【Method】The effects of pretreatment time，temperature，the lime dosage，and solid-to-liquid ratio aswell as the orthogonal optimization test on the composition and the following enzymatic hydrolysis of‘Reyan No.4’were investigated.【Result and conclusion】The optimal pretreatment conditionswere as follows：pretreatment time 3 h，temperature 125℃，solid-to-liquid ratio 1∶12（g·mL-1）and the lime dosage ofmaterial0.15 g·g-1.Under the optimal condition，drymass losswas 28.1%in lime pretreatment，and the removal rates of lignin，hemicellulose and cellulose were 65.4%，37.5%，6.1%，respectively.The yields of hemicellulose，cellulose and total residue were 45.5%，85.7%，55.2%，respectively；in the following enzymatic hydrolysis，they increased 18.1 times，4.5 times and 4.4 times，respectively，compared with those of untreated‘Reyan No.4’.The primary factors influencing enzymatic hydrolysis yield were temperature and time，followed by lime dosage and solid-to-liquid ratio.

Pennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4；lime；pretreatment；ethanol production

TQ353.42

A

1001-411X（2014）04-0103-06

2013-12-18優(yōu)先出版時(shí)間：2014-06-03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net／kcms／doi／10.7671／j.issn.1001-411X.2014.04.019.html

高瑞芳（1987—），女，碩士，E-mail:740753128＠qq.com；通信作者:張建國(guó)（1968—），男，教授，博士，E-mail: zhangjg＠scau.edu.cn

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD17B02-05）

高瑞芳，張騰飛，張建國(guó).用于乙醇生產(chǎn)的‘熱研4號(hào)’王草石灰預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（4）：103-108.