張惜燕 田丙坤 陳傳貞 邢玉瑞 喬文彪 李翠娟 李 濤 孫耀光陜西中醫(yī)學(xué)院(西安712046)

1 研究背景 成骨細胞在體內(nèi)合成分泌膠原、糖蛋白等類骨質(zhì)成分，參與類骨質(zhì)的鈣化，是體內(nèi)參與骨形成過程的主要功能細胞，是開展體外成骨細胞實驗的主要細胞來源［1］。近年來，越來越多的學(xué)者通過體外分離培養(yǎng)成骨細胞開展實驗研究，取得了很大的成績［2］。但是因為骨組織特殊的生理結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)成骨細胞難度大，在實際培養(yǎng)中常表現(xiàn)出細胞數(shù)量少、純度差及細胞功能缺失等問題。本實驗旨在尋求科學(xué)的大鼠成骨細胞原代培養(yǎng)方法，為研究成骨細胞的功能及其在骨形成中的作用提供最佳的體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

常用的成骨細胞體外培養(yǎng)方法有兩種。組織塊培養(yǎng)法是將骨組織剪成適當(dāng)大小的組織塊，培養(yǎng)骨組織，利用成骨細胞在體外可移行出骨組織的特點，收集爬行出的成骨細胞進行研究的方法。此法的特點是無需酶消化處理、對細胞損傷小，但細胞產(chǎn)出率低、培養(yǎng)周期長［3］。另一種方法是酶消化法。原始的酶消化法中胰蛋白酶消化時間難以掌握，容易損傷細胞及胞膜上的功能蛋白，影響細胞存活及功能［4］。因而本研究選擇改良的胰蛋白酶和I型膠原酶聯(lián)合的酶消化法來獲取大鼠成骨細胞。骨組織細胞外基質(zhì)(ECM)的有機成分中90%由I型膠原構(gòu)成，膠原酶的作用相對溫和，對細胞損傷較?。?］，實驗中對兩種酶的消化溫度及消化時間進行嚴(yán)格控制，所得細胞沉淀均經(jīng)PBS沖洗后種瓶，極大地避免了酶消化法對細胞膜表面受體和抗原成分的損害。

2 材料與方法 2．1 實驗材料 ① 動物:SPF級48h新生SD大鼠6只，雌雄各半。購自西安交大醫(yī)學(xué)動物實驗中心。實驗動物質(zhì)量合格證編號:0014342。②試劑:0．25%胰蛋白酶(solarbio北京索萊寶科技有限公司)，Ⅰ型膠原酶(sigma上海根生生物科技有限公司)，胎牛血清(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(solarbio北京索萊寶科技有限公司)，PBS緩沖液，75%酒精。③ 主要實驗儀器:CO2培養(yǎng)箱(德國賓德binder)，醫(yī)用低溫冰箱(MDF-330，日本)，全自動高壓滅菌器(日本三洋MLS-3788)，高速低溫離心機(美國thermo)，電熱恒溫震蕩水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司DKZ系列)，超凈工作臺(泰斯特CJ-2D)，倒置生物顯微鏡(Olimpubs)。

2．2 成骨細胞的分離 出生48h內(nèi)的SD大鼠乳鼠6只，酒精浸泡缺氧處死，超凈工作臺中無菌操作取顱骨，仔細剔除表面附著軟組織，PBS沖洗3次至骨片透明發(fā)白，無菌培養(yǎng)皿中加入0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)2mL，將顱骨骨片于胰酶中剪碎，大小約1mm×1mm×1mL，全部移入離心管，37℃水浴震蕩消化15min，加相同體積含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。1000r/min離心10min，棄上清。向沉淀中加入0．1%I型膠原酶3mL，37℃水浴消化60min(每20min震蕩1次)，200目濾網(wǎng)濾過，濾過液1000r/min離心10min，棄上清，PBS清洗沉淀，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀中加入10%含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基4mL，吹打混勻，接種于25mL培養(yǎng)瓶，37℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。濾網(wǎng)濾過的骨碎片經(jīng)過0．1%I型膠原酶重復(fù)消化3～4次，每次消化所得細胞如上步驟接種于培養(yǎng)瓶。30min后將培養(yǎng)液吸出換瓶培養(yǎng)。第一次48h后換液，之后每2～3d換液1次。7～10d可融合傳代。

2．3 成骨細胞的傳代及純化 酶消化法取得的成骨細胞中最易混雜成纖維細胞及少量血細胞。血細胞屬于懸浮細胞，成纖維細胞比成骨細胞容易貼壁，貼壁后也更容易消化下來，故利用差速貼壁法進行成骨細胞的純化。消化傳代時，吸棄原培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)1mL，顯微鏡下觀察，消化至少量細胞脫落，其他細胞輪廓變圓時，吸棄消化液連同先消化掉的混雜細胞。繼續(xù)加入0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)1mL，輕輕震蕩培養(yǎng)瓶，大部分細胞脫壁時，含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心收集細胞，傳代。傳至新培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)30 min后少量細胞貼壁，將培養(yǎng)液吸出換瓶培養(yǎng)，以盡量去掉先貼壁的混雜細胞。如此傳代3次，成骨細胞會得到較好純化。

2．4 常用的成骨細胞鑒定及原理 倒置相差顯微鏡下觀察:成骨細胞接種24h后大部分均貼壁生長，呈三角形、梭形、多角形等不規(guī)則形，形態(tài)多樣、排列緊密。48h后細胞形態(tài)膨大，伸展出長短不一的突起，胞核清晰可見。4～8d時，細胞分離相多見，細胞突起相互連接，匯合時細胞呈鋪路石狀，并可見重疊生長。見圖1。

茜素紅染色(鈣結(jié)節(jié)染色):體外礦化是成骨細胞具有的主要特征，礦化結(jié)節(jié)(鈣結(jié)節(jié))是成骨細胞骨形成功能的形態(tài)表現(xiàn)，通常用茜素紅法、Von Kossa’s法及四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記法染色顯示成骨細胞礦化結(jié)節(jié)［6］。茜素紅染色:將純化后的2代細胞接種到六孔板中，每孔接種2mL，以后每2d換液。待細胞分布均勻、約80%融合時，PBS洗3次，95%乙醇固定30min，蒸餾水沖洗3 次，0．1%茜素紅 (pH8．3)染色，37℃孵育30min，蒸餾水沖洗。低倍鏡視野(×40)下觀察:細胞融合，局部呈多層重疊生長，堆集成灶狀，形成的鈣結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色呈橘紅色。通過鈣結(jié)節(jié)計數(shù)，可反映成骨細胞的礦化功能。見圖2。

成骨細胞體外生長大致經(jīng)過快速增殖、細胞外基質(zhì)形成、基質(zhì)礦化和凋亡4個階段。有研究顯示:成骨細胞生長曲線1～3 d為延滯期，4～8 d進入對數(shù)生長期，第8d以后進入平臺期［7］。本研究證實體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞約4日時完全貼壁，7～8d進入快速增殖期，細胞生長至單層融合狀態(tài)，分裂速度開始減慢，可以傳代。如繼續(xù)培養(yǎng)(＞20d)，細胞呈多層重疊生長，骨基質(zhì)成分如I型膠原等分泌活躍，最終基質(zhì)礦化形成鈣化結(jié)節(jié)。如繼續(xù)生長，細胞逐漸失去極性，形態(tài)不易辨認。連續(xù)培養(yǎng)五代，可見細胞胞體增大，質(zhì)稀薄，核縮小，分裂相少見等退行性改變。

3 討 論 3．1 成骨細胞來源 據(jù)文獻報道，成骨細胞來源有:①骨來源:胚胎動物或新生動物(小鼠、大鼠、兔、雞)的顱骨、人胚胎顱骨及松質(zhì)骨最常用來培養(yǎng)成骨細胞［8］。②骨膜來源:骨膜是膜性成骨細胞的來源，直接從骨膜中分離，或者將骨膜細胞接種于羥基磷灰石支架上進行培養(yǎng)，均可得到成骨細胞［9］。③骨髓間充質(zhì)干細胞:骨髓間充質(zhì)干細胞具有強的增殖能力和多分化潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下有向成骨細胞分化的潛能［9］。國內(nèi)外文獻報道新生動物的顱骨或胚胎顱骨為成骨細胞的常用來源。本實驗用48h內(nèi)新生SD大鼠乳鼠的顱骨分離成骨細胞，結(jié)果表明所培養(yǎng)的成骨細胞具有典型的成骨細胞形態(tài)特征、生物學(xué)活性及鈣化功能。

3．2 胰蛋白酶消化時間 胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或細胞對胰酶作用的反應(yīng)不一樣，故消化時間及程度難以掌握。胰酶分散細胞的活性主要與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在37℃、pH為8．0時，胰酶的作用能力最強。本實驗證實，選用0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)，顱骨骨片在胰酶中剪碎時室溫下作用5min，然后于37℃水浴鍋中震蕩消化15min。共作用20min后用一倍體積的含胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，可以很好地將纖維組織、成纖維細胞、血細胞等消化下來。

3．3 I型膠原酶 膠原酶被廣泛用于各種細胞的分離培養(yǎng)，因為在生理酸堿度和溫度條件下，膠原酶能特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，但一般不會損傷其他蛋白質(zhì)和組織。對于消化時間的控制，有研究證實骨組織中各種細胞耐受消化酶能力依次為:成纖維細胞＜破骨細胞＜骨祖細胞＜成骨細胞［10］。Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶均適用于成骨細胞的原代消化，但在消化1h×2次條件下用Ⅰ型膠原酶比II型膠原酶容易獲得更多的成骨細胞［11］。在成骨細胞培養(yǎng)中，Ⅰ型膠原酶的消化作用強于Ⅱ型膠原酶，其原因可能與成骨細胞多分泌富含Ⅰ型膠原的基質(zhì)有關(guān)［11］。本實驗選用0．1%I型膠原酶37℃水浴消化60min，重復(fù)3～4次獲得的成骨細胞純度高，活性強。

3．4 培養(yǎng)基及血清濃度的選擇 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加胎牛血清構(gòu)成完全培養(yǎng)基。文獻中成骨細胞的體外培養(yǎng)最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基和DMEM低糖培養(yǎng)基三種，加入胎牛血清的百分數(shù)也有10%、15%、20%等不同。資料顯示，DMEM可用于許多哺乳動物細胞培養(yǎng)，是一種應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基。F12適用于培養(yǎng)血清含量較低條件下哺乳動物細胞，是開發(fā)無血清配方的基礎(chǔ);高糖適用于培養(yǎng)高密度懸浮細胞;低糖適合培養(yǎng)依賴性貼壁細胞，特別適于培養(yǎng)附著性較差、生長速度快的細胞。血清的主要作用是保護培養(yǎng)中的細胞，它能提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)、提供結(jié)合蛋白、提供激素以及各種生長因子、提供促接觸和促伸展因子從而使細胞貼壁免受機械損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)血清濃度在10%以上對成骨細胞的生長無明顯影響，可能與骨細胞特殊的生理結(jié)構(gòu)及生長環(huán)境有關(guān)。實驗先采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，消化后細胞成活率低;后改用DMEM/F12培養(yǎng)基，出現(xiàn)換液后培養(yǎng)基渾濁。最后改用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基(加hepes和雙抗)，培養(yǎng)成骨細胞生長狀況良好，換液傳代均正常。

4 小 結(jié) 實驗參照有關(guān)文獻資料，對成骨細胞的體外分離及培養(yǎng)方法進行反復(fù)探究、調(diào)整和改良。胰蛋白酶和I型膠原酶聯(lián)合的酶消化法獲取的大鼠成骨細胞，經(jīng)鑒定具有體內(nèi)成骨細胞同樣的生物學(xué)特性，能很好地反映成骨細胞的功能活動特點，為深入研究骨的發(fā)生和生長機制、充分認識其與外環(huán)境間的相互作用提供了理論依據(jù)及進一步實驗的基礎(chǔ)。本方法思路清晰、可操作性強、簡單實用，培養(yǎng)的成骨細胞數(shù)量多、純度高、易存活，是一種較好的成骨細胞的體外分離培養(yǎng)方法。

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