瞿建宏，陳 輝，吳 偉,*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心/中國水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境與資源重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214081）

羅非魚原產(chǎn)于非洲，因具有生長快、個體大、病害少、肉質(zhì)營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，廣受世界各國消費(fèi)者和養(yǎng)殖業(yè)者的青睞，已成為世界性養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物，被FAO列為人類六大主食品之一[1]。近幾年來，隨著羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷提高，羅非魚病害時有發(fā)生，其中鏈球菌病是羅非魚主要的病害之一。據(jù)研究，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化，特別是養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽含量的增加，是羅非魚鏈球菌病爆發(fā)的誘因。不良生境不僅可直接危害養(yǎng)殖魚類，使魚體的免疫力下降，增加了細(xì)菌的易感性，而且也為病原菌的增殖和傳播提供了有利條件[2]。因此，從環(huán)境控制角度，尋求一種既能優(yōu)化養(yǎng)殖水體環(huán)境又可抑制病原菌爆發(fā)性生長的有效方法顯得意義重大。

傳統(tǒng)的魚病防治方法是使用藥物防治，抗生素等化學(xué)藥物的使用一方面帶來了顯著的防治效果，但同時也會因使用不當(dāng)造成病原菌的耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留等問題。既破壞了生態(tài)平衡，又造成了水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，而以微生態(tài)制劑為主的生物防治方法，避免了抗生素等化學(xué)藥物帶來的潛在危害，滿足了環(huán)境友好型水產(chǎn)養(yǎng)殖的要求，日益受到養(yǎng)殖業(yè)者的高度關(guān)注。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，微生態(tài)制劑不僅可以作為添加劑添加于飼料，還可以直接添加于水體中[3]，起到凈化養(yǎng)殖水質(zhì)、優(yōu)化養(yǎng)殖水域生態(tài)結(jié)構(gòu)、抑制水體中病原菌的生長、提高養(yǎng)殖生物的免疫力，使養(yǎng)殖活動良性循環(huán)發(fā)展。目前已有乳桿菌（Lactobacillussp.）、芽孢桿菌（Bacillussp.）、假單胞菌（Pseudomonassp.）等微生態(tài)制劑被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害防治中，但針對某種特定的魚類和病原體的微生態(tài)制劑的研究幾乎未見報導(dǎo)。本文試圖從自羅非魚養(yǎng)殖水體中分離得到的具有凈化水質(zhì)功能的微生物菌株中篩選出對羅非魚鏈球菌病原——海豚鏈球菌具拮抗功能的菌株，并從生長優(yōu)勢、共凝集、凈化水質(zhì)的能力等方面進(jìn)一步篩選得到最適的拮抗菌株，以期為羅非魚鏈球菌病的生態(tài)防控提供有效方法和適宜菌株，為羅非魚的健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芽孢桿菌（Bacillussp.）、乳桿菌（Lactobacillussp.）、假單胞菌（Pseudomonassp.）、假絲酵母（Candidasp.）、諾卡氏菌（Nocardiasp.）等由中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心環(huán)境保護(hù)研究室分離鑒定并提供；海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院保存并提供。

1.2 試劑及儀器

試劑：蛋白酶K（≥250 μg/mg）、胰蛋白酶（≥2 500 μg/mg）、Tris-Hcl緩沖液、革蘭氏染液，由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)；硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碘化鉀、氫氧化鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、硫酸鋅、硫酸鐵、酒石酸鉀鈉、二氯化汞、4-氨基苯磺酰胺、N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽，均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；丙酮、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚，均為分析純，由上海聯(lián)試化工試劑有限公司生產(chǎn)；BS培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基，由北京陸橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

儀器：0.02 mm游標(biāo)卡尺、PHS-3TC PH酸度計、Eppendorf移液槍、AL 204電子分析天平、Sigma 2-16K臺式高速冷凍離心機(jī)、Agilent 7530型紫外分光光度計、Nikon 90i光學(xué)顯微鏡、ELx808酶標(biāo)儀、SANYO MIR-153型高低溫恒溫培養(yǎng)箱、ZHWY200B恒溫振蕩搖床、TOMY Autoclave SS-325型全自動高壓滅菌器、ZHJH-1214雙面氣流式無菌工作臺、一次性細(xì)菌微孔濾膜器（膜孔徑為0.22 μm），一次性滅菌注射器（2 mL、5 mL），打孔器等。

培養(yǎng)基：芽胞肝菌、假單胞肝菌采用BS培養(yǎng)基；乳桿菌采用MRS培養(yǎng)基；假絲酵母、諾卡氏菌采用PDA培養(yǎng)基；海豚鏈球菌采用BHI培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化和純化 在紫外無菌操作臺從 4℃冷藏保存的菌種斜面上取一環(huán)菌苔，接種于 50 mL滅菌的液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，取菌液在含固體培養(yǎng)基的平板上劃線，置平板于恒溫28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。從平板上挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，合格后將單菌落接種于滅菌的斜面固體培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 拮抗海豚鏈球菌的功能微生物篩選 參照Tramer等[4]的抑菌圈方法進(jìn)行。采用BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)海豚鏈球菌，28℃培養(yǎng)24 h，吸取0.1 mL培養(yǎng)液于無菌平皿中，待經(jīng)115℃滅菌的BHI固體培養(yǎng)基冷卻至40℃左右后，倒入平板，與菌液混勻后放置于無菌室約1 h，取出并倒置放于4℃冰箱中1 h。用打孔法（用直徑0.40 cm打孔器在平板表面均勻打孔，然后按照每孔15 μL的加樣量加入經(jīng)過濾除菌的待測菌株培養(yǎng)液）將待測菌株的過濾除菌濾液引入平板，每一個處理3個重復(fù)，28℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小，計算平均抑菌圈直徑。

1.3.3 拮抗海豚鏈球菌的功能微生物的復(fù)篩

1.3.3.1 菌株生長曲線的測定 參照Niall等[5]的方法進(jìn)行。待測菌株培養(yǎng)20 h后用0.85%的無菌生理鹽水調(diào)至菌濃度約為107 cfu/mL，取10 μL菌液分別加入含250 μL液體培養(yǎng)基的酶標(biāo)板各孔中，每個樣品做3個平行，以10 μL無菌生理鹽水代替菌液為對照。將96孔板置28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔30 min用酶標(biāo)儀測定各孔OD630值，連續(xù)測定24 h。根據(jù)OD630值繪制生長曲線，然后選取生長曲線上最陡的8個點(diǎn)做生長曲線擬合度直線，直線斜率即為最大生長率（μ），直線在X軸上的截距為延滯期（λ），生長曲線穩(wěn)定期切線在Y軸上的截距為最大生物量（A）。根據(jù)公式t=ln2/μ求得倍增時間(t)，根據(jù)公式RI=1/(λ×td)求得各菌株的生長系數(shù)（RI）。

1.3.3.2 共凝集試驗(yàn) 參照Chabrillon等[6]方法并稍作修改進(jìn)行。于肉湯液體培養(yǎng)基中接種海豚鏈球菌和上述初篩的拮抗菌株，28℃過夜培養(yǎng)，測定其OD630值，并將其OD630值稀釋至0.5，然后各取海豚鏈球菌和拮抗菌株1.5 mL于無菌具塞試管中，渦旋振蕩混勻，28℃靜置培養(yǎng)4 h后測定OD630值。3.0 mL純培養(yǎng)的海豚鏈球菌和拮抗菌株28℃靜置培養(yǎng)4 h作為對照管。共凝集率=[(SC+LC)/2-(S+L)/(SC+LC)/2]×100；式中：SC和LC分別表示對照管海豚鏈球菌和拮抗菌株的終OD630值，S+L表示試驗(yàn)管終OD630值。

1.3.3.3 不同菌株對水體中兩種形式無機(jī)氮的利用 取羅非魚養(yǎng)殖水體，經(jīng) 121℃滅菌后備用。在上述養(yǎng)殖水體中加入經(jīng)抽濾除菌的NH4Cl和NaNO2溶液，使水中NH4+-N的濃度為1.0 mg/L、3.5 mg/L和7.0 mg/L；NO2--N的濃度為0.15 mg/L、0.50 mg/L和1.00 mg/L。以養(yǎng)殖水體（初始濃度NH4+-N為0.34 mg/L，NO2--N為0.08 mg/L）為對照，加入經(jīng)培養(yǎng)24 h后的海豚鏈球菌菌液，使各組水體中初始菌濃度為1.0×106cfu/mL，于28℃下恒溫培養(yǎng)24 h，分析在不同氨氮、亞硝酸鹽濃度下海豚鏈球菌的生長情況。同時，在NH4+-N濃度為7.0 mg/L或NO2--N濃度為1.00 mg/L 、pH值為7.0的滅菌養(yǎng)殖水體中加入所篩選的拮抗功能菌株，初始菌濃度為1.0×106cfu/mL，于28℃下恒溫培養(yǎng)，48 h后取樣，測定水樣中的NH4+-N和NO2--N濃度。試驗(yàn)方法參照吳偉等[7]的方法并稍作修改，NH4+-N和NO2--N分別采用納氏試劑法、重氮-偶氮分光光度法[8]。試驗(yàn)設(shè)3個平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著度水平α為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的活化培養(yǎng)和純化

將從羅非魚養(yǎng)殖水體中分離所得的具凈水功能的微生物菌株進(jìn)行活化和純化，獲純菌株57株，分別標(biāo)記為：B0901～B0918（芽孢桿菌））、L0901～L0920（乳桿菌）、C0901～C0910（假絲酵母）、N0901～N0906（諾卡氏菌）、P0901～P0903（假單胞菌）。

2.2 拮抗海豚鏈球菌的功能微生物篩選

采用打孔法對從水中分離的具有凈化水質(zhì)功能的微生物菌株進(jìn)行篩選，共篩選出11株對海豚鏈球菌具有拮抗作用的菌株，其中B0903、B0910、B0916（芽孢桿菌）、L0914、L0917（乳桿菌）、C0909（假絲酵母）、N0906（諾卡氏菌）7株菌株的拮抗效果比較明顯，結(jié)果見圖1、2。

圖1 采用打孔法測定菌株拮抗作用的結(jié)果

圖2 拮抗功能菌株對海豚鏈球菌的抑制作用

表1 拮抗菌株與海豚鏈球菌的生長曲線的參數(shù)(a: P<0.05 )

2.3 拮抗海豚鏈球菌的功能微生物的復(fù)篩

2.3.1 生長曲線的測定 對所篩的7株具拮抗功能的菌株和海豚鏈球菌進(jìn)行了生長曲線的測定，從中推導(dǎo)得出了相關(guān)的生長參數(shù)，具體見表1。由表1可知，7株菌株中除L0914外，其余的最大生長量均高于海豚鏈球菌；7株菌株的最大生長率、生長系數(shù)均高于海豚鏈球菌；B0903、B0910、B0916的延滯生長期時間顯著長于海豚鏈球菌（P<0.05），L0917的延滯生長期顯著短于海豚鏈球菌（P<0.05）；除B0903倍增時間長于海豚鏈球菌外，其余 6株均短于海豚鏈球菌的倍增時間，其中L0917、C0909、N0906的倍增時間顯著短于海豚鏈球菌的倍增時間（P<0.05）。生長系數(shù)較大且具有短的延滯生長期和短的倍增時間的菌株具有生長優(yōu)勢，由此可知L0917、C0909 、N0906具有生長優(yōu)勢，且C0909的生長優(yōu)勢最強(qiáng)。

2.3.2 共凝集實(shí)驗(yàn) 7株拮抗菌株與海豚鏈球菌的共凝集效果如圖 3所示。只有 L0914、C0909、N0906能與海豚鏈球菌產(chǎn)生共凝集作用，共凝集率分別為3.03%、4.11%、1.85%。

2.3.3 不同菌株對水體中兩種形式的無機(jī)氮的利用

2.3.3.1 海豚鏈球菌對水體中兩種形式無機(jī)氮的利用 研究結(jié)果（圖4和圖5）顯示，NH4+-N、NO2--N濃度對海豚鏈球菌的生長有一定的影響。NH4+-N濃度為7.0 mg/L的試驗(yàn)組中海豚鏈球菌的菌量顯著高于對照組（P<0.05），NH4+-N濃度為1.0 mg/L的試驗(yàn)組與對照組相比無顯著差異（P>0.05），表明一定量的NH4+-N可以為海豚鏈球菌提供氮源，促進(jìn)其生長和繁殖；NO2--N濃度為0.50 mg/L、0.15 mg/L的試驗(yàn)組與對照組無顯著差異（P>0.05），NO2--N濃度為1.00 mg/L的試驗(yàn)組與對照組相比差異顯著（P<0.05），表明過高的NO2--N可對細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性作用而引起海豚鏈球菌生長受到抑制。

圖5 養(yǎng)殖水體中的NO2--N對海豚鏈球菌生長的影響

表2 7株拮抗功能菌株對氨氮、亞硝酸的去除能力

2.3.3.2 7株拮抗菌株對水體中兩種形式無機(jī)氮的利用 7株拮抗菌株對水體中兩種形式無機(jī)氮的利用以去除率表示，結(jié)果如表2所示。7株菌株對養(yǎng)殖水體中的NH4+-N、NO2--N都具有一定的去除能力。B0916、L0917具有較強(qiáng)的對NH4+-N和NO2--N的綜合去除能力，對NH4+-N的去除率分別為57.43%和54.14%，對NO2--N的去除率為61.00%和76.00%。去除NO2--N能力較強(qiáng)的菌株為B0916、L0914、L0917；而去除NH4+-N的能力由強(qiáng)到弱依次為N0906>B0910>B0916> 0917>B0903>L0914>C0909。菌株N0906與B0910在NH4+-N去除率上差異不顯著(P>0.05)，而與其它菌株之間差異顯著(P<0.05)。根據(jù)海豚鏈球菌對水體中兩種形式無機(jī)氮的利用試驗(yàn)結(jié)果可以看出，NH4+-N濃度較高時，海豚鏈球菌可以利用銨態(tài)氮滿足自身的生長和繁殖，因此降低水體NH4+-N的濃度有利于抑制海豚鏈球菌的快速增殖，B0910和N0906菌株具有較高的NH4+-N的去除率，有利于與海豚鏈球菌競爭銨態(tài)氮資源從而抑制其生長。

3 討 論

羅非魚鏈球菌病的發(fā)生主要是魚體、病原菌和環(huán)境三者之間相互復(fù)雜作用的結(jié)果，其中養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化加重了病害的流行與危害程度。據(jù)研究報道，大部分魚類發(fā)病池塘的水質(zhì)很差，氨氮含量超過3 mg/L[1]。環(huán)境的惡化可導(dǎo)致魚體的生長和健康受到損害，抵抗力下降，而這種惡化環(huán)境中的主要污染因子（如氨氮、亞硝酸鹽）恰恰是病原菌良好的營養(yǎng)源，可促使其大量繁殖，最終導(dǎo)致疾病的大規(guī)模爆發(fā)。Narad等[9]認(rèn)為羅非魚鏈球菌病的發(fā)生與水質(zhì)理化因子、養(yǎng)殖密度等可引起魚體應(yīng)激反應(yīng)的因素有關(guān)。其也與水體中存在的大量鏈球菌有直接的關(guān)聯(lián)[10]。本項(xiàng)研究選擇從分離自羅非魚養(yǎng)殖水環(huán)境中具有凈化水質(zhì)功能的微生物菌株中來篩選拮抗菌株，避免了外源生物的影響，保證了所篩選菌株的生態(tài)應(yīng)用安全性。拮抗菌株的篩選方法主要是基于抑菌活性物質(zhì)可以在固體或半固體培養(yǎng)基上擴(kuò)散，從而抑制敏感指示菌的生長，在培養(yǎng)基上形成透明抑菌圈這一機(jī)制。目前常見的實(shí)驗(yàn)方法有點(diǎn)種法（spot-on-the-lawn）、紙片法（disc-diffusion）、打孔法（well-diffusion）等。本研究采用紙片法和打孔法做了預(yù)試驗(yàn)，并對2者的效果進(jìn)行了比較。當(dāng)用紙片法吸取同等體積的無菌濾液于直徑相同的濾紙圓片中時，濾紙圓片上的濾液向四周擴(kuò)散的速度和數(shù)量可能會不一致，可導(dǎo)致抑菌圈變成橢圓形，不易于菌株拮抗活性大小的比較，故正式研究時采用的是打孔法。另外指示菌濃度也對抑菌圈的邊緣整齊程度、清晰度、抑菌圈直徑有著影響[11]。研究選用6×107cfu/mL、6×106cfu/mL、6×105cfu/mL 3種指示菌濃度做比較，濃度為6×106cfu/mL時，抑菌圈邊緣清晰，易于觀察和測量，且抑菌圈值較大。因此后續(xù)的試驗(yàn)研究過程中采用的海豚鏈球菌濃度為6×106cfu/mL。

經(jīng)打孔法初步篩選獲得了11株具拮抗功能的菌株，其中拮抗功能比較強(qiáng)的菌株有7株，分別為3株芽孢桿菌、2株乳酸桿菌、1株是諾卡氏菌和1株假絲酵母。關(guān)于芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌作為微生態(tài)制劑應(yīng)用于水產(chǎn)病害生態(tài)防治的報道已很多，而放線菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用甚少，近幾年也都只局限于海洋放線菌上[12-13]。Salah等[14]在體外拮抗實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對嗜水氣單孢菌具有拮抗作用，將其添加到飼料中喂食羅非魚，魚體的成活率提高，免疫力增強(qiáng)。Vo Minh Son等[15]用添加乳酸桿菌的飼料喂食斜帶石斑魚，降低了由鏈球菌引起感染的死亡率，存活率提高了36.7%。Mohsen等[16]將不同量的釀酒酵母菌添加到飼料中喂養(yǎng)尼羅羅非魚 14周后，采用注射法感染嗜水氣單孢菌，10 d后魚體的死亡率和血清中病原菌的數(shù)量隨著添加釀酒酵母菌量的增加而降低。

微生態(tài)制劑進(jìn)入復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境后需形成優(yōu)勢種群才能充分發(fā)揮其作用，因此微生態(tài)制劑必須具有快速的生長優(yōu)勢，以便能夠在水環(huán)境中迅速繁殖成為優(yōu)勢種群凈化水質(zhì)，并且也能夠有更多的機(jī)會粘附于魚類機(jī)體。通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、營養(yǎng)競爭等途徑而發(fā)揮抑菌作用。從生長參數(shù)來看，C0909的生長最具優(yōu)勢，L09017、N0906的倍增時間顯著短于海豚鏈球菌，延滯期也較短，在一定條件下也可以形成優(yōu)勢菌。

有益微生物與病原菌之間的共凝集被認(rèn)為是排除病原菌的一種方法。本研究的7株拮抗菌株只有L0914、C0909、N0906與鏈球菌產(chǎn)生共凝集作用，共凝集率分別為3.03%、4.11%、1.85%，與Chabrillon等[6]的候選菌與病原菌2%左右的共凝集率結(jié)果相似，但卻明顯低于張子華等[17]從魚體腸道分離的候選菌與病原菌10%以上的共凝集率。這可能是從腸道分離的菌株本身具有分泌粘液粘附于腸道才得以在腸道中生存的本能所導(dǎo)致。共凝集有助于拮抗菌株與鏈球菌結(jié)合在一起后影響鏈球菌對羅非魚體表和鰓粘液的粘附作用，從而有效地排除病原菌。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，氨氮、亞硝酸鹽是高產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中2項(xiàng)極為重要、需引起重點(diǎn)關(guān)注的水質(zhì)因子[18]。水體中的分子態(tài)氨、亞硝酸鹽對養(yǎng)殖生物而言屬有毒因子，它會破壞魚類及其它水生動物的鰓組織，并滲進(jìn)血液中，使魚體抵抗力下降，對病原菌的易感性增強(qiáng)，因此本研究選擇氨氮和亞硝酸鹽兩個指標(biāo)，研究海豚鏈球菌和7株拮抗菌株對兩種形式無機(jī)氮的利用能力。芽孢桿菌、乳酸桿菌、諾卡氏菌，假絲酵母四種菌株凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的研究均有報道[19-22]，不同的菌株其凈化特性不同，在分解水中有機(jī)物、同化水中氨氮、降低亞硝酸鹽等方面發(fā)揮的作用各異。陳靜等[20]研究表明枯草芽孢桿菌B7對氨氮的去除率大于80%，對亞硝酸鹽的去除率大于29%，該結(jié)果說明枯草芽孢桿菌對氨氮和亞硝酸鹽具有一定的轉(zhuǎn)化去除功能。劉慧玲等[23]應(yīng)用枯草芽孢桿菌凈化羅非魚魚苗養(yǎng)殖水體的結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌對氨氮、亞硝酸鹽的去除率分別為45.8%、75.9%。丁雷等[24]卻發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌不能起到分解水體中小分子有機(jī)物、同化氨氮的作用，但有明顯降低亞硝酸鹽的作用。陳紅菊等[25]研究了光合細(xì)菌、芽孢細(xì)菌、放線菌對養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量的影響，其結(jié)果表明三種微生物都有凈化水質(zhì)的作用，放線菌的凈化效果優(yōu)于光合細(xì)菌和芽孢細(xì)菌。本研究中諾卡氏菌N0906去除氨氮的能力最強(qiáng)，去除率為63.31%，乳桿菌L0917具有很強(qiáng)的亞硝酸鹽去除能力，去除率為76.31%，雖然乳桿菌L0917在拮抗作用、生長優(yōu)勢、共凝集作用上弱于諾卡氏菌N0906，但在亞硝酸鹽去除能力上優(yōu)于諾卡氏菌N0906。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，單一使用諾卡氏菌N0906會存在對亞硝酸鹽降解不足的缺點(diǎn)，因此可以利用乳桿菌L0917降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)的特性，與諾卡氏菌N0906菌株相配互補(bǔ)，以進(jìn)一步增強(qiáng)水體凈化的效果。

4 小 結(jié)

在羅非魚養(yǎng)殖水體中分離到多株具有凈化水質(zhì)功能的菌株，通過對這些菌株的初篩，獲得了 11株對羅非魚鏈球菌病的病原——海豚鏈球菌具有拮抗功能的微生物菌株。對其中7株拮抗效果較為顯著的菌株從生長優(yōu)勢、共凝集率、凈化水質(zhì)能力等3方面進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，獲得一株具綜合優(yōu)勢的高效菌株——諾卡氏菌N0906。相對于其它的菌株，諾卡氏菌N0906具有良好的生長優(yōu)勢、可與鏈球菌產(chǎn)生共凝集作用、具有良好的凈化水質(zhì)功能，故適宜作為羅非魚養(yǎng)殖中控制養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境和鏈球菌病害的微生態(tài)菌株。但諾卡氏菌N0906的拮抗機(jī)理、生態(tài)安全性以及與其它菌株的互補(bǔ)協(xié)同等還有待于進(jìn)一步研究，以便對菌株的應(yīng)用前景作出科學(xué)評價，從而更好地應(yīng)用于羅非魚養(yǎng)殖中水質(zhì)的調(diào)控和鏈球菌病的生態(tài)防治。

[1]Liu C H, Chen J C.Effect of ammonia on the immune response of white shrimpLitopenaeus vannameiand its susceptibility toVibrio alginolyticus[J].Fish & Shellfish Immunology, 2004, 16(3): 321-334.

[2]Cheng W, Hsiao I S, Chen J C.Effect of ammonia on the immune response of Taiwan abaloneHaliotis diversicolorsupertexta and its susceptibility toVibrio parahaemolyticus[J].Fish & Shellfish Immunology, 2004, 16(3): 193-202.

[3]Thompson F L, Abreu P U, Cavalli R.The use of microorganisms as food source forPenaeus paulensislarvae [J].Aquaculture,1999, 174: 139-153.

[4]Tramer J, Fowler G C.Estimation of nisin in foods [J].Journal of the Science Food and Agriculture, 1964, 15(8): 522-528.

[5]Niall G V, Winston D L, Horst K.In Vitro growth characteristics of five candidate aquaculture probiotics and two fish pathogens grow in fish intestinal mucus [J].Fems Microbiology Letters, 2004, 231: 145-152.

[6]Chabrillon M, Rico R M, Arijo S, et al.Interactions of microorganisms isolated from gilthead sea bream,Sparus aurataL., onVibrio harveyi, a pathogen of farmedSenegalese sole,Solea senegalensis(Kaup)[J].Journal of Fish Diseases, 2005, 28(9): 531-537.

[7]吳偉, 胡庚東, 瞿建宏, 等.應(yīng)用短乳桿菌去除養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報, 2007, 23(4): 37-40.

[8]國家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版.北京: 中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2002: 268-275.

[9]Naraids, Fanrongk, Dannyk, et al.Occurrence of rare genotypes ofStreptococcus agalactiaein cultured redTilapiaOreochromissp.andNiletilapianiloticusin Thailand-Relationship to human isolates[J].Aquaculture, 2008, 284: 35-40.

[10]Eldar A, Bejerano Y, Livoff A, et al.Experimental streptococcal menigo-encepgalitis in cultured fish[J].Veterinary Microbiology,1995, 43(1): 33-40.

[11]何寧, 王昌祿, 順小波, 等.杯碟法檢測乳酸菌素活性優(yōu)化條件的研究[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 1999(2): 17-20.

[12]張梁, 沈建忠, 陳佳毅.噬菌蛭弧菌對草魚池水質(zhì)及細(xì)菌群落的影響[J].水生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 2(1): 6-10.

[13]暴增海, 馬桂珍, 吳少杰, 等.海洋放線菌BM-2菌株的抗菌特性[J].農(nóng)藥, 2009, 48(9): 640-643.

[14]Salah M A,Youself A G A, Ahlam A A G, et al.Studies onBacillus subtilisandLactobacillus acidopHilus, as potential probiotics, on the immune response and resistance ofTilapia nilotica(Oreochromis niloticus) to challenge infections[J].Fish &Shellfish Immunology, 2008, 25: 128-136.

[15]Vo M S, Chang C C, Wu M C, et al.Dietary administration of the probiotic,Lactobacillus plantarum, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper EpinepHelus coioides[J].Fish & Shellfish Immunology, 2009, 26: 691-698.

[16]Mohsen A T, Azza M A R, Nahla E M.Evaluation of commercial live bakers’yeast,Saccharomyces cerevisiaeas a growth and immunity promoter for fry nile Tilapia,Oreochromis niloticus(L.) challenged in situ withAeromonas hydropHila[J].Aquaculture,2008, 280: 185-189.

[17]張子華, 鄢慶枇, 皺文政, 等.鰻鱺腸道中嗜水氣單胞菌的拮抗菌的篩選[J].集美大學(xué)學(xué)報, 2010, 14(3): 5-11.

[18]張來發(fā), 蔣桂珍.高產(chǎn)池塘三項(xiàng)水質(zhì)因子控制[J].水產(chǎn)科技情報, 1994, 22(9): 59-61.

[19]Salah M A, Youself A G A, Ahlam A A G, et al.Studies onBacillus subtilisandLactobacillus acidopHilus, as potential probiotics, on the immune response and resistance ofTilapia nilotica(Oreochromis niloticus) to challenge infections[J].Fish &Shellfish Immunology, 2008, 25: 128-136.

[20]陳靜, 徐海燕, 谷巍.枯草芽孢桿菌B7的分離和凈化水質(zhì)的初步研究[J].河北漁業(yè), 2008, 11(179): 10-11.

[21]張慶芳, 遲乃玉, 鄭學(xué)仿, 等.短乳桿菌(Lactobacillus brevis)去除亞硝酸鹽的研究[J].微生物學(xué)通報, 2004, 31(2): 55-60.

[22]吳偉, 余曉麗, 李詠梅.假絲酵母菌對養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的降解特性研究[J].中國環(huán)境科學(xué), 2001, 21(1): 8-11.

[23]劉慧玲, 黃翔鵠, 李長玲, 等.不同濃度的枯草芽孢桿菌對羅非魚魚苗的養(yǎng)殖水體水質(zhì)及其抗病力的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2009, 30(10): 5-9.

[24]丁雷, 岳永生, 李貴杰, 等.芽胞菌對養(yǎng)魚水質(zhì)影響的研究[J].淡水漁業(yè), 1999, 29(10): 7-10.

[25]陳紅菊, 岳永生, 丁雷, 等.生物凈化劑對養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽含量影響的研究[J].淡水漁業(yè), 2003, 33(1): 16-18.