李 瑛 段林瑞 袁佳妮 曹 蔚 王四旺 涂宏海

第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室(西安710032)

蟾毒靈(bufalin)是中藥蟾酥的主要有效成分，屬于蟾毒甾烯類化合物，分子式為C24H34O4，相對(duì)分子量386，其疏水性較強(qiáng)，對(duì)多種類型腫瘤均具有強(qiáng)的抑制作用，有很廣泛的應(yīng)用前景［1-5］。研究表明，蟾毒靈通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化及自噬，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性，抑制腫瘤血管形成及對(duì)腫瘤細(xì)胞放射增敏作用等途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)［6，7］。

本實(shí)驗(yàn)旨在采用一種簡(jiǎn)便高效液相法，考察蟾毒靈單體成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，估算其靜脈注射的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為蟾毒靈的安全用藥提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法 1．1 儀器 日本島津(SHIMADZU)LC-2010A HT型高效液相色譜儀(四元梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，紫外檢測(cè)器);Sartorius ME235S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司);Millipore超純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司);KQ-300E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HSC-24A型氮?dú)獯蹈蓛x(天津恒奧科技有限公司);TD25-WS型高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵(天津華鑫儀器有限公司);渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);電子恒溫水浴鍋(北京化玻醫(yī)療器械有限公司)。

1．2 藥品及試劑 色譜甲醇，乙腈(Burdick＆Jackson美國(guó)Honeywell公司);磷酸(天津富宇精細(xì)化工有限公司);磷酸二氫鉀(西安化學(xué)試劑廠);DMSO(西安沃爾森生物技術(shù)有限公司);羧甲基纖維素鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);肝素鈉(上?；瘜W(xué)試劑廠);乙醚(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠);乙酸乙酯、石油醚(天津市紅巖化學(xué)試劑廠)。

蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98．0%，陜西寶雞辰光生物科技有限責(zé)任公司);華蟾酥毒基標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98．0%，陜西寶雞辰光生物科技有限責(zé)任公司)。

1．3 動(dòng)物 SD大鼠20只，雄性，體重在280 g左右，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2．1 色譜條件 色譜柱:大連依利特SinoChrom ODS-BP色譜柱(4．6 mm ×250 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈∶0．5%磷酸二氫鉀(50∶50)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3．2);流速:1．0 mL/min;柱溫:40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):296 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2．2 藥液的制備與劑量 精密稱取蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，以50μLDMSO助溶，0．5%的羧甲基纖維素鈉稀釋至10 mL，稀釋過(guò)程中不斷超聲振蕩，防止藥物的沉淀，最終制備成均勻的混懸液。按照蟾毒靈10 mg/kg的劑量，采用灌胃方式給藥。

精密稱取華蟾酥毒基標(biāo)準(zhǔn)品2．5 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲使之充分溶解，得到250μg/mL的華蟾酥毒基對(duì)照品溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2．3 血漿樣品的處理 精密吸取血漿200μL，置于10 mL離心管中，加入甲醇40μL，渦旋振蕩使其混勻，加入乙酸乙酯和石油醚混合萃取液(1:1)4 mL，用渦旋振蕩器充分振搖5 min，4000 r/min離心15 min，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊笥?00μL乙腈復(fù)溶，再以12000 r/min離心，取上清液20μL進(jìn)樣。

2．4 專屬性試驗(yàn) 取大鼠空白血漿，空白血漿+蟾毒靈、華蟾酥毒基標(biāo)準(zhǔn)品和給藥后血漿樣品，按照“2．3”項(xiàng)下所述方法萃取處理后分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。

2．5 血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品3 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，并用超聲振蕩使之充分溶解，得到300μg/mL的蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密量取蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，依次稀釋成濃度分別為150、75、37．5、18．75、9．375、4．688、2．344μg/mL 的系列對(duì)照品溶液，4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。分別精密吸取上述系列對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各20μL，加入至200μL空白血漿中，配置成相應(yīng)的系列濃度含藥血漿樣品溶液。按照“2．3”項(xiàng)下所述方法萃取處理后分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。用待測(cè)物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2．6 方法回收率實(shí)驗(yàn) 取200 μL大鼠空白血漿共18份，分為高、中、低濃度3組，每組平行制備樣品6份，加入蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品適量，配置成濃度分別為 7．5 μg/mL、1．875 μg/mL、0．469 μg/mL 的含藥血漿樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2．3”項(xiàng)下所述方法萃取處理后分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。

2．7 精密度試驗(yàn) 取200 μL大鼠空白血漿共6份，分為日內(nèi)、日間兩組，加入蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品適量，配置成濃度分別為7．5 μg/mL、1．875 μg/mL、0．469 μg/mL 的含藥血漿樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2．3”項(xiàng)下所述方法萃取處理，日內(nèi)組1d內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，日間組每天測(cè)定1次連續(xù)5d，記錄蟾毒靈與內(nèi)標(biāo)峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算其濃度。

2．8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取200 μL大鼠空白血漿共27份，分為室溫穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性3組，每組分別加入蟾毒靈標(biāo)準(zhǔn)品適量，配置成濃度分別為 7．5 μg/mL、1．875 μg/mL、0．469 μg/mL 的含藥血漿樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，每組中各濃度樣品平行制備3份。20℃室溫下放置樣品12 h，檢測(cè)其室溫穩(wěn)定性;-20℃冰箱中反復(fù)凍融樣品3次，檢測(cè)其反復(fù)凍融穩(wěn)定性;-80℃冰箱中冷凍放置樣品7d，評(píng)價(jià)其長(zhǎng)期穩(wěn)定性。所有樣品按照“2．3”項(xiàng)下所述方法萃取處理，進(jìn)樣后進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算藥物濃度。

2．9 大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 選取健康成年SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h以上，自由飲水。灌胃給藥后 2、5、15、30、45、60、90、120、240、360、600 min 時(shí)通過(guò)眼底靜脈叢取血 0．5 mL，置于事先用肝素鈉抗凝處理的1．5 mL離心管中，3500 r/min離心15 min，吸取上層血漿，按照“2．3”項(xiàng)下所述方法萃取處理，進(jìn)樣后進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算藥物濃度。

2．10 藥時(shí)曲線與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 運(yùn)用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì)編制的藥物與統(tǒng)計(jì)(DrugAnd Statistics)簡(jiǎn)稱DAS統(tǒng)計(jì)軟件(2．1．1版)對(duì)血藥濃度與時(shí)間進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)擬合計(jì)算，獲得蟾毒靈單體給藥藥時(shí)曲線與相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果 3．1 專屬性試驗(yàn) 三者色譜圖比較可知，本實(shí)驗(yàn)所采用色譜條件適宜，提取方法理想，血漿中不存在干擾蟾毒靈檢測(cè)的內(nèi)源性物質(zhì)，專屬性較強(qiáng)(圖1)。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)(A)空白血樣;(B)空白血中加入蟾毒靈和內(nèi)標(biāo);(C)蟾毒靈單體給藥后血樣;1 蟾毒靈;2 內(nèi)標(biāo)

3．2 血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 由試驗(yàn)可知，蟾毒靈的濃度和峰面積比之間有良好的線性關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0．03981x-0．003(r=0．9997)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖 2。蟾毒靈在0．2344～15．0 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，符合分析測(cè)試要求，同時(shí)以信噪比為3:1確定其最低檢測(cè)限(LOD)為0．06 μg/mL。

3．3 精密度實(shí)驗(yàn) 由測(cè)定結(jié)果可知(表1)，所有樣品的日內(nèi)RSD小于3%，日間RSD小于5%，精密度良好，符合生物樣品的質(zhì)量控制要求。

3．4 回收率實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如表2，所有樣品的回收率均在92．34% ～101．61%之間，符合生物樣品分析的質(zhì)量控制要求。

3．5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明(表3)，蟾毒靈在考察范圍內(nèi)穩(wěn)定，可在考察范圍內(nèi)對(duì)蟾毒靈進(jìn)行含量測(cè)定。

3．6 大鼠口服蟾毒靈單體的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 分析血藥濃度數(shù)據(jù)并結(jié)合藥時(shí)曲線可知(表4)，單體口服給藥后，蟾毒靈在大鼠體內(nèi)迅速吸收，給藥后2 min即可在血樣中檢測(cè)到，血藥濃度約在15～30 min達(dá)到最大值，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血漿中蟾毒靈含量逐漸減少，在360 min左右濃度降至最低且趨于穩(wěn)定，同一時(shí)間點(diǎn)各組數(shù)據(jù)之間存在著較大的差別，這可能與動(dòng)物的個(gè)體差異和蟾毒靈的較強(qiáng)毒性有關(guān)。

圖2 蟾毒靈血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 蟾毒靈在大鼠血漿內(nèi)的精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)

表2 蟾毒靈在大鼠血漿內(nèi)的回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表3 蟾毒靈大鼠血漿樣品穩(wěn)定性(n=3)

圖3 大鼠口服蟾毒靈單體的藥時(shí)曲線

表4 主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 討 論 藥物動(dòng)力學(xué)作為一門用數(shù)學(xué)分析手段處理的藥物體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程的科學(xué)，具有重大的理論價(jià)值和實(shí)用意義。蟾毒靈為蟾酥的主要成分，作用廣泛，已引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)的研究多局限于蟾酥提取物的復(fù)合成分研究［8-10］。本實(shí)驗(yàn)首次建立了測(cè)定大鼠血漿中蟾毒靈單體成分的的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及血藥濃度-時(shí)間曲線，方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為中蟾蜍甾烯類成分體內(nèi)測(cè)定方法的建立、其他給藥途徑藥動(dòng)學(xué)以及相對(duì)生物利用度等方面的研究提供參考。

［1］ 宋長(zhǎng)城，呂 祥．蟾毒靈抗腫瘤作用及其分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010 2010-11-22;18(9):1863-1866．

［2］ Yin P，Wang Y，Qiu Y，Hou L，Liu X，Qin J，et al．Bufalin-loaded mPEG-PLGA-PLL-cRGD nanoparticles:preparation，cellular uptake，tissue distribution，and anticancer activity［J］．Int J Nanomedicine 2012 2012-01-20;7:3961-3969．

［3］ Xie CM，Chan WY，Yu S，Zhao J，Cheng CH．Bufalin induces autophagy-mediated cell death in human colon cancer cells through reactive oxygen species generation and JNK activation［J］．Free Radic Biol Med 2011 2011-10-01;51(7):1365-1375．

［4］ 韓健勇，董明慧，王 玨，等．蟾毒靈抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］．河南中醫(yī)，2009 2009-08-17;29(7):724-726．

［5］ 曹 蔚，李 瑛，段林瑞，等．蟾皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．陜西中醫(yī)，2012，33(11):1539-1541．

［6］ 李 瑛，曹 蔚，王四旺，等．安替可膠囊物效基礎(chǔ)研究進(jìn)展［J］．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥2012，(02)．

［7］ Qi F，Li A，Inagaki Y，Kokudo N，Tamura S，Nakata M，et al．Antitumor activity of extracts and compounds from the skin of the toad Bufo bufo gargarizans Cantor［J］．Int Immunopharmacol 2011 2011-03-01;11(3):342-349．