金 青，王愛霞，李 冉，譚然然

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

GC法測(cè)定與右旋糖酐40聯(lián)合用藥時(shí)血漿中甘露醇的含量

金 青，王愛霞，李 冉，譚然然

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

目的采用氣相色譜法研究聯(lián)合用藥時(shí)血漿中甘露醇的含量及右旋糖酐40對(duì)甘露醇的含量的影響。方法血漿樣品經(jīng)沉淀蛋白、衍生化處理后，考察血漿中加入甘露醇、右旋糖酐40及兩者聯(lián)合用藥后溶質(zhì)峰的保留時(shí)間。結(jié)果血漿中右旋糖酐40對(duì)甘露醇的測(cè)定無影響。結(jié)論該方法可用于甘露醇和右旋糖酐40聯(lián)合用藥時(shí)血漿中甘露醇含量的測(cè)定。

氣相色譜法；右旋糖酐40；甘露醇

甘露醇是臨床常用的脫水劑和利尿劑，其注射液作為高滲降壓藥，是臨床搶救特別是腦部疾患搶救常用的一種藥［1］，具有降低顱內(nèi)壓藥物所要求的降壓快、療效準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是目前控制腦水腫的首選脫水劑。小分子及低分子右旋糖酐可提高血漿膠體滲透壓、擴(kuò)充血容量、降低血液黏滯度、并使凝血因子相應(yīng)稀釋［2］。在臨床上，甘露醇常與右旋糖酐40及丹參聯(lián)合應(yīng)用治療心腦血管疾病，如腦梗死［3］。其在治療組織損傷所導(dǎo)致的肢體腫脹方面，能有效地促進(jìn)損傷愈合。由于右旋糖酐40的主要作用是作為血漿代用品進(jìn)行血液擴(kuò)容稀釋，在體內(nèi)起主要作用的藥物是甘露醇，因此本實(shí)驗(yàn)建立了用GC法測(cè)定與右旋糖酐40聯(lián)合用藥時(shí)血漿中甘露醇的含量，并對(duì)右旋糖酐40是否對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響做了探討［4，5］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)條件

1.1.1 儀器與試劑 GC－920氣相色譜儀，上海海欣色譜儀器有限公司；FA1004N電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；小型離心機(jī)；可調(diào)微量移液器，上海宙輝生化儀器有限公司；RXZ－128智能型人工氣候箱，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司。

甘露醇（藥用，青島翔宇海藻有限公司）；右旋糖酐40（藥用，山東金陽藥業(yè)有限公司）；木糖醇（天津市博迪化工有限公司）；肝素（效價(jià)150 IU· mg－1，中國惠興生化試劑有限公司）；吡啶（天津市博迪化工有限公司）；乙酸酐（廣州齊昌化工有限公司）；磺基水楊酸（分析純，上海惠錦化工有限公司）。

1.1.2 色譜條件 SGE－AC－10毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.32 mm，0.25μm）；載氣為氮?dú)猓魉偌s20 mL·min－1），氫氣（流速約15 mL·min－1），空氣（流速約250 mL·min－1）；程序升溫為：起始溫度200℃保持1 min，以速率4℃·min－1升至240℃，保持20 min；進(jìn)樣量為1μL。

1.2 血漿中甘露醇含量測(cè)定的方法學(xué)建立

1.2.1 對(duì)照品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取甘露醇對(duì)照品與木糖醇各0.500 0 g于50mL量瓶中，加蒸餾水溶解，稀釋至刻度，配制成濃度為10 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品試樣制備 取家兔血漿1 mL，立即置于涂有肝素的尖底塑料離心管中，振蕩使混合均勻。于3 500 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，用可調(diào)微量移液器吸取上層清液，即為血漿。取0.1 mL添加了適量甘露醇對(duì)照品溶液的血漿，加入內(nèi)標(biāo)物木糖醇對(duì)照液0.01 mL以及70 g·L－1的磺基水楊酸溶液0.1 mL漩渦混勻后，6 000 rpm離心10 min，除去蛋白，將上層清液全部取出，空氣吹干后加入體積比為1∶1的吡啶、乙酸酐試劑100μL衍生化之后，振蕩使之充分混合，于80℃下反應(yīng)40 min，0.45μm微孔濾膜濾過后供進(jìn)樣用。

1.2.3 特異性實(shí)驗(yàn) 在上述色譜條件下，對(duì)空白溶劑、空白血漿、空白血漿加甘露醇對(duì)照品和靜注甘露醇注射液后的血漿樣品經(jīng)試樣制備方法處理后進(jìn)樣分析得到色譜圖（見圖1）。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍 取1.5 mL尖底塑料離心管數(shù)個(gè)，加入0.5 mL空白血漿，再加入適量不同濃度的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使血漿藥物濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mg·mL－1，加入內(nèi)標(biāo)后混勻，經(jīng)樣品試樣制備項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析。以濃度（C）對(duì)甘露醇與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（F）進(jìn)行線性回歸（權(quán)重因子K／F，K＝1.002 1）。

1.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 按“1.2.4”項(xiàng)下操作。制備甘露醇0.10、1.00和10.00 mg·mL－1三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每濃度5樣本，樣本經(jīng)衍生化之后進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線，計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計(jì)算本法的精密度。

1.2.6 穩(wěn)定性考察 取“1.2.5”項(xiàng)下0.10、1.00和10.00mg·mL－1QC樣品各6份，分別在室溫放置6 h及－20℃條件下放置，考察室溫放置試驗(yàn)、凍融試驗(yàn)及60 d長期凍融試驗(yàn)的穩(wěn)定性。

1.2.7 萃取回收率 取空白血漿數(shù)份，加入適量的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，使血漿中甘露醇的濃度分別為0.10、1.00和10.00 mg·mL－1。每個(gè)濃度5樣本進(jìn)樣量1μL。計(jì)算測(cè)得的甘露醇濃度與加入甘露醇的質(zhì)量濃度之比考察萃取回收率。

1.3 右旋糖酐40對(duì)該法測(cè)定甘露醇含量的影響

取空白血漿加右旋糖酐40，空白血漿加甘露醇及右旋糖酐40，靜注甘露醇注射液后的血漿樣品經(jīng)處理后進(jìn)樣分析得到的色譜圖（結(jié)果見圖2）。通過對(duì)進(jìn)樣后的色譜圖樣品峰的保留時(shí)間進(jìn)行比較，判定右旋糖酐40對(duì)甘露醇含量測(cè)定的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的前處理方案的選擇 由于血藥濃度一般較低，生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物較為復(fù)雜，往往會(huì)干擾樣品測(cè)定。因此樣品需經(jīng)過分離、純化和濃集等處理后再供測(cè)定。蛋白沉淀法具有簡單和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，雖有帶入分析的雜質(zhì)較多、會(huì)稀釋樣品的進(jìn)樣濃度等缺點(diǎn)，但在處理方案中將樣品在氮?dú)饬飨麓蹈蓾饪s，可以提高分析方法的靈敏度。而后進(jìn)行的衍生化反應(yīng)是基于特殊的基團(tuán)進(jìn)行的，因而可以排除雜質(zhì)干擾，提高靈敏度，更適合于本研究。因此，此方法提取穩(wěn)定且合理，是一種較優(yōu)的前處理方案。

2.2 衍生化方法的確定 根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］選用吡啶、雙－三甲基硅烷乙酰胺、三甲基氯硅烷（2∶1∶1，V／V／V）作為硅烷衍生化的溶劑，經(jīng)過在60℃下衍生化30 min后，氣相檢測(cè)效果不佳，峰面積大小不穩(wěn)定。因而改用吡啶、乙酸酐（1∶1，V／V）進(jìn)行酯化處理［7］，出峰清晰，峰面積穩(wěn)定。改變衍生化溫度分別為60、70、80、90和100℃，固定衍生化的加熱時(shí)間為20 min，取10mg·mL－1甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在60℃時(shí)，甘露醇與衍生化試劑不反應(yīng)，隨著加熱溫度逐漸升高，反應(yīng)速度加快，衍生化產(chǎn)物的峰面積也隨之增加，但溫度過高時(shí)會(huì)影響產(chǎn)率，并且影響血漿樣品的穩(wěn)定性。故選擇衍生化溫度為80℃。然后固定衍生化溫度為80℃，改變加熱時(shí)間為10～60 min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)加熱時(shí)間為30～60 min時(shí)，甘露醇的峰面積最大并保持穩(wěn)定，所以選擇加熱時(shí)間為40 min。

2.3 甘露醇的含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)從專屬性、線性范圍和最低檢出質(zhì)量濃度、精密度、回收率、穩(wěn)定性等方面對(duì)該法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。甘露醇的保留時(shí)間約為13.0 min，內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為9.5 min，甘露醇峰與雜質(zhì)峰可完全分離，血漿中雜質(zhì)峰不干擾甘露醇的測(cè)定，本法具有較高的專屬性（見圖1）；回歸方程為C＝0.995 0F－0.005 6（r2＝0.999 9，n＝5），線性范圍0.05～10.0 mg·mL－1，甘露醇最低可檢出質(zhì)量濃度為0.02 mg·mL－1（以信噪比大于3計(jì)）；回收率平均值為99.03%，且RSD均小于3%，測(cè)得結(jié)果具有較高的重現(xiàn)性（見表1）；日內(nèi)和日間RSD均小于15.0%，精密度良好；室溫放置試驗(yàn)、凍融試驗(yàn)和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定值和添加值的相對(duì)誤差（R.E.%）均小于15%，說明分析測(cè)試過程中樣品較為穩(wěn)定。

圖1 色譜圖

圖2 色譜圖

表1 萃取回收率（%）

續(xù)表1：

2.4 右旋糖酐40對(duì)該法測(cè)定甘露醇含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由色譜圖可知，血漿中的右旋糖酐沒有出峰，加入右旋糖酐40前后甘露醇的保留時(shí)間相同。表明血漿中的右旋糖酐40并不影響甘露醇的含量測(cè)定結(jié)果。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)驗(yàn)證符合生物樣品分析要求，且右旋糖酐40不影響甘露醇的測(cè)定結(jié)果。該方法可用于甘露醇和右旋糖酐40聯(lián)合用藥時(shí)血漿中甘露醇的含量測(cè)定。

［1］王堯，范佳，剛曉坤，等.腦出血治療中甘露醇使用的臨床體會(huì)［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010，10：946－947.

［2］蘇華燕，戚永娟，梁開.低分子右旋糖酐治療腎病綜合征療效的分析［J］.中國校醫(yī)，2007，21（4）：F0003.

［3］陳淑玲.復(fù)方丹參低分子右旋糖酐甘露醇聯(lián)用治療腦梗塞60例［J］.河北醫(yī)學(xué)，2007，13（2）：234－236.

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Determ ination of themannitol in plasma by GC when combined w ith Dextran 40

JIN Qing，WANG Ai-xia，LIRan，TAN Ran-ran
（College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China）

ObjectiveTo study the effect of Dextran 40 on the molcular in plasma by GC when they were combined.MethodsAfter the plasma sample was precipitated protein and derivatized，comparative the retention time of the Mannitol，Dextran 40 and the combination.ResultsThe chromatograms show that Dextran 40 had no effect on the determination of mannitol.ConclusionThis method can be used for the determination of mannitol in plasma when combination with Dextran 40.

GC；Dextran 40；Mannitol

R927.2

A

2095－5375（2014）02－0090－004

金青，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，藥物新劑型的研究，E－mail：jinqing_mail＠qust.edu.cn