胡淦海，李德東，趙蘭雪，王 彥，姜遠(yuǎn)英 (1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，福建 福州 350108;. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 00433)

長(zhǎng)期以來(lái)，醫(yī)藥領(lǐng)域的科研人員大多應(yīng)用哺乳動(dòng)物研究病原微生物的致病機(jī)制，然而哺乳動(dòng)物(如小鼠)作為宿主涉及到倫理學(xué)問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)且成本高，無(wú)法滿足大規(guī)模高通量、低成本的篩選要求。無(wú)脊椎動(dòng)物模型為病原微生物致病機(jī)制研究和抗感染藥物研發(fā)提供了新方案。目前比較成熟的無(wú)脊椎動(dòng)物模型包括秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans，簡(jiǎn)稱(chēng)線蟲(chóng))[1]、黒腹果蠅(Drosophilamelanogaster)[2]、斑馬魚(yú)(zebra fish)[3]等。線蟲(chóng)模型用于高通量篩選方面有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，本文重點(diǎn)對(duì)線蟲(chóng)在抗病原微生物方面的研究進(jìn)行綜述。

1 線蟲(chóng)的生理學(xué)特點(diǎn)

20世紀(jì)60—70年代，Brenner[4]率先將線蟲(chóng)作為模式生物用于科學(xué)研究。線蟲(chóng)成蟲(chóng)長(zhǎng)約1 mm，直徑約50 μm，分為雌雄同體和雄性個(gè)體。每條雌雄同體的成熟期線蟲(chóng)由959個(gè)細(xì)胞組成，其中包括302個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，213個(gè)皮下細(xì)胞和34個(gè)腸道細(xì)胞。一條雌雄同體的野生型線蟲(chóng)可生育大約300個(gè)后代，若與雄蟲(chóng)交配則后代更多，可多達(dá)上千個(gè)。線蟲(chóng)的平均壽命為2～3周，3～5 d繁殖一代[5]。幼蟲(chóng)在經(jīng)歷L1，L2，L3，L4這4個(gè)階段后長(zhǎng)成成蟲(chóng)。每個(gè)階段都需經(jīng)歷蛻皮[6]，當(dāng)食物供給不足時(shí)，幼蟲(chóng)會(huì)進(jìn)入一種叫作"dauer"的狀態(tài)，這種狀態(tài)下的幼蟲(chóng)可在干燥及缺乏食物等極端惡劣條件下長(zhǎng)時(shí)間存活，環(huán)境改善后(如食物供給恢復(fù))，它們經(jīng)蛻皮可恢復(fù)為正常的成蟲(chóng)[6，7]。

2 線蟲(chóng)在病原菌致病機(jī)制研究中的應(yīng)用

近年來(lái)，線蟲(chóng)在病原菌研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，目前已證實(shí)有大約35種人類(lèi)致病菌(包括G+菌，G-菌和真菌)會(huì)對(duì)線蟲(chóng)造成感染[8]，其致病機(jī)制和致病因子與其在哺乳動(dòng)物中的表現(xiàn)有極大的相似之處。

2.1線蟲(chóng)在細(xì)菌致病機(jī)制研究中的應(yīng)用

2.1.1金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 是一種常見(jiàn)的G+菌，易造成機(jī)體局部感染，嚴(yán)重者可危及生命[9]。Garsin等發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌可在線蟲(chóng)(N2 strain)腸道內(nèi)形成菌落破壞宿主腸道上皮細(xì)胞，進(jìn)而破壞組織器官，導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡[10-12]?？茖W(xué)家們已經(jīng)開(kāi)始用線蟲(chóng)研究金黃色葡萄球菌的關(guān)鍵致病因子。agr和sarA是金黃色葡萄球菌感染哺乳動(dòng)物的重要毒力因子，其缺失菌對(duì)線蟲(chóng)的致病力顯著降低，與在哺乳動(dòng)物模型中的表現(xiàn)相似[12]。

2.1.2糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) 是一種存在于人體消化道內(nèi)的條件致病菌，可引起多種疾病，包括感染性心內(nèi)膜炎[13]。Garsin等建立了線蟲(chóng)(N2 strain)的糞腸球菌持久感染模型[10]。極少量的糞腸球菌即可造成線蟲(chóng)腸道感染，并導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道腫脹，在4 d左右的時(shí)間里約50%的線蟲(chóng)死亡[10]。溶菌素cyl是該菌感染線蟲(chóng)的重要毒力因子[10]。此外，糞腸球菌群體感應(yīng)應(yīng)答調(diào)節(jié)因子fsr/gelE-sprE也是導(dǎo)致線蟲(chóng)感染的重要因素，fsr缺失菌在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)線蟲(chóng)的致病力大大降低[10，14，15]。糞腸球菌的感染還可導(dǎo)致線蟲(chóng)體內(nèi)活性氧增加。有研究顯示，線蟲(chóng)在被感染糞腸球菌的部位有脂褐質(zhì)累積，而脂褐質(zhì)是由氧化損傷產(chǎn)生的天然色素[16，17]。

2.1.3綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa) 是一種人類(lèi)生活環(huán)境中普遍存在的G-菌。Mahajan-Miklos等發(fā)現(xiàn)該菌導(dǎo)致線蟲(chóng)發(fā)病的機(jī)制與環(huán)境因素有關(guān)[18，19]。在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，綠膿桿菌PA14菌株是通過(guò)釋放一種酚嗪類(lèi)化合物在數(shù)小時(shí)之內(nèi)殺死線蟲(chóng)(N2 strain)，被稱(chēng)為“快速致死”[18]。 在營(yíng)養(yǎng)匱乏的培養(yǎng)基中，綠膿桿菌PA14可導(dǎo)致線蟲(chóng)一種類(lèi)似哺乳動(dòng)物腸道感染的病理狀態(tài)，在數(shù)天后殺死線蟲(chóng)，稱(chēng)為“緩慢致死”。“緩慢致死”主要依賴(lài)于綠膿桿菌在腸道中的累積，當(dāng)感染的細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定閾值時(shí)導(dǎo)致永久性感染，如果感染達(dá)不到一定的細(xì)菌數(shù)量，線蟲(chóng)可以恢復(fù)健康狀態(tài)[11]。

2.2線蟲(chóng)在真菌致病機(jī)制研究中的應(yīng)用

2.2.1白念珠菌(Candidaalbicans) 是一種普遍存在于人體內(nèi)的條件致病真菌，當(dāng)機(jī)體免疫力明顯下降時(shí)可導(dǎo)致全身感染，嚴(yán)重感染時(shí)危及生命[20]。白念珠菌可對(duì)線蟲(chóng)(glp-4;sek-1 strain)造成持續(xù)的、致死性的感染[21]?！敖湍笐B(tài)-菌絲態(tài)相互轉(zhuǎn)換”是影響白念珠菌對(duì)哺乳動(dòng)物致病的關(guān)鍵因素[22]。酵母態(tài)和菌絲態(tài)的白念珠菌對(duì)線蟲(chóng)(glp-4;sek-1 strain)均有致病力[23,24]。Pukkila-Worley等發(fā)現(xiàn)白念珠菌的菌絲態(tài)生長(zhǎng)可導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡[24,25]。Gantner等發(fā)現(xiàn)，把被感染的白念珠菌的線蟲(chóng)(N2 strain和fer-15，fem-1 strain)繼續(xù)放在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而不是轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)液中，白念珠菌以酵母態(tài)存在于線蟲(chóng)的腸道，造成腸道膨脹而使線蟲(chóng)死亡[26-28]。

線蟲(chóng)(glp-4，sek-1 strain)感染模型還可用于研究致病菌之間的相互作用，例如白念珠菌與眾多原核生物感染的相互作用[29]。線蟲(chóng)可在被白念珠菌感染4 h后，再被鮑曼不動(dòng)桿菌、綠膿桿菌[29]或鼠傷寒沙門(mén)菌[30]感染。在上述情況下，某些G-菌可抑制白念珠菌菌絲的形成，而菌絲形成能力的下降，這意味著白念珠菌致病力的降低[29,30]。由此可見(jiàn)，不同的致病菌同時(shí)感染線蟲(chóng)，病原菌之間存在相互作用和相互制約，而線蟲(chóng)模型為體內(nèi)研究致病菌的相互作用提供了研究平臺(tái)。

2.2.2新型隱球菌(Cryptococcusneoformans) 是一種普遍存在于環(huán)境中的具有莢膜的條件致病真菌，它一般呈酵母態(tài)，可致多種動(dòng)物感染真菌病，尤其在免疫力低下的人群易感[31,32]。將新型隱球菌留存在線蟲(chóng)(N2 strain)的腸道內(nèi)，可在感染2～7 d后導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡[31,32]，如果在短時(shí)間接觸新型隱球菌后就將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至正常線蟲(chóng)培養(yǎng)環(huán)境，新型隱球菌可從線蟲(chóng)腸道內(nèi)清除，避免發(fā)生感染。莢膜是體現(xiàn)新型隱球菌的關(guān)鍵因素，但有意思的是Mylonakis等發(fā)現(xiàn)，無(wú)莢膜的新型隱球菌對(duì)線蟲(chóng)同樣有致病力，而且在營(yíng)養(yǎng)豐富的BHI培養(yǎng)基中，即使熱滅活的新型隱球菌H99也可導(dǎo)致線蟲(chóng)的壽命縮短[31]。新型隱球菌導(dǎo)致線蟲(chóng)感染的機(jī)制目前尚不清楚，但其致病機(jī)制與對(duì)哺乳動(dòng)物的致病機(jī)制存在相通之處[31-33]。gps1或者pka1基因缺失的新型隱球菌在哺乳動(dòng)物模型上的致病力降低，而pkr1基因缺失的新型隱球菌在哺乳動(dòng)物模型上的致病力增強(qiáng)；在線蟲(chóng)感染模型中，各基因缺失菌的結(jié)果與在哺乳動(dòng)物模型上的結(jié)果一致[32]。

3 線蟲(chóng)在抗感染藥物篩選中的應(yīng)用

3.1線蟲(chóng)在抗細(xì)菌藥物篩選中的應(yīng)用 如上所述，由于多種人類(lèi)病原體可導(dǎo)致線蟲(chóng)感染[8-34]，因此可以利用線蟲(chóng)感染模型來(lái)篩選抗菌藥物。Moy等[35]建立了線蟲(chóng)(glp-4，sek-1 strain)-糞腸球菌感染模型，高通量篩選了6 000個(gè)人工合成的化合物以及1 136個(gè)天然產(chǎn)物單體化合物，發(fā)現(xiàn)16個(gè)合成化合物以及9個(gè)天然產(chǎn)物可顯著延長(zhǎng)被感染線蟲(chóng)的存活率。有意義的是，有些化合物在體內(nèi)比體外顯示出更好的活性，可以推測(cè)這些化合物可能作用于細(xì)菌的毒力因子或者可以改善宿主的免疫應(yīng)答。16個(gè)化合物中15個(gè)沒(méi)有毒性，僅有1個(gè)化合物能使線蟲(chóng)的生長(zhǎng)滯后[35]。Moy等[36]運(yùn)用改進(jìn)的篩選方法，對(duì)33 931種合成化合物以及3 283種天然產(chǎn)物單體化合物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)28種化合物及天然產(chǎn)物具有抗糞腸球菌活性，其中6個(gè)化合物雖然能延長(zhǎng)線蟲(chóng)的存活率，但在體外不具有抑制糞腸球菌的活性，這些藥物的作用機(jī)制可能與目前的抗生素不同，它們更可能是以一種免疫調(diào)節(jié)劑或者是毒力因子的抑制劑而發(fā)揮作用的[36]。

綠膿桿菌的耐藥性問(wèn)題日益引起研究人員的關(guān)注。Zhou等[37]建立了線蟲(chóng)(glp-4，sek-1 strain)-綠膿桿菌感染模型，高通量篩選了1 300種提取物，發(fā)現(xiàn)36個(gè)提取物能夠延長(zhǎng)感染綠膿桿菌線蟲(chóng)的壽命，其中僅有4個(gè)在體內(nèi)、體外對(duì)耐藥綠膿桿菌均具有活性。運(yùn)用線蟲(chóng)感染模型來(lái)篩選抗菌藥物可發(fā)現(xiàn)很多在體外篩選中落選的候選藥物[37]。

3.2線蟲(chóng)在抗真菌藥物篩選中的應(yīng)用 常用的抗真菌藥物對(duì)白念珠菌感染的線蟲(chóng)有顯著的保護(hù)作用[21]，可以利用線蟲(chóng)(glp-4，sek-1 strain)-白念珠菌感染模型來(lái)高通量地篩選具有抗真菌活性的化合物[21-38]。Breger等[21]篩選了1 266種化合物，其中15個(gè)化合物對(duì)白念珠菌感染線蟲(chóng)有保護(hù)作用，線蟲(chóng)的存活率顯著提高，白念珠菌在線蟲(chóng)體內(nèi)的菌絲形成能力被明顯抑制。Okoli等[38]對(duì)線蟲(chóng)(glp-4，sek-1 strain)-白念珠菌感染篩選模式進(jìn)行了改進(jìn)，篩選了3 228個(gè)化合物，其中有1 948個(gè)為FDA批準(zhǔn)的藥物，其余的1 280個(gè)為小分子化合物，研究發(fā)現(xiàn)其中19個(gè)化合物對(duì)白念珠菌感染線蟲(chóng)有保護(hù)作用，可顯著提高線蟲(chóng)的存活率。

Coleman等[39]運(yùn)用線蟲(chóng)(glp-4，sek-1 strain)-白念珠菌感染模型觀察了2 560種天然皂苷類(lèi)化合物的抗真菌活性，12種皂苷被證實(shí)具有抗真菌活性。研究者對(duì)其中2個(gè)皂苷A16和A19進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)皂苷A16和A19可以抑制白念珠菌菌絲和生物被膜的形成。溶血實(shí)驗(yàn)顯示，A16和A19皂苷沒(méi)有溶血毒性，因此有進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值[39]。

4 結(jié)語(yǔ)

線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)成本低、周期短，不受倫理學(xué)制約，不需要哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所必需的、煩瑣的審批過(guò)程。在篩選具有抗感染活性的化合物研究中，線蟲(chóng)模型綜合考慮了宿主、病原微生物和藥物三者之間的相互作用，與體外模型相比更有助于發(fā)現(xiàn)高效、低毒的候選新藥。當(dāng)前，利用線蟲(chóng)模型篩選抗感染新藥已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化、高通量[21]，其篩選效率與體外高通量篩選接近。線蟲(chóng)模型在抗感染研究領(lǐng)域必將有廣泛的應(yīng)用前景。

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