汪國(guó)平，牛 玉，2，汪文毅，樂(lè)素菊，林鑒榮

（1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571737；3仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510225；4廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東廣州 510308）

番茄SSR標(biāo)記在茄子及其他茄科作物上的通用性分析

汪國(guó)平1，牛 玉1，2，汪文毅1，樂(lè)素菊3，林鑒榮4

（1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571737；3仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510225；4廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東廣州 510308）

【目的】利用已完成測(cè)序的番茄基因組發(fā)展大量的SSR標(biāo)記，并將這些標(biāo)記轉(zhuǎn)移到茄子及其他茄科作物上，節(jié)省開發(fā)SSR標(biāo)記的成本.【方法】本研究利用近緣物種轉(zhuǎn)移法分析了番茄SSR標(biāo)記在茄子及其他茄科作物上的通用性情況.【結(jié)果和結(jié)論】1 046對(duì)番茄SSR引物中有887對(duì)能在茄子基因組DNA上擴(kuò)增出產(chǎn)物，425對(duì)引物擴(kuò)增出的帶型在番茄與茄子間相似程度高，標(biāo)記的通用率為40.6%；EST-SSR比基因組SSR的通用性更好，前者通用率為54.5%，后者為38.9%；414個(gè)通用SSR標(biāo)記被電子定位到番茄染色體上，不同染色體來(lái)源的標(biāo)記通用率明顯不同；93對(duì)引物在2份用于遺傳圖譜構(gòu)建的栽培茄子親本間表現(xiàn)出多態(tài)性；獲得的425對(duì)通用引物在馬鈴薯、辣椒、枸杞上通用率分別為96.2%、78.1%、54.1%.

番茄；茄子；SSR標(biāo)記；通用性；茄科蔬菜

目前，多種分子標(biāo)記技術(shù)可以用于分子遺傳研究，其中微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite），又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、檢測(cè)方便、標(biāo)記多呈共顯性、在基因組中分散分布等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測(cè)及目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選［1］.微衛(wèi)星標(biāo)記已成為分子育種中最重要的遺傳標(biāo)記之一.

由于微衛(wèi)星標(biāo)記具有種族特異性，使用SSR標(biāo)記的前提是要知道重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列，因而存在引物開發(fā)的問(wèn)題.獲取微衛(wèi)星標(biāo)記的方法主要有基因組測(cè)序法、篩選基因組文庫(kù)法、微衛(wèi)星富集法、數(shù)據(jù)庫(kù)查找法和近緣物種轉(zhuǎn)移法等5種［2］.目前茄科作物中番茄、馬鈴薯已經(jīng)完成基因組測(cè)序［3-4］，可以發(fā)展海量的SSR標(biāo)記，但在其他茄科作物上可供利用的SSR標(biāo)記數(shù)目不多，還不能滿足這些作物分子育種的需要，有必要發(fā)展更多的SSR標(biāo)記.

近緣物種轉(zhuǎn)移法是一種簡(jiǎn)便快速地發(fā)展SSR標(biāo)記的方法，微衛(wèi)星側(cè)翼序列在屬內(nèi)種間、甚至在科內(nèi)屬間是保守的、相似的，因此，同種、屬、科的不同物種可以使用同一種微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增.茄科作物種類較多，比較基因組學(xué)研究已經(jīng)證明茄科作物間基因組保守性較強(qiáng)［5-7］.根據(jù)番茄基因組序列已發(fā)展了大量SSR標(biāo)記，本文對(duì)這些標(biāo)記在茄子及其他茄科蔬菜作物上的通用性進(jìn)行了研究，以期將部分標(biāo)記轉(zhuǎn)移到茄子上，節(jié)省開發(fā)茄子SSR標(biāo)記的成本.

1 材料與方法

1.1 植物材料及DNA提取

供試材料：栽培番茄“860”（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組選育），栽培茄子“湖南小圓茄”（湖南省收集的地方品種）、“Blacknite”（澳大利亞購(gòu)買的常規(guī)品種），3個(gè)材料均經(jīng)多代純化；辣椒為“東方神劍”品種，馬鈴薯、枸杞為廣州岑村蔬菜基地采集，品種名未知.

上述材料均取1～2片幼葉，按Hemming等［8］的方法提取各植物材料的總DNA.

1.2 SSR標(biāo)記及方法

共試驗(yàn)了1 046對(duì)番茄SSR引物.其中112對(duì) EST-SSR引物根據(jù)SGN網(wǎng)站（http：∥sgn.cornell. edu）及He等［9］公布的引物序列合成；32對(duì)基因組SSR根據(jù)Suliman-Pollatschek等［10］公布的引物序列合成；902對(duì)基因組SSR由課題組根據(jù)番茄BAC末端序列、基因組序列設(shè)計(jì)，引物序列暫時(shí)未公布.

20μL PCR反應(yīng)體系中包括0.15μmol·L-1的引物、200μmol·L-1dNTPs、1×PCR反應(yīng)緩沖液、50～100 ng的DNA模板、1 UTaq酶.反應(yīng)在PE9700型熱循環(huán)儀中進(jìn)行.所用的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺變性膠電泳，250 V條件下穩(wěn)壓電泳約3 h；普通銀染顯帶，數(shù)碼相機(jī)照相.對(duì)擴(kuò)增模糊、無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR標(biāo)記進(jìn)行2次分析，以確保該結(jié)果不是由PCR擴(kuò)增失敗引起.

1.3 SSR標(biāo)記電子定位

在SGN網(wǎng)站提供的Blastn界面將SSR引物序列與番茄基因組序列（版本2.4）進(jìn)行比對(duì)，確定標(biāo)記在番茄染色體上的位置.

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SSR引物在茄子基因組DNA上的擴(kuò)增情況

根據(jù)電泳后主帶的情況，在茄子基因組DNA上番茄SSR引物的擴(kuò)增帶型（圖1）出現(xiàn)以下幾種類型：1）擴(kuò)增出較強(qiáng)的主帶，茄子與番茄有1條主帶的大小非常一致（標(biāo)記SSRD105、SSR85）；2）擴(kuò)增出較強(qiáng)的主帶，茄子與番茄有1條主帶的大小相差不大（標(biāo)記SSR48、SSRD198）；3）擴(kuò)增出多條主帶，且與番茄主帶無(wú)對(duì)應(yīng)條帶；4）擴(kuò)增出多條弱帶；5）不能擴(kuò)增出任何條帶.

試驗(yàn)共檢測(cè)了1 046對(duì)番茄SSR引物，有887對(duì)在茄子基因組DNA上擴(kuò)增出了產(chǎn)物，642對(duì)引物擴(kuò)增出了第1、第2、第3種類型較強(qiáng)的主帶，占總標(biāo)記數(shù)的61.4%，其中第1種引物135對(duì)，第2種引物290對(duì)（163對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物比番茄大，127對(duì)比番茄?。?、2種引物擴(kuò)增出的帶型在番茄與茄子間相似程度高，可以轉(zhuǎn)用到茄子上，以此得到標(biāo)記的通用率為40.6%.

圖1 番茄SSR引物在茄子和番茄DNA上擴(kuò)增出的帶型Fig.1 The band patterns of tomato SSR markers amplified on eggplant and tomato DNAs

比較EST-SSR與基因組SSR的擴(kuò)增情況：試驗(yàn)共檢測(cè)了112對(duì)番茄EST-SSR引物，結(jié)果有98對(duì)能有效擴(kuò)增，95對(duì)能擴(kuò)增出清晰主帶，其中61對(duì)為第1、2種引物，可以在茄子上通用，通用率為54.5%；試驗(yàn)共檢測(cè)了934對(duì)番茄基因組SSR引物，結(jié)果有789對(duì)能有效擴(kuò)增，529對(duì)能擴(kuò)增出清晰主帶，其中364對(duì)為第1、2種引物，可以在茄子上通用，通用率為38.9%.說(shuō)明EST-SSR比基因組SSR的通用性明顯要好.

2.2 引物通用性與基序長(zhǎng)度的關(guān)系

對(duì)在茄子上能通用的番茄SSR引物標(biāo)記位點(diǎn)重復(fù)序列按基序長(zhǎng)度進(jìn)行分類，結(jié)果（圖2）表明，通用SSR無(wú)論來(lái)源于EST還是基因組，2核苷酸基序出現(xiàn)的頻率最大，3核苷酸基序出現(xiàn)頻率次之，但2核苷酸基序出現(xiàn)頻率基因組SSR大于EST-SSR，而3核苷酸基序出現(xiàn)頻率是EST-SSR明顯高于基因組SSR，其他核苷酸基序類型（4、5、6核苷酸）出現(xiàn)頻率在基因組SSR和EST-SSR間差別不大.

圖2 番茄SSR不同長(zhǎng)度基序的頻率分布Fig.2 The frequency distributions of differentmotifs of tomato SSR

2.3 保守SSR標(biāo)記在番茄染色體上的分布

將1 046對(duì)番茄SSR引物與番茄基因組序列比對(duì)進(jìn)行電子定位，結(jié)果有15對(duì)不能定位，有33對(duì)定位于染色體0（即測(cè)序后不能組裝的序列），998對(duì)能定位到番茄的各條染色體上；番茄、茄子間保守的425對(duì)引物中，3對(duì)不能定位，8對(duì)定位于染色體0，414對(duì)能定位到各條染色體上.對(duì)414對(duì)標(biāo)記的定位結(jié)果按EST-SSR、基因組SSR進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1.從表1中可以看出，通用SSR標(biāo)記比率在不同染色體上明顯不同，染色體9上標(biāo)記的通用率最高（60.5%），染色體10次之（53.3%）；而染色體7上標(biāo)記的通用率最低（29.2%），其次是染色體12（31.7%）.

2.4 保守引物在2份茄子間的多態(tài)性

425對(duì)在茄子上能有效擴(kuò)增的番茄引物中，有67對(duì)能在2份栽培茄子間擴(kuò)增出多態(tài)條帶，多態(tài)標(biāo)記比率為15.8%.由此看來(lái)，盡管SSR引物的通用性較高，但在茄子不同材料上的多態(tài)性比例較低，這可能是因?yàn)橛糜诙鄳B(tài)性比較的2個(gè)茄子親本都來(lái)源于栽培種，親緣關(guān)系比較近.

在2份栽培茄子間擴(kuò)增出多態(tài)性的引物中，部分標(biāo)記帶型表現(xiàn)為長(zhǎng)度大小的差別，而且相差只有幾個(gè)堿基，可能為共顯性標(biāo)記，但需要使用F1進(jìn)行驗(yàn)證；部分標(biāo)記帶型為有無(wú)的差別，表現(xiàn)為顯性標(biāo)記特性.

2.5 保守引物在其他茄科作物上的通用性

對(duì)番茄、茄子間保守的425對(duì)SSR引物在其他茄科蔬菜上的通用性進(jìn)一步檢查，在馬鈴薯、辣椒、枸杞上分別有96.2%、78.1%、54.1%的引物能擴(kuò)增出第1、2種帶型.

表1 通用SSR標(biāo)記在番茄染色體上的分布Tab.1 The chromosome distribution of transferable tomato SSR markers

3 討論與結(jié)論

SSR標(biāo)記在茄科作物間具有一定的通用性.邵光金等［11］證明茄子的SSR標(biāo)記可以應(yīng)用于番茄；陳曉瑩［12］證明番茄SSR可以用于辣椒.本試驗(yàn)進(jìn)一步證明番茄SSR標(biāo)記可以應(yīng)用于茄子、馬鈴薯、辣椒和枸杞.由于番茄、馬鈴薯已經(jīng)進(jìn)行了全基因組測(cè)序，可以發(fā)展出海量的SSR標(biāo)記，將這些標(biāo)記轉(zhuǎn)移到其他未測(cè)序的茄科作物上，可以大大節(jié)省標(biāo)記開發(fā)的成本.

目前茄子上開發(fā)出的SSR標(biāo)記不多，有必要發(fā)展更多的SSR標(biāo)記.Stàgel等［13］利用數(shù)據(jù)庫(kù)序列發(fā)展了50對(duì)EST-SSR，其中有39對(duì)能成功擴(kuò)增；Nunome等［14］于2003年通過(guò)篩選基因組文庫(kù)的方法發(fā)展了37對(duì)SSR引物，其中23對(duì)能成功擴(kuò)增；該課題組隨后再通過(guò)篩選基因組文庫(kù)的方法發(fā)展了2 265對(duì)SSR引物，但只在文章中公布了用于構(gòu)建SSR遺傳圖譜的300多對(duì)引物序列［15-16］.盧婷等［17］用23對(duì)番茄SSR標(biāo)記應(yīng)用于茄子聚類分析，證明番茄SSR標(biāo)記可以在茄子上部分通用.本研究進(jìn)一步擴(kuò)大了試用標(biāo)記的數(shù)量，將425個(gè)番茄SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)用到茄子上，并找到在茄子作圖親本間具有多態(tài)性的67個(gè)標(biāo)記，這不僅為茄子遺傳圖譜構(gòu)建及基因定位奠定了基礎(chǔ)，而且可以進(jìn)一步用這些標(biāo)記做錨定標(biāo)記，進(jìn)行番茄、茄子間的比較基因組作圖，這將比應(yīng)用COS標(biāo)記進(jìn)行比較作圖簡(jiǎn)便得多［5］.番茄已經(jīng)完成了全基因組測(cè)序，番茄、茄子間錨定標(biāo)記的獲得，將為利用基因組間的微共線性發(fā)展加密標(biāo)記及基因克隆提供參考.

試驗(yàn)中部分標(biāo)記不能被電子定位，可能原因有三：一是未定位標(biāo)記存在于番茄基因組測(cè)序的gap區(qū)域；二是本試驗(yàn)部分標(biāo)記是根據(jù)番茄的BAC末端發(fā)展的，而BAC末端測(cè)序是單一read，存在一定的測(cè)序錯(cuò)誤，和基因組序列比對(duì)不上；三是EST-SSR及來(lái)自Suliman-Pollatschek等［10］研究的基因組SSR，所用的原始番茄材料與番茄測(cè)序材料不同.

本研究發(fā)展的SSR標(biāo)記通用性比十字花科作物低，崔秀敏等［18］的研究結(jié)果表明，69對(duì)不結(jié)球白菜SSR引物在蕓苔屬其他8種作物上的通用性擴(kuò)增率在49.3%～85.5%，而且33%的SSR引物在蕓薹屬近緣種間具有豐富的多態(tài)性.為了提高標(biāo)記的通用性，可對(duì)進(jìn)行番茄和馬鈴薯全基因組序列比對(duì)，在保守位點(diǎn)發(fā)展標(biāo)記，并適當(dāng)引入簡(jiǎn)并堿基，從而實(shí)現(xiàn)1套引物在不同茄科作物間通用.

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【責(zé)任編輯霍 歡】

Transferability of tomato SSR markers to eggplants and other Solanaceous vegetables

WANG Guoping1，NIU Yu1，2，WANGWenyi1，YUE Suju3，LIN Jianrong4
（1 College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2 Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences，Danzhou 571737，China；3 College of Life Sciences，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；4 Guangzhou Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510308，China）

【Objective】Tomato genome was sequenced and a large number of SSR markers could be obtained.Cross-species amplification of tomato SSR markers will be an economic method to add up the number of robust SSR markers in eggplant and Solanaceous vegetables.【Method】This study tested a large set of tomato SSR markers on eggplant and other Solanaceous vegetables by close relative species transfermethod.【Result and conclusion】887 out of 1046 tested tomato SSR markers could successfully amplify on eggplants，but only 425 produced very similar bands on tomatoes and eggplants，giving a transfer rate of 40.6%.EST-SSRmarkerswere found to bemore transferable than genomic SSRmarkers（54.5 and 38.9%respectively）.414 transferable SSR markersweremapped electronically onto tomato genome and their distribution on individual chromosomes highly varied.93 SSRmarkers showed polymor-phism on two eggplant parents used for genetic map construction.When testing 425 cross-species SSR markers on potatoes，peppers and lycium，the transferability rates were 96.2%，78.1%and 54.1%，respectively.

tomato；eggplant；SSR markers；transferability；Solanaceous vegetables

S641.2

A

1001-411X（2014）04-0056-05

2013-04-10優(yōu)先出版時(shí)間：2014-06-03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net／kcms／doi／10.7671／j.issn.1001-411X.2014.04.011.html

汪國(guó)平（1967—），男，副教授，博士，E-mail:gpwang＠scau.edu.cn

科技部國(guó)際合作項(xiàng)目（2010DFA32190）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31171957，30771472）；廣東省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目（2009B050100001，2011B050100013）；廣州市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2010Z1-E381）

汪國(guó)平，牛 玉，汪文毅，等.番茄SSR標(biāo)記在茄子及其他茄科作物上的通用性分析［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（4）：56-60.