張曉溪，李蘭玉，劉慶友，鄭海學(xué)，李湘萍，崔奎青，石德順

（1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046）

慢病毒介導(dǎo)多短發(fā)卡RNA串聯(lián)載體構(gòu)建與體內(nèi)外抗口蹄疫效果評估

張曉溪1，李蘭玉1，劉慶友1，鄭海學(xué)2，李湘萍1，崔奎青1，石德順1

（1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046）

【目的】探討應(yīng)用多短發(fā)卡RNA（shRNA）串聯(lián)沉默口蹄疫病毒RNA復(fù)制的可行性.【方法】針對口蹄疫病毒（Foot and mouth disease，F(xiàn)MDV）非結(jié)構(gòu)蛋白基因3B和3D保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成3個(gè)shRNA的串聯(lián)片段，并分別用3個(gè)不同序列的啟動(dòng)子引導(dǎo)，成功構(gòu)建了3shRNA串聯(lián)的慢病毒RNAi載體.利用慢病毒3質(zhì)粒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)于293T細(xì)胞包裝成慢病毒顆粒.利用包裝的慢病毒處理細(xì)胞及乳鼠，并接種FMDV，觀察FMDV抑制情況.【結(jié)果和結(jié)論】結(jié)果顯示，慢病毒處理BHK-21獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中檢測shRNA表達(dá)；通過O型FMDV接種發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對口蹄疫病毒的復(fù)制有明顯的抑制，其中在接種后24 h病毒拷貝量僅為普通細(xì)胞的1／3；O型FMDV毒株接種于抗口蹄疫慢病毒載體預(yù)處理過的3～5日齡乳鼠，在5 LD50滴度下全部乳鼠均存活，在20 LD50滴度下存活率也提高50%.構(gòu)建的慢病毒介導(dǎo)多shRNA串聯(lián)表達(dá)抗口蹄疫載體能提高BHK-21細(xì)胞和乳鼠對口蹄疫病毒的抵抗力，有效地避免了5 LD50滴度內(nèi)乳鼠的死亡現(xiàn)象，具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能.

口蹄疫病毒；多shRNA；慢病毒載體；抗病毒

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD），是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的以侵害偶蹄動(dòng)物為主的急性、熱性、高度接觸性人畜共患傳染病，在國際上受到高度重視.該病毒屬于小RNA病毒科FMDV屬，有O型、A型、C型、SATⅠ型、SATⅡ型、SATⅢ型及AsiaⅠ型等7個(gè)血清型，70多個(gè)亞型，各型之間無交叉反應(yīng).流行病學(xué)調(diào)查和試驗(yàn)感染證明，有100多種動(dòng)物可以感染.口蹄疫已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World organization of animal health，OIE）列為A類動(dòng)物傳染病之首.至今，科學(xué)家們已針對FMDV不同基因在細(xì)胞和動(dòng)物等不同水平對RNAi抗FMDV效果進(jìn)行了研究和探索［1-4］.有報(bào)道指出，在長期使用siRNA抑制病毒復(fù)制的治療過程中會(huì)使病毒基因變異而產(chǎn)生RNAi抗性，導(dǎo)致病毒逃逸［5-6］.而為了解決這一問題，人們開始將病毒基因組保守區(qū)或同時(shí)以不同基因序列作為靶基因［6-9］.經(jīng)過科學(xué)家們多年研究表明，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的shRNA分子比在細(xì)胞中直接導(dǎo)入siRNA對靶基因的抑制效率高；而shRNAs通過轉(zhuǎn)染可整合基因的質(zhì)粒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體進(jìn)行表達(dá)，能夠穩(wěn)定長效地抑制靶基因表達(dá)［10］.2008年，Brake等［11］對慢病毒介導(dǎo)幾種shRNAs以不同的啟動(dòng)子進(jìn)行多重shRNA表達(dá)從而抑制HIV-1復(fù)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載體中每個(gè)shRNA的表達(dá)與單獨(dú)表達(dá)這些shRNA的效率基本一致.這樣的多個(gè)shRNA串聯(lián)表達(dá)載體設(shè)計(jì)可以在轉(zhuǎn)入載體量不變的條件下整體增加shRNA表達(dá)的效率.本研究擬選取高度保守的適于設(shè)計(jì)shRNA的位點(diǎn)，以多個(gè)shRNA串聯(lián)表達(dá)的載體形式，構(gòu)建靶向FMDV的shRNA表達(dá)載體，并且對表達(dá)的siRNA在體外和體內(nèi)抑制口蹄疫病毒復(fù)制的能力進(jìn)行了評估，為進(jìn)一步生產(chǎn)抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

慢病毒3質(zhì)粒包裝系統(tǒng)（pNRF、pVsvg和pSicoR）、293T細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行保存；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；試驗(yàn)用昆明小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供.所有涉及FMDV試驗(yàn)操作均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行.

1.2 主要試驗(yàn)方法

1.2.1 選擇抗口蹄疫shRNA 通過比對O、Asia I、A、C等血清型不同毒株的FMDV基因組序列（AF189157、AY304994、AY593751和AF274010），選擇非結(jié)構(gòu)蛋白基因3B和3D的保守區(qū)間設(shè)計(jì)3段shRNA，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

1.2.2 構(gòu)建多shRNA串聯(lián)抗口蹄疫表達(dá)質(zhì)粒 將水牛7SK啟動(dòng)子（JN417658）、水牛U6啟動(dòng)子（JN417659）以及牛U6啟動(dòng)子（DQ150532）分別連接在3個(gè)shRNA的5′端，并將3組shRNA表達(dá)框串聯(lián)，以慢病毒載體質(zhì)粒pSicoR為載體骨架，構(gòu)建成多個(gè)抗口蹄疫shRNA表達(dá)載體pSicoR-3shRNA.獲得的質(zhì)粒pSicoR-3shRNA屬于慢病毒載體中的載體質(zhì)粒.

1.2.3 包裝慢病毒和測定滴度 將293T細(xì)胞傳代至事先鋪過明膠的培養(yǎng)皿中，使293T細(xì)胞貼壁能力增強(qiáng)，減少其在轉(zhuǎn)染過程中的脫落.用脂質(zhì)體法將載體質(zhì)粒pSicoR-3shRNA與慢病毒包裝質(zhì)粒pNRF、包膜質(zhì)粒pVsvg以2∶3∶1的比例共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞中.轉(zhuǎn)染后24 h觀察熒光情況.此時(shí)pVsvg表達(dá)形成的病毒衣殼會(huì)導(dǎo)致293T細(xì)胞變形，但不影響病毒的形成.轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞上清液，3 000 r／min離心10 min，以去除細(xì)胞碎片，0.45μm濾器過濾，其中一小部分分裝成500μL／管，-80℃條件冷凍保存.取10μL病毒原液用Reed-Muench法進(jìn)行慢病毒滴度測定.

1.2.4 制備慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因BHK-21細(xì)胞與檢測shRNA表達(dá) 將500μL病毒原液成滴加入BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃以使培養(yǎng)基混合均勻，置于37℃CO2培養(yǎng)箱孵育12～24 h后，換成含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)基.感染72 h后通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況；通過流式細(xì)胞儀分選，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系（BHK-LV）.利用莖-環(huán)RT-PCR法，以U6基因作為內(nèi)參基因，檢測3條shRNA表達(dá)情況.

1.2.5 繪制FMDV在BHK-LV中的復(fù)制曲線 將BHK-LV和普通BHK-21細(xì)胞以2×105mL-1分別接種于7個(gè)24孔板中，24 h后，將O型口蹄疫病毒HKN／2002以毎細(xì)胞5×103TCID50的比例接種于細(xì)胞中.分別在接毒后6、12、18、24、36和48 h收集細(xì)胞及所有上清液.各取200μL收集的細(xì)胞混合液至96孔R(shí)NA提取板中，用QIAGEN全自動(dòng)高通量核酸提取工作站（QIAxtractor）提取總RNA后，吸取等體積的總RNA，根據(jù)Shaw等［12］的文獻(xiàn)報(bào)道，用Super-ScriptⅢ／Platinum Taq One-Step rRT-PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR.根據(jù)相關(guān)報(bào)道［13］，以FMDV基因組的5′端UTR區(qū)保守序列為靶序列設(shè)計(jì)Taq Man?引物（SA-IR-219-246F和SA-IR-315-293R）以及探針（SAmulti2-P-IR-292-269R）.定量PCR試驗(yàn)步驟參考SuperScriptⅢ／Platinum Taq One-Step rRT-PCR試劑盒使用說明書進(jìn)行.

定量PCR反應(yīng)結(jié)果測定、分析均利用Stratagene? MxProTMQPCR軟件獲得［13］.通過FMDV復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒RNA拷貝數(shù)，繪制細(xì)胞中O型FMDV 1～48 h內(nèi)的病毒復(fù)制曲線.

1.2.6 抗口蹄疫慢病毒載體的乳鼠FMDV抗性試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)中，先對FMDV在本次試驗(yàn)用的昆明小鼠上的LD50進(jìn)行校正.將本次啟用的O型FMDV原液用PBS緩沖液進(jìn)行10倍稀釋，并用105～108稀釋度的病毒液分別對每組4只小鼠進(jìn)行頸后皮下接種，每組各設(shè)1只小鼠用生理鹽水注射作為陰性對照，接種后72 h觀察小鼠死亡情況.

將滴度＞1×108TU／mL的純化抗口蹄疫慢病毒顆粒（LV-3shRNA）用PBS稀釋10倍，以每只0.2mL的劑量頸后皮下注射3～5日齡乳鼠，陰性對照用PBS代替慢病毒接種（表1）.經(jīng)LV-3shRNA處理24 h后，每只乳鼠頸后皮下分別注射5、20、100和1 000 LD50滴度的O型FMDV 0.2 mL.各滴度組乳鼠數(shù)量見表1.接毒后12、24、30、36、48、72 h和7 d觀察LV-3shRNA組及陰性對照組各滴度接種鼠的死亡情況.7 d后每個(gè)滴度組各選擇1只乳鼠，提取RNA，用SuperScriptⅢ／Platinum Taq One-Step rRT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測病毒含量.

表1 試驗(yàn)乳鼠的分組Tab.1 Grouping the experimental sucklingm ice

2 結(jié)果與分析

2.1 多shRNA串聯(lián)抗口蹄疫表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)GenBank上O型FMDV基因組序列（AF189157），選擇3個(gè)FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白基因3B和3D保守區(qū)間：（1）3B區(qū)域中5′-CCT GTC GCT TTG AAA GTG AAA GC-3′位于4 900～4 922 nt；（2）3D區(qū)域中5′-GAG ATT CCA AGC TAC AGA TCA CTT TAC CTG CGT TGG GTG AAC GCC GTG TGC GGT GAC GC-3′位于6 934～6 992 nt；（3）3D區(qū)域中5′-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTT GAG CC-3′位于6 892～6 917 nt［1］.設(shè)計(jì)3個(gè)shRNA，其序列如圖1A.

將啟動(dòng)子依次連入3個(gè)shRNA串聯(lián)序列后，得到p18T-3shRNA，用XbaⅠ／NotⅠ雙酶切得到的片段（XbaⅠ-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-loxPNotⅠ）約1 298 bp.多個(gè)抗口蹄疫shRNA表達(dá)載體pSicoR-3shRNA結(jié)構(gòu)如圖1B.

圖1 shRNA序列和抗口蹄疫載體構(gòu)建Fig.1 Sequences and expression vector constructions ofmultiple FMDV-specific shRNAs

2.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV制備和陽性細(xì)胞表達(dá)檢測

應(yīng)用QIAGENE去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒，獲得高質(zhì)量的pSicoR-3shRNA、pNRF與pVsvg載體質(zhì)粒.將3個(gè)慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72 h后在熒光倒置顯微鏡488 nm波長藍(lán)光下觀察綠色熒光表達(dá)情況，如圖2A顯示，接近100%的293T細(xì)胞檢測到綠色熒光，部分細(xì)胞之間無明顯間隙，細(xì)胞有明顯拉絲現(xiàn)象，說明細(xì)胞已經(jīng)開始生產(chǎn)慢病毒顆粒.此時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為慢病毒原液.將大量收集的慢病毒原液，經(jīng)超速離心機(jī)30 000 r／min離心30min后，用PBS重懸病毒沉淀，得到純化慢病毒載體.純化后慢病毒PBS稀釋液滴度測定結(jié)果如圖2B.滴度測定結(jié)果顯示，包裝出的LV-3shRNA慢病毒載體滴度大約為1×108TU／mL.

圖2 慢病毒包裝（A）及滴度測定（B）結(jié)果Fig.2 Lentivirus package（A）and titre detection（B）

用未純化的慢病毒原液感染BHK-21細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞分選后，陽性細(xì)胞率接近100%（圖3）.收集部分轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV，提取總RNA，應(yīng)用莖-環(huán)法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR.定量PCR結(jié)果顯示，3個(gè)針對FMDV的shRNA在BHK-LV細(xì)胞中均有表達(dá)，而在普通BHK-21細(xì)胞中幾乎沒有表達(dá).比較3個(gè)shRNA的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Cons1相對表達(dá)量最高，而Cons3的表達(dá)量相對最低（圖4）.

圖3 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV（200×）Fig.3 The transgenic cells BHK-LV under fluorescence microscope（200×）

圖4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV中3個(gè)shRNA表達(dá)量Fig.4 The bar graph of the expression of3 shRNAs in the transgenic cells BHK-LV

2.3 FMDV在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況

根據(jù)10倍梯度稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品所得的Ct值和拷貝數(shù)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，y＝-3.416x+ 42.850，R2值為0.998，并且計(jì)算出引物的擴(kuò)增效率為96%.

用O型口蹄疫病毒HKN／2002感染轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV，分別在1、6、12、18、24、36和48 h等7個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及上清液，提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，以測定病毒RNA拷貝數(shù).用線性圖（圖5）表示等量的FMDV病毒在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和普通細(xì)胞中復(fù)制情況.結(jié)果顯示，接107TCID50O型FMDV強(qiáng)毒后6 h時(shí)，圖5中復(fù)制曲線上2種細(xì)胞病毒RNA拷貝數(shù)幾乎沒有差別，因此這一時(shí)間點(diǎn)可視為shRNA作用導(dǎo)致病毒復(fù)制差異的起始點(diǎn)，此時(shí)，2種細(xì)胞的病毒RNA拷貝數(shù)均達(dá)到約1.50×107.在接毒后12 h時(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV中病毒拷貝數(shù)明顯低于普通細(xì)胞BHK-21中的病毒.而24 h時(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV中的病毒量減少到普通細(xì)胞BHK-21中的約1／3，直到48 h時(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞仍表現(xiàn)出一定的抑制效果.

圖5 FMDV在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV中的復(fù)制曲線Fig.5 The application curve of FMDV in transgenic cells BHKLV

2.4 慢病毒LV-3shRNA處理乳鼠的抗FMDV感染力

預(yù)試驗(yàn)接種后72 h觀察結(jié)果顯示，稀釋度105～107組的昆明小鼠均無存活，而稀釋度108組有2／4的小鼠存活，4組的陰性對照小鼠均正常存活，故確定該批次FMDV的LD50為108稀釋度.

將純化后的LV-3shRNA經(jīng)PBS稀釋，頸后皮下注射0.2 mL試驗(yàn)乳鼠（LV-3shRNA組）及PBS處理的陰性對照乳鼠，72 h后均分別以不同滴度的O型FMDV攻毒，觀察乳鼠在各時(shí)間點(diǎn)發(fā)病、瀕死或死亡的情況.檢測結(jié)果顯示，接毒后72 h內(nèi)NC組在5 LD50滴度下有2只乳鼠發(fā)病死亡，在20 LD50滴度下無乳鼠存活；而LV-3shRNA組在5 LD50滴度下沒有乳鼠發(fā)病死亡，在20 LD50滴度下仍有3只乳鼠存活至第7天；此外LV-3shRNA組在1 000、100、20和5 LD50滴度攻擊時(shí)，其死亡乳鼠的存活時(shí)間相比NC組均有所延長（圖6）.在各滴度內(nèi)隨機(jī)選取1只乳鼠解剖，取等質(zhì)量胴體提取RNA，對3D基因定量檢測結(jié)果顯示，在1 000和100 LD50滴度內(nèi)，LV-3shRNA組樣品中病毒含量的log10值分別為8.1和7.4，而陰性對照組樣品同滴度測定數(shù)值分別為8.1和7.5，兩組數(shù)值無顯著差別.而LV-3shRNA組20和5 LD50滴度內(nèi)存活乳鼠的胴體樣品中，病毒含量的log10值分別為5.4和4.6，這明顯低于陰性對照組中死亡乳鼠樣品中的數(shù)值6.9和6.7（圖6）.

圖6 慢病毒處理乳鼠抵抗FMDV能力檢測Fig.6 The detection of Anti-FMDV ability of lentivirus-treated suckingmice

3 討論

本研究借鑒Kahana等［1］研究，設(shè)計(jì)了3個(gè)shRNA，并用新克隆的水牛RNA聚合酶III啟動(dòng)子來引導(dǎo)，希望整合這些基因后，能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出高效siRNA，以達(dá)到提高細(xì)胞甚至動(dòng)物對FMDV的抵抗力.此外筆者設(shè)計(jì)了多個(gè)shRNA串聯(lián)表達(dá)的結(jié)構(gòu)，并分別用不同的啟動(dòng)子引導(dǎo)，使轉(zhuǎn)入的載體能同時(shí)表達(dá)多個(gè)shRNA，而每個(gè)shRNA表達(dá)的效率與單個(gè)shRNA表達(dá)載體的效率無顯著差別［11］.這樣的結(jié)構(gòu)一方面避免了多次轉(zhuǎn)染以及多次慢病毒包裝帶來的不便和對細(xì)胞或動(dòng)物帶來的不必要的損傷；另一方面這樣的針對多個(gè)位點(diǎn)的shRNA表達(dá)，能有效地降低病毒逃逸的幾率［11］.本研究利用第3代慢病毒載體3質(zhì)粒系統(tǒng)，構(gòu)建多個(gè)抗口蹄疫shRNA表達(dá)慢病毒載體.慢病毒載體因其轉(zhuǎn)染效率、整合效率高，且既可轉(zhuǎn)染處于有絲分裂活躍期的細(xì)胞，又可轉(zhuǎn)染分裂緩慢及處于分裂終末期的細(xì)胞，受到科學(xué)家們的青睞，成為體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移的一種有效方便的工具.由于BHK-21是公認(rèn)的FMDV感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，本研究選擇BHK-21制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞.通過檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中3個(gè)shRNA的表達(dá)量，確保該多個(gè)抗口蹄疫shRNA表達(dá)載體的有效性，以保證抑制FMDV復(fù)制試驗(yàn)的可行性和真實(shí)性.RNAi的作用時(shí)間短和病毒的抑制效率低一直是RNAi用于病毒防治上的一個(gè)挑戰(zhàn)［14］.在2004年Chen等［15］報(bào)道中，構(gòu)建了針對FMDV的1D基因的shRNA表達(dá)載體，在BHK-21中沒有產(chǎn)生對FMDV完全抑制的效果.同樣，科學(xué)家們在IBR-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針對2B基因的shRNA表達(dá)載體［3］，以及在BHK-21中直接轉(zhuǎn)染化學(xué)合成或通過Cocktail試劑盒合成的siRNA，所得結(jié)果也是相似的［2，4］.在本研究中，用高滴度的慢病毒載體作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的介導(dǎo)表達(dá)載體，是為了更高效地獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞.在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞BHK-LV抑制病毒復(fù)制試驗(yàn)中，為了證明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞抑制FMDV的能力，本研究對普通和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞接種107TCID50O型FMDV（HKN／2002），這個(gè)劑量是常規(guī)檢測劑量的104倍［2，15-17］.通過觀察試驗(yàn)結(jié)果，在高滴度FMDV感染下，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞具有的穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)shRNA并能有效減少2／3的病毒量，達(dá)到超過50%的抑制率，從功能上證明這個(gè)多抗口蹄疫shRNA在慢病毒載體中得以有效表達(dá).

在細(xì)胞水平上驗(yàn)證抗口蹄疫慢病毒載體對FMDV的抑制能力后，本試驗(yàn)進(jìn)一步在3～5日齡的小鼠中驗(yàn)證多shRNA表達(dá)慢病毒載體抵御FMDV的能力.之前的相關(guān)報(bào)道中，人們曾用單一針對口蹄疫病毒shRNA的表達(dá)質(zhì)粒以及腺病毒載體注射入小鼠［18］、豚鼠或仔豬［17］體內(nèi)，之后接種FMDV，通過觀察動(dòng)物的發(fā)病率或死亡率發(fā)現(xiàn)，在乳鼠5 LD50（半數(shù)致死量）以及豚鼠和豬的50 ID50（半數(shù)傳染量）內(nèi)載體對動(dòng)物有一定保護(hù)效果，而FMDV高滴度下均對動(dòng)物無保護(hù)效果.本試驗(yàn)通過超速離心，獲得高度純化的多個(gè)抗口蹄疫shRNA表達(dá)慢病毒顆粒，以確保其在動(dòng)物體中的轉(zhuǎn)染效率.預(yù)處理慢病毒載體的乳鼠在5 LD50的滴度下均得到存活，而且在20 LD50的滴度下死亡率僅為1／4.這樣的試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于之前的相關(guān)報(bào)道［17-18］，進(jìn)一步證明多個(gè)shRNA表達(dá)慢病毒載體在動(dòng)物體內(nèi)抗病毒作用比單個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒或腺病毒載體明顯.

預(yù)處理LV-3shRNA的乳鼠能成功獲得較強(qiáng)的FMDV抗性，從一定程度上證明了慢病毒載體的免疫注射對于病毒病的防治是有效的，這為進(jìn)一步探討多個(gè)shRNA串聯(lián)表達(dá)抗口蹄疫慢病毒載體介導(dǎo)的基因治療在偶蹄類家畜中的應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)，也為通過轉(zhuǎn)基因方法改良家畜品種、提高抗病能力這一途徑奠定了基礎(chǔ).

［1］ KAHANA R，KUZNETZOVA L，ROGEL A，et al.Inhibition of foot-and-mouth disease virus replication by small interfering RNA［J］.J Gen Virol，2004，85（Pt 11）：3213-3217.

［2］ LIU Mingqiu，CHENWeizao，NIZheng，et al.Cross-inhibition to heterologous foot-and-mouth disease virus infection induced by RNA interference targeting the conserved regions of viral genome［J］.Virology，2005，336（1）：51-59.

［3］ DE LOSSANTOST，WU Qiaohua，DE AVILA BOTTON S，et al.Short hairpin RNA targeted to the highly conserved 2B nonstructural protein coding region inhibits replication ofmultiple serotypes of foot-and-mouth disease virus［J］.Virology，2005，335（2）：222-231.

［4］ MOHAPATRA JK，SANYAL A，HEMADRID，et al.E-valuation of in vitro inhibitory potential of small interfering RNAs directed against various regions of foot-and-mouth disease virus genome［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，329（3）：1133-1138.

［5］ DASA T，BRUMMELKAMP T R，WESTERHOUT E M，et al.Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition［J］.JVirol，2004，78（5）：2601-2605.

［6］ GITLIN L，STONE J K，ANDINO R.Poliovirus escape from RNA interference：Short interfering RNA-target recognition and implications for therapeutic approaches［J］.J Virol，2005，79（2）：1027-1035.

［7］ CHANG L J，LIU X，HE J.Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences ofhuman immunodeficiency virus type 1［J］.Gene Ther，2005，12（14）：1133-1144.

［8］ DAVE R S，POMERANTZR J.Antiviral effects of human immunodeficiency virus type 1-specific small interfering RNAs against targets conserved in select neurotropic viral strains［J］.JVirol，2004，78（24）：13687-13696.

［9］ GEISBERT TW，HENSLEY L E，KAGAN E，etal.Postexposure protection of guinea pigs against a lethal ebola virus challenge is conferred by RNA interference［J］.J Infect Dis，2006，193（12）：1650-1657.

［10］SONG Erwei，LEE SK，WANG Jie，et al.RNA interference targeting fas protects mice from fulminant hepatitis［J］.Nat Med，2003，9（3）：347-351.

［11］TER BRAKEO，′THOOFT K，LIU Y P，etal.Lentiviral vector design for multiple shRNA expression and durable HIV-1 inhibition［J］.Mol Ther，2008，16（3）：557-564.

［12］SHAW A E，REID SM，EBERT K，et al.Implementation of a one-step real-time RT-PCR protocol for diagnosis of foot-and-mouth disease［J］.J Virol Methods，2007，143（1）：81-85.

［13］LU Zengjun，CAO Yimei，GUO Jianhong，et al.Development and validation of a 3ABC indirect ELISA for differentiation of foot-and-mouth disease virus infected from vaccinated animals［J］.VetMicrobiol，2007，125（1／2）：157-169.

［14］BAYRY J，TOUGH D F.Is RNA interference feasible for the control of foot-and-mouth disease outbreaks？［J］. Trends Immunol，2005，26（5）：238-241.

［15］CHENW，YANWeiyao，DU Qingyun，et al.RNA interference targeting VP1 inhibits foot-and-mouth disease virus replication in BHK-21 cells and sucklingmice［J］.JVirol，2004，78（13）：6900-6907.

［16］LUO Jihuai，DU Junzheng，GAO Shandian，et al.Lentviral-mediated RNAi to inhibit target gene expression of the porcine integrin alphav subunit，the FMDV receptor，and against FMDV infection in PK-15 cells［J］.Virol J，2011，8：428.

［17］CHENWeizao，LIU Mingqiu，JIAO Ye，et al.Adenovirus-mediated RNA interference against foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in vivo［J］.JVirol，2006，80（7）：3559-3566.

［18］ WANG Pengyan，REN Yan，GUO Zhiru，et al.Inhibition of foot-and-mouth disease virus replication in vitro and in vivo by small interfering RNA［J］.Virol J，2008，5：86.

【責(zé)任編輯柴 焰】

Construction of lentivirus-mediated multi-shRNAs vector and evaluation of anti-FMDV in vitro and vivo

ZHANG Xiaoxi1，LILanyu1，LIU Qingyou1，ZHENG Haixue2，LIXiangping1，CUIKuiqing1，SHIDeshun1
（1 College of Animal Sciences and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China；2 Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046，China）

【Objective】The study was conducted to investigate the inhibit replication of foot-and-mouth disease virus（FMDV）bymulti-shRNAs expression.【Method】Three shRNAswere designed and chemically synthesized according to the conservative area in 3B and 3D regions of FMDV；induced by three different promoters respectively，they were constructed into a multi-shRNAs expressing lentiviral plasmid. The anti-FMDV multi-shRNAs expressing lentiviral particles were packaged by co-transfecting the three plasmid lentivirus packaging system into 293T cells.Infected FMDV into lentivirus-treated cells and sucklingmice，inhibitions of FMDV were observed.【Result and conclusion】Results showed that transgenic BHK-21 cells were obtained by infecting lentivirus.The expression of shRNAs in transgenic cells was detected by stem-loop RT-PCR.Inoculated with FMDV type O，the transgenic cells were proven to have an obvious inhibition to FMDV replication，which could reduce virus growth by three folds（24 h post-infection）.After infection of FMDV type O strain into 3-5 days sucklingmice，nomousemortalitywas observed under 5 LD50titer，and survival time of the dead mice extended compared with negative control under 20 LD50titer.Based on the above results，it can be concluded that the anti-FMDV multishRNAs expressing lentiviral vector can improve FMDV resistance of BHK-21 cells and sucklingmice.

foot-and-mouth disease virus；multi-shRNAs；lentiviral vector；anti-virus

S813.3

A

1001-411X（2014）04-0001-06

2013-02-21優(yōu)先出版時(shí)間：2014-06-03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net／kcms／doi／10.7671／j.issn.1001-411X.2014.04.001.html

張曉溪（1985—），男，博士，E-mail:xiaoxizhang527＠gmail.com；通信作者:劉慶友（1976—），男，研究員，博士，E-mail:qyliu2002＠126.com；石德順（1962—），男，研究員，博士，E-mail:ardsshi＠gxu.edu.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目（2011AA100607）；國家自然科學(xué)基金（31260552）

張曉溪，李蘭玉，劉慶友，等.慢病毒介導(dǎo)多短發(fā)卡RNA串聯(lián)載體構(gòu)建與體內(nèi)外抗口蹄疫效果評估［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（4）：1-6.