陳玲鳳，韓宗璽，邵昱昊，孔憲剛，劉勝旺

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室/禽呼吸道病創(chuàng)新團(tuán)隊，黑龍江 哈爾濱 150001)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由IB 病毒(IBV)引起的一種急性高度接觸性的傳染性呼吸道疾病。該病主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)，造成肉雞增重減少、蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。

IBV 基因組為單股不分節(jié)段的正鏈RNA，基因組全長約為27 600 nt[2]，具有5' 端帽子結(jié)構(gòu)和3' 端poly(A)結(jié)構(gòu)。該病毒基因組含有6 個開放閱讀框(ORF)，從5'端開始的前2/3 的基因組序列僅編碼具有活性的聚合酶，后1/3 的基因組序列編碼病毒的4 個結(jié)構(gòu)蛋白[3]。其中mRNA1 包含2 個ORF，即ORF1a 和ORF1b，分別編碼450 ku 和300 ku，但因核糖體移碼作用，這兩個ORF 可合并產(chǎn)生一個大蛋白即PP1ab，分子量約為750 ku。該大蛋白可通過病毒自身編碼的蛋白酶裂解為相應(yīng)的功能蛋白[4]。ORF1a 和ORF1b 之間還存在特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，稱之為假結(jié)，研究表明該結(jié)構(gòu)可通過調(diào)節(jié)核糖體延伸循環(huán)而改變重疊區(qū)的閱讀框[5]。假結(jié)上游28 nt 處為滑脫序列，為保守的TTTAAAC[6]。而mRNA2，mRNA4，mRNA6 為單順反子，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)；mRNA3，mRNA5 為多順反子，各含3 個和2 個ORF，編碼3a、3b、E 及5a 和5b 蛋白[7]。

盡管H120 疫苗廣泛應(yīng)用國內(nèi)大多數(shù)雞場，但H120 樣型病毒株在發(fā)病雞場中仍有較高的分離率。本研究通過對病毒株ck/CH/LHLJ/090908 的基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明該分離株與H120疫苗株親緣關(guān)系最近，但其E 蛋白缺失11 個氨基酸，顯示該分離株為H120 疫苗株在雞群中自然傳代中形成的變異株。

1 材料和方法

1.1 病 毒 IBV ck/CH/LHLJ/090908 株為本實驗室分離鑒定[8]。

1.2 主要實驗材料 TRIzol Reagent RNA 提取試劑盒購自Invitrogen 公司；One Step RT-PCR Kit Ver.2、One Step PrimeScript?RT-PCR kit、3'-Full RACE Core Set Ver.2、Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit、DNA Maker、Ex Taq DNA 聚 合酶、pMD18-T 載體均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 純化回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；受體菌TG1 由本實驗室制備并保存；引物由本實驗室設(shè)計并保存。

1.3 病毒基因組RT-PCR擴(kuò)增及克隆測序 以含病毒雞胚尿囊液中提取的總RNA 為模板，進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)程序為：50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃2 min，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。基因組5' 端和3' 端的序列分別參照Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit和3'-Full RACE Core Set Ver.2 的使用說明書進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的片段分別克隆于pMD18-T 載體中，由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 ORF的確定和序列分析 應(yīng)用DNAStar 中MEGALIGN 程序?qū)Σ《镜娜蚪M序列進(jìn)行拼接和比對，經(jīng)Gene Runner3.0 軟件對序列進(jìn)行編輯和ORF 確定，并以MEGA6.0 軟件對該病毒株的全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 ck/CH/LHLJ/090908的全基因組序列擴(kuò)增、克隆及測序 從ck/CH/LHLJ/090908 病毒RNA 中擴(kuò)增出16 條與預(yù)計大小相符的片段(圖1)，將擴(kuò)增片段分別克隆于pMD18-T 載體中，篩選重組陽性質(zhì)粒，每個片段選擇5 個以上獨(dú)立克隆進(jìn)行測序，保證病毒株序列測定的準(zhǔn)確性。

圖1 IBV 全基因組的RT-PCR 擴(kuò)增的16 個重疊片段電泳圖Fig.1 RT-PCR amplifications of the 16 overlapping fragments covering the whole genome of IBV

2.2 ck/CH/LHLJ/090908的全基因組序列的確定將病毒基因組中獲得的16 個首尾重疊的基因片段進(jìn)行拼接，與參考病毒株Beaudette 進(jìn)行比較，顯示該分離株基因組的組成特征為：5'-1a-1b-S-3a-3b-EM-5a-5b-N-3'，符合IBV 基因組組成特征(表1)。測定其基因組全長為27 609 nt，與H120 疫苗株具有較高的核苷酸同源性(GenBank No.KJ425503)。

2.3 ck/CH/LHLJ/090908全基因組序列分析 將該分離株與20 株參考株進(jìn)行比較分析，核苷酸同源性在91.3 %～99.8 %。通過構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果表明該病毒株為H120 樣型病毒株，與H120 同源性極高，達(dá)99.7 %。

表1 ck/CH/LHLJ/090908 推測的ORFTable 1 ORF encoded in ck/CH/LHLJ/090908 genome

圖2 IBV 全基因組核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree constructed on the basis of the full-length genome of IBV

2.4 ck/CH/LHLJ/090908的ORF1遺傳特征 分離株ck/CH/LHLJ/090908 的ORF1 全長19 835 nt，包含兩個ORF，即ORF1a 和ORF1b。其中ORF1a 為11 802 nt，編碼3 933 個氨基酸殘基組成的多肽；ORF1b 為8 034 nt，編碼2 677 個氨基酸殘基組成的多肽。ck/CH/LHLJ/090908 與H120 的ORF1 核苷酸序列同源性較高，達(dá)99.9 %?；蚪M僅存在少量的點(diǎn)突變。

2.5 ck/CH/LHLJ/090908的S基因遺傳特征 分離株ck/CH/LHLJ/090908 與H120 疫苗株的S 基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)序列(TAS)及其ORF 起始密碼子ATG 之間的核苷酸數(shù)目相同，均為52 nt，而且TAS 序列也相同，為CTGAACAA。其S 基因為3 489 nt，編碼1 162個氨基酸組成的S 蛋白。其中S1 基因為1 611 nt，編碼537 個氨基酸組成的S1 蛋白，而S2 基因為1 878 nt，編碼625 個氨基酸組成的S2 蛋白。其S蛋白的裂解識別位點(diǎn)為533RRFRR537，與H120 疫苗株相同。

分離株ck/CH/LHLJ/090908 的S 基因與H120 比較，核苷酸同源性為99.7 %。其S1 基因與H120 比較，同源性為99.8 %，僅出現(xiàn)4 個位點(diǎn)的突變，突變位點(diǎn)分別位于351、439、440、1 063 位；S2 基因與H120 比較，同源性為99.7 %，出現(xiàn)6 個位點(diǎn)的突變，突變位點(diǎn)分別位于174、1 046、1 290、1 529、1 722、1 796 位。

2.6 ck/CH/LHLJ/090908的ORF3遺傳特征 IBV分離株基因3 的TAS 序列為CTGAACAA，與H120相同。其TAS 序列與ORF 起始密碼子ATG 之間的核苷酸數(shù)目相同，均為23 nt。IBV 分離株ck/CH/LHLJ/090908 的基因3 由645 nt 組成，而H120 的基因3 由678 nt 組成。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)ck/CH/LHLJ/090908 的ORF3c 基因在248 nt～280 nt 處缺失33 個堿基(圖3)，導(dǎo)致E 蛋白缺失11 個氨基酸，編碼98 個氨基酸的E 蛋白，而H120 疫苗株由330 nt組成，編碼109 個氨基酸的E 蛋白。

圖3 ck/CH/LHLJ/090908 ORF3c 基因33 個堿基的缺失Fig.3 The deletion of 33 nucleotides in the ORF3c gene of ck/CH/LHLJ/090908

2.7 ck/CH/LHLJ/090908的M 基因遺傳特征 IBV分離株的M 基因核苷酸序列由678 nt 組成，編碼225 個氨基酸的M 蛋白。與H120 進(jìn)行比較分析，其核苷酸同源性為99.9 %，變異僅發(fā)生在T189C 位。M 蛋白含有一個或兩個潛在的糖基化位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，M 蛋白至少有一個共同的潛在糖基化位點(diǎn)，即位于高度保守的NCT 序列上[9]。比較分析IBV 分離株M 蛋白的氨基酸序列，有兩個潛在的糖基化位點(diǎn)，為NET 和NCT。

2.8 ck/CH/LHLJ/090908的ORF5遺傳特征 分離株的基因5 由443 nt 組成，ORF5a 由198 nt 組成，編碼65 個氨基酸的5a 蛋白；ORF5b 由249 nt 組成，編碼82 個氨基酸的5b 蛋白。比較分析IBV 分離株與H120 參考株的基因5 序列，發(fā)現(xiàn)ORF5a 和ORF5b 基因核苷酸序列同源性均為100 %。

2.9 ck/CH/LHLJ/090908的N基因遺傳特征 分離株的N 基因均由1 230 nt 組成，編碼409 個氨基酸的N 蛋白。32 株IBV 分離株均含有30 個絲氨酸殘基，其中在165～190 位約有9 個絲氨酸比較保守，為絲氨酸聚集區(qū)[10]。比較分析IBV 分離株與H120參考株的N 基因序列，其核苷酸同源性為99.8 %，僅存在兩個點(diǎn)突變，即T64C 和C536T。

3 討論

分離株ck/CH/LHLJ/090908 屬于H120 樣型病毒株，與H120 疫苗株的基因組序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明其核苷酸同源性達(dá)99.7 %，只有0.3 %的核苷酸差異。將其結(jié)構(gòu)蛋白基因與H120 進(jìn)行比較分析，其中M 蛋白的氨基酸同源性為100 %；S 蛋白及N 蛋白的氨基酸同源性均為99.5 %；而E 蛋白的氨基酸同源性僅為88 %，差異最大。進(jìn)一步的分析表明該分離株的ORF3c 序列在248 nt～280 nt 處連續(xù)缺失33 nt，導(dǎo)致E 蛋白缺失11 個氨基酸。

在國內(nèi)，H120 疫苗仍是應(yīng)用最廣泛的疫苗。本實驗室分離株ck/CH/LHLJ/090908 核苷酸序列與H120 疫苗株高度同源，但其ORF3c 基因缺失了33 nt，導(dǎo)致E 蛋白缺失11 個氨基酸，基因組其他位置僅出現(xiàn)點(diǎn)突變現(xiàn)象。結(jié)果表明，該分離株的出現(xiàn)可能與弱毒疫苗的使用有關(guān)，由于其E 蛋白缺失11 個氨基酸，表明該病毒株可能是疫苗毒在雞體中傳代進(jìn)化形成。Wang 等的研究表明基因組的累積突變能引起抗原的變異，從而導(dǎo)致免疫失敗的情況出現(xiàn)[11]。疫苗的廣泛使用使得疫苗病毒株長期存在于雞場中，部分雞群由于免疫力低下，使得病毒在免疫壓力下部分氨基酸發(fā)生改變以逃避宿主的免疫清除機(jī)制，從而造成新病毒株的分離。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，開發(fā)出免疫保護(hù)率高、安全性好、成本低廉并且適于商業(yè)化生產(chǎn)的活載體疫苗或亞單位疫苗是未來IB 疫苗研究的趨勢[12-13]。本研究了解了IBV 的遺傳變異規(guī)律，為制定有效的免疫預(yù)防措施提供了實驗依據(jù)。

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