李奕婧，李 冰，程春雷，王 杰（校對(duì)）

（1.濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濱州256618；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

高效液相色譜柱及其再平衡（譯文）

李奕婧1，李 冰2，程春雷2，王 杰2（校對(duì)）

（1.濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濱州256618；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

韋伯斯特新大學(xué)詞典對(duì)“迷信”的定義是“人們，尤其是對(duì)該方面感興趣的團(tuán)體，不加鑒別地奉行一種錯(cuò)誤的觀點(diǎn)”。色譜法中是否存在這些迷信呢？Ron Majors列出高效液相色譜（HPLC）中的迷信并提供一些證據(jù)以證明它們是錯(cuò)誤的。

觀點(diǎn)一：至少需要使用10倍柱容體積的流動(dòng)相才能使色譜柱重新達(dá)到平衡狀態(tài)。

作為液相色譜法工作效率的一個(gè)限制因子，平衡時(shí)間在梯度色譜技術(shù)中十分關(guān)鍵。梯度結(jié)束后，下一針進(jìn)樣前，色譜柱必須返回至起始狀態(tài)。平衡色譜柱所用的時(shí)間越長，整個(gè)梯度運(yùn)行的時(shí)間越長；此外，如果用比實(shí)際需要更長的時(shí)間，還會(huì)導(dǎo)致溶劑的浪費(fèi)?，F(xiàn)代的二維液相色譜法中，第一維色譜柱的流速在第二維色譜分析時(shí)并不為零，因此，二維液相色譜的流量是由次級(jí)色譜柱的流速?zèng)Q定的。一方面，如果平衡色譜柱只需要幾倍柱體積的流動(dòng)相，卻使用10倍甚至以上，將使本來已經(jīng)十分緩慢的色譜分析過程變得更慢；另一方面，如果再平衡時(shí)間過短，色譜柱未企穩(wěn)，保留時(shí)間（鑒別組分的重要指標(biāo)）的重復(fù)性就可能會(huì)受到影響。

目前已有許多關(guān)于再平衡時(shí)間的研究，本文從以下幾點(diǎn)總結(jié)再平衡研究的主要成果。第一，平衡分為兩個(gè)類型：可重復(fù)平衡和完全平衡?？芍貜?fù)平衡意味著可能沒有實(shí)現(xiàn)完全平衡，但在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于使用了非緩沖洗脫液的非離子化溶質(zhì)和使用了常見的三氟乙酸或甲酸添加劑的堿性化合物而言，如果其后續(xù)運(yùn)行保留時(shí)間的重復(fù)性小于0.002分鐘，可重復(fù)平衡就可以在兩個(gè)柱體積內(nèi)實(shí)現(xiàn)。倘若要使未封端的固定相在兩個(gè)柱體積內(nèi)快速達(dá)到完全平衡，需要在流動(dòng)相中加入1%（V／V）的正丁醇；而封端的固定相，則不需要加入正丁醇。

Schellinger，Stoll和Carr［1，2］針對(duì)保留時(shí)間的重復(fù)性和色譜柱的再平衡，研究了反相液相色譜法中堿性化合物和中性化合物在具有緩沖能力的洗脫液中的快速梯度洗脫，并對(duì)完全平衡條件進(jìn)行了后續(xù)研究。在反相液相色譜法中，有很多變量影響色譜柱的再平衡。等度液相色譜法中，色譜運(yùn)行結(jié)束時(shí)不存在平衡時(shí)間的問題，但改變?nèi)軇┙M成后，可能需要相當(dāng)長的時(shí)間平衡色譜柱。梯度液相色譜法中，洗脫劑的組成、反相液相色譜柱填料的鍵合密度、儀器的設(shè)計(jì)（特別是梯度延遲體積或滯后體積）、流速、是否使用鍵合相添加劑以潤濕鍵合相、溶質(zhì)的類型（離子、離子化或中性）和沖洗時(shí)間，這些都對(duì)色譜柱的再平衡產(chǎn)生影響。

第二，延遲體積是溶劑混合點(diǎn)到柱頭的總體積，儀器梯度延遲體積在實(shí)際分析中有重要意義。對(duì)于高壓混合HPLC而言，混合三通、混合器（如果存在的話）、脈沖阻尼器、壓力傳感器，所有的連接管道及進(jìn)樣裝置（包括進(jìn)樣環(huán)或旁路體積）和保護(hù)柱，延遲體積相當(dāng)可觀。對(duì)于低壓梯度系統(tǒng)，比例閥、進(jìn)口和出口止回閥、泵活塞室以及各種管道，增加了更多的梯度延遲。在實(shí)際梯度到達(dá)色譜柱前，有許多溶劑沖洗出來，但由于延遲量本身與色譜柱的再平衡時(shí)間沒有關(guān)系，因此，這部分溶劑的體積必須從色譜柱洗脫液的總體積中減去。最近，新的UHPLC通過大幅度降低梯度延遲體積及柱外體積，解決了這些問題。

觀點(diǎn)二：所有的C18（L1）柱都是相同的。

對(duì)于HPLC色譜柱的調(diào)查結(jié)果顯示，到目前為止，C18（十八烷基硅烷鍵合硅膠）是目前最受歡迎的色譜柱填料［3］。由于高效液相色譜最早的使用者是制藥企業(yè)，而美國藥典委員會(huì)不想支持任何特定的高效液相色譜柱制造商，因此開發(fā)了一個(gè)可以描述新藥申請(qǐng)?zhí)峤粫r(shí)包含各種類型鍵合柱填料的通用的分類系統(tǒng)。該系統(tǒng)將高效液相色譜柱填料命名為“L”；因?yàn)榇蠖鄶?shù)送審記錄中使用的是C18，因此將C18命名為“L1”。隨著其他鍵合柱填料的問世，系統(tǒng)為它們分配了各自的“L”編號(hào)，如C8（L7），CN（L10），苯基（L11）等等。系統(tǒng)將每一個(gè)送審記錄中提交的C18柱都命名為L1。然而，色譜柱來自不同的制造商，由不同的二氧化硅和不同的硅烷化試劑經(jīng)不同的合成路線生產(chǎn)，具有不同的色譜行為，因此彼此之間不能相互替代。隨著超過800種不同的L1柱流通入市場，人們發(fā)現(xiàn)該分類系統(tǒng)存在不足。雖然已有許多關(guān)于色譜柱的分類方法，如疏水減法模式中對(duì)反相柱進(jìn)行的更詳細(xì)的分類，但就目前而言，“L”分類法仍在廣泛使用，因此，一些并不真正了解情況的液相 使用者仍然相信“所有C18柱都是相同的”。然而，我們的觀點(diǎn)是：并非所有C18柱（L1）或其他反相柱都是相同的。

［1］Schellinger AP，Stoll DR，Carr PW.High－speed gradient elution reversed－phase liquid chromatography of bases in buffered eluents.Part I.Retention repeatability and column re－equilibration［J］.J Chromatogr A，2008，1192（1）：41－53.

［2］Schellinger AP，Stoll DR，Carr PW.High speed gradientelution reversed phase liquid chromatography of bases in buffered eluents.Part II.Full equilibrium［J］.JChromatogr A，2008，1192（1）：54－61.

［3］Majors RE.Advanced Topics in Solid－Phase Extraction：Chemistries［J］.LCGCNorth Am，2007，25（1）：31－39.

R927.1

A

2095－5375（2014）12－0726－002

選自：Majors RE.The Top10 HPLC and uHPLC Column Myths［J］.LCGC Asia Pacific，2013，16（4）：26－30.

李奕婧，女，研究方向：藥品檢驗(yàn)，E－mail：liyijing2013＠163.com

程春雷，男，博士研究生，研究方向：藥理學(xué)，Tel：0531－81216511，E－mail：chengchunl2011＠126.com